Extracción y fraccionamiento de lípidos del cerebro - Prácticas - Metodología y experimentación bioquímicas - Bioquímica, Ejercicios de Bioquímica . University of Alcalá

Bioquímica

Descripción: Práctica de bioquímica. Metodología y experimentación bioquímicas. Ejercitaciones y ejercicios. Extracción y fraccionamiento de lípidos del cerebro.
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Universidad: University of Alcalá
Subject: Bioquímica
Fecha de la carga: 09/11/2012
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Luz_Mariana.Luque - Universidad de Tarapacá

DOCUMENTO CON INFORMACION PRACTICA NECESARIA PARA UN LAB.

10/04/16 21:49

CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

BIOQUÍMICA II

LABORATORIO

PRACTICA:

EXTRACCIÓN Y FRACCIONAMIENTO DE LÍPIDOS DEL CEREBRO

ALUMNO:

GRUPO

BCO5

03 − JUN− 2002

INTRODUCCIÓN

Cerebro, parte constitutiva del encéfalo, el cual a su vez es la porción del sistema nervioso central de los vertebrados contenida dentro del cráneo. El cerebro está en íntima relación con el resto de las partes del encéfalo, esto es, cerebelo y tronco cerebral. El cerebro en la especie humana pesa 1,3 kg y es una masa de tejido gris−rosáceo compuesto por unos 100.000 millones de células nerviosas o neuronas, conectadas unas con otras y responsables del control de todas las funciones mentales. Además de las neuronas, el cerebro contiene células de la glía o neuroglia (células de soporte), vasos sanguíneos y órganos secretores (véase Neurofisiología). El cerebro es el centro de control del movimiento, del sueño, del hambre, de la sed y de casi todas las actividades vitales necesarias para la supervivencia. Todas las emociones humanas, como el amor, el odio, el miedo, la ira, la alegría y la tristeza, están controladas por el cerebro. También se encarga de recibir e interpretar las innumerables señales que se envían desde el organismo y el exterior.

El cerebro se origina a partir del prosencéfalo o cerebro anterior, que después, en una nueva división, dará lugar al telencéfalo y al diencéfalo.

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El telencéfalo está constituido principalmente por los hemisferios cerebrales (corteza cerebral y ganglios basales). Los hemisferios cerebrales ocupan la mayor parte del cerebro humano y suponen cerca del 85% del peso cerebral. Su gran superficie y su complejo desarrollo justifican el nivel superior de inteligencia del hombre si se compara con el de otros animales. Los hemisferios cerebrales están divididos por una fisura longitudinal en una parte derecha y otra izquierda, los hemisferios cerebrales izquierdo y derecho, que son simétricos, como una imagen vista en un espejo. El cuerpo calloso es un conglomerado de fibras nerviosas blancas que conectan estos dos hemisferios y transfieren información de uno a otro.

La corteza cerebral presenta una capa superficial denominada sustancia gris, de unos 2 o 3 mm de espesor, compuesta por capas de células amielínicas (sin vaina de mielina que las recubre) que cubren una sustancia interior de fibras mielínicas (con vaina blanca) denominada sustancia blanca. Las fibras mielínicas unen la corteza cerebral con otras partes del cerebro: la parte anterior del cerebro con la posterior, las diferentes zonas de la misma cara de la corteza cerebral y un lado del cerebro con el otro.

Los hemisferios cerebrales están divididos por una serie de cisuras en cinco lóbulos. Cuatro de los lóbulos se denominan así por los huesos del cráneo que los cubren: frontal, parietal, temporal y occipital. El quinto lóbulo, la ínsula, no es visible desde fuera del cerebro y está localizado en el fondo de la cisura de Silvio. Los lóbulos frontal y parietal están situados delante y detrás, respectivamente, de la cisura de Rolando; la cisura parieto−occipital separa el lóbulo parietal del occipital; y el lóbulo temporal se encuentra por debajo de la cisura de Silvio.

BIOQUÍMICA

Los componentes típicos del sistema nervioso (cerebro) son los lípidos, que están contenidos principalmente en los cilindroejes de los nervios. La sustancia blanca contiene proporcionalmente más lípidos que la gris. El contenido total alcanza del 12 al 15% del peso fresco, aproximadamente la mitad del peso seco. Para los distintos grupos de lípidos se han obtenido los siguientes valores (tanto por ciento del peso en fresco):

Fosfátidos 6%• Cerebrósidos 2%• Esteroles 4% (sustancia blanca: 9%, 4%, 1−2%, respectivamente)• Sustancia gris: 4%, 1%, 1−2%, respectivamente.•

La vaina de mielina de los nervios es birrefringente. Se supone que esta formada por capas coaxiales de proteínas y lípidos, y de tal manera, que siempre entre dos capas de proteínas esta intercalada una laminilla bimolecular de lípidos.

La neuroglia, o tejido de sostén del tejido nervioso, contiene una proteína esencial, la neuroqueratina. Probablemente esta es también un componente de las propias células nerviosas (dendritas y cilindroejes). Es igual a la queratina, si bien la proporción de aminoácidos básicos es algo diferente. (El parentesco químico con la queratina es interesante porque las células de neuroglia son también de origen ectodérmico).

El colesterol es quizá el esteroide mejor conocido debido a su relación con la arteriosclerosis. Se encuentra

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ampliamente distribuido en todas las células del organismo, pero especialmente en las del tejido nervioso. Es el constituyente de mayor importancia en las membranas celulares y de las lipoproteínas plasmáticas. A menudo se encuentra combinado con ácidos grasos como ester de colesterico. Existen en las grasas animales pero no es las vegetales. El nombre químico es 3−hidroxi−5,6 colesteno. El colesterol también es identificado como un grupo principal de lipoproteínas para transportar a los lípidos en el plasma. Aproximadamente la mitad del colesterol del organismo se origina de su síntesis y el resto es proporcionado por una alimentación promedio. El hígado sintetiza más o menos 10% del total en los seres humanos, el intestino cerca de 15% y la piel una gran porción del resto. Prácticamente los tejidos que contienen células nucleadas son capaces de sintetizar colesterol. La fracción microsomica y el citosol son responsables de su síntesis.

Los fosfolípidos son lípidos complejos, un lípidos que contiene además de ácidos grasos y un alcohol, un residuo de ácido fosfórico, con frecuencia tiene bases nitrogenadas y otros sustituyentes.

Glicerofosfolípidos: el alcohol es el glicerol

Esfingofosfolípidos: el alcohol es la esfingosina.

Los fosfolípidos son los principales constituyentes lipidicos de la membranas. El ácido fosfatidico es muy importante como intermedio en la síntesis de triacilgliceroles y fosfolípidos. Los lípidos son transportados en el plasma como lipoproteínas y un grupo identificado como tal es el grupo de los fosfolípidos. Tanto los fosfolípidos como la apolipoproteina C−III se requieren como cofactores para la actividad de la lipoproteína lipasa. La apolipoproteina C−II contiene un sitio específico de fijación de fosfolípido a través del cual se adhiere a la lipoproteína.

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Fosfatidilcolina

Los glucolípidos, son lípidos complejos, líquidos que contienen un ácido graso, esfingosina y carbohidratos. Los glucolípidos están distribuidos ampliamente cada tejido del cuerpo, en particular en el tejido nervioso (como el cerebro). En especial se encuentran en la capa externa de la membrana plasmática donde forman parte de los carbohidratos de la superficie celular.

Los glucolípidos principales en tejidos animales son los glucoesfingolípidos; contienen ceramida y uno o más azucares. Los dos más sencillos son la galactosilceramida y glucosilceramida. La galactosilceramida es un glucoesfingolípido mayoritario del cerebro y otros tejidos nerviosos y bajo en el resto del cuerpo; contiene cierto numero de ácidos grasos C24 característicos.

La glucosilceramida es el glucoesfingolípido sencillo predominante en los tejidos extraneurales, pero también existen en el cerebro en cantidades pequeñas.

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OBJETIVOS

Trataremos de obtener la totalidad de los lípidos de cerebro y fraccionarlos de acuerdo a su solubilidad en diferentes solventes orgánicos.

MATERIAL

1 vaso de precipitado de 250 ml

5 pipetas graduadas de 10 ml

3 pipetas Pasteur

2 tubos de centrifuga

1 varilla de vidrio

parrilla

centrifuga

3 frascos de 20 ml

Biologico

1 cerebro de pollo (2.5 gramos)

Reactivos

5

Acetona

Éter

Etanol 95%

METODOLOGÍA

Se pesan los frascos, etiquetándolos como fracción 1 a la 3. Solo pesaremos en papel aluminio 2.5 gramos de cerebro, este se picara y se colocara en un tubo de centrífuga, adicionándole acetona, 1ml por cada 0.5 g. de cerebro, se homogeniza el tejido por 1 minuto y sé centrífuga a 3000 rpm. Se decanta el SN en el frasco fracción I, y al residuo se le añadirá 2 ml de acetona y se homogeniza nuevamente, se centrífuga y se vuelve a colocar el SN con la fracción I, (fracción I es colesterol).

Por 5 minutos se dejara el residuo a temperatura ambiente para evaporar la acetona. Se adicionan 3 ml de éter al residuo, esto sé centrífuga por 2 minutos a 3000 rpm; el SN se colecta en otro tubo de centrífuga con la leyenda fracción A, esto contiene fosfolípidos, nuevamente se hará otra extracción con éter y se junta el SN en la fracción A. Ahora quitaremos los residuos de éter dejando que le dé un poco de aire, entonces se adicionaran 3 ml de etanol al 95% caliente (70°), agitando y después centrifugando (2 min. a 3000 rpm), el SN se colecta en el frasco de la Fracción III, la cual son glucolípidos, y se hará otra vez la extracción con 3 ml de etanol.

Calcularemos el volumen de la fracción A y agregaremos 2 volúmenes de acetona, homogenizamos y centrifugamos (mismo tiempo y rpm); el SN se colocara con la Fracción I; al residuo se adiciona 3 ml de éter y agitarlo 4 minutos y después centrifugamos, el SN se colocara en el frasco de la Fracción II (fosfolípidos), esta extracción se repetirá dos veces mas y los SN van al mismo lugar.

En cada frasco se colocaran dos perlas de ebullición y se evaporara a sequedad todos los frascos sobre la parrilla, no deben quemarse los residuos. Por ultimo se pesaran los frascos nuevamente y calcularemos la cantidad obtenida de cada fracción

RESULTADOS.

En este momento se calculara el porcentaje de cada una de las fracciones. Tomando los datos que obtuvimos al pesar los frascos como lo indica la tabla:

Tabla 1.

Peso inicial del frasco

Peso final del frasco

Rendimiento (grs)

Fracción I

(Colesterol) 73.45 74.07 0.62

Fracción II

(Fosfolípidos) 73.05 73.32 0.27

Fracción III

(Glucolípidos) 73.46 73.52 0.06

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Ya que tenemos el rendimiento en gramos, ahora podemos obtener el rendimiento porcentual de cada fracción en una muestra de 2.5 g. de cerebro.

Ahora para hacer la comparación del porcentaje teórico con los resultados obtenidos, convertiremos los porcentajes teóricos a gramos. Utilizando la media del porcentaje teórico total de lípidos en el cerebro (12 al 15%).

Colesterol = 4% Fosfolípidos = 6% Glucolípidos = 2%

Tabla 2.

Fracción

Valor

Teórico

Rendimiento

(grs)

Rendimiento

(%)

Colesterol (Fracción I) 0.54 g 0.62 24.8

Fosfolípidos (Fracción II)

0.81 g 0.27 10.8

Glucolípidos (Fracción III)

0.27 g 0.06 2.4

Como se puede observar en la tabla 2, el contenido de los diversos lípidos varia en un cierto rango, es por eso que se necesita sacar el promedio del contenido y sumar lo que se localiza también en la materia gris como en la blanca, dado que en la obtención se utilizaron ambas. Los valores teóricos de la tabla 2 son solo promedios de la variación en el contenido de los mismos, por lo que el resultado del colesterol se encuentra dentro del rango aunque el porcentaje parece que excede el contenido propio.

DISCUSIÓN.

IMPORTENTE: Se tiene que tomar en cuenta que el valor teórico es un promedio de entre 12% a 15% del peso fresco del cerebro.

Durante la práctica se determinaron tres tipos de lípidos, colesterol, fosfolípidos y glucolípidos. Se pudo observar que las concentraciones varían de un compuesto a otro, debido al porcentaje que se encuentra en el cerebro y pudiera ser también debido a que pudieron quedar pequeños errores en la extracción, por lo que no se obtiene el valor exacto con respecto a la bibliografía.

El procedimiento de estimación de la grasa por extracción de la materia de origen con un disolvente, la evaporación de este y la determinación gravimetriílla del residuo es uno de los métodos más antiguos de extracción.

La propiedad de solubilidad de los lípidos en compuestos orgánicos puede ser aprovechado como un método de extracción de estos a partir de tejidos de origen animal.

CONCLUSIÓN.

La solubilidad de los lípidos en compuestos orgánicos se aprovecha en la extracción de lípidos de cerebro de pollo debido a que estos son apolares y se pueden extraer de las membranas con disolventes de la misma naturaleza esto es con disolventes apolares como los utilizados en la practica ya que estos al calentarlos reaccionan disolviendo mejor el ácido graso y después se evapora más rápido el disolvente dejando solo el ácido graso.

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De acuerdo con los resultados de este experimento y el parámetro dado en la bibliografía, puede decirse que la obtención de nuestro producto es aceptable ya que presenta un poco de dificultad al extraer lípidos de dicho cerebro de pollo ya que existe una interacción con proteínas también contenidas la cual imposibilita el 100% de extracción y también del experimento ( podemos agregar que no se verifico la pureza de los solventes) ya que se utilizo el solvente correcto para cada sustancia como lo es el etanol para la extracción de glucolípidos, la acetona para el colesterol y el éter comenzando la extracción y la acetona para los fosfolípidos. Se agrega un comentario para mejorar la manera de analizar las mezclas de ácidos grasos es por medio de la técnica de cromatografía liquido − gaseosa en columna. El primer paso es convertirlos a ésteres en una columna caliente formada por un tubo en espiral. Este tubo se empaca con un material cubierto por una sustancia liquida. Al inyectar, esta se vaporiza y se mezcla con un gas inerte. Luego, al aplicar la mezcla de gases pasa a través de la columna y las sustancias se separan debido a sus diferentes solubilidades en la fase líquida estacionaria.

Como la fase líquida esta caliente, las sustancias se reevaporan continuamente para volver a mezclarse con la fase gaseosa en movimiento. El gas que sale de la columna ingresa a un aparato que detecta y registra la presencia y cantidad de sustancias en cada zona. Único requisito para poder utilizar la cromatografía para el análisis de cualquier tipo de material no polimérico es la volatilidad.

CUESTIONARIO

Durante la extracción de los lípidos, ¿que ocurrió con las proteínas del tejido?. Explique.Haga una lista de disolventes orgánicos en orden de polaridad.

En la siguiente tabla se proporcionan las constantes dieléctricas de algunos disolventes comunes.

Tabla 3.

Aumento

en la

polaridad del

disolvente

DISOLVENTE FORMULA CONSTANTE DIELECTRICA

Agua H2O 80

Acido fórmico

O

||

HCOH

59

Dimetil sulfóxido (DMSO)

O

||

CH3SCH3

49

N, N−dimetilformamida (DMF)

O

||

HCN(CH3)2

37

Acetonitrilo CH3C=N 36

Metanol CH3OH 33

Triamida [(CH3)2N]3P=O 30

Hexametilfosfórica (HMPT)

Etanol CH3CH2OH 24

8

Acetona

O

||

CH3CCH3

21

Amoniaco 16.9

Acido Acetico

O

||

CH3COH

6

Cloroformo 4.8

Eter dietilico 4.3

Benceno 2.3

Tetracloruro de carbono 2.2

Hexano 1.9

La constante dieléctrica es una medida de la capacidad del disolvente para aislar a las cargas opuestas una de otra. Las atracciones y repulsiones electrostáticas entre los iones son mas pequeñas en los disolventes con constantes dieléctricas mayores.

El agua es el disolvente mas efectivo para promover la ionización, pero la mayoría de los compuestos orgánicos no se disuelven en forma apreciable en agua, casi siempre se disuelven en alcoholes, y a menudo se utilizan disolventes mezclados. Metanol−agua y etanol−agua son mezclas comunes de disolventes para las reacciones se sustitución nucleófila.

De sus fracciones obtenidas ¿Cuál es la de mayor polaridad y cual la de menor polaridad?

Para la extracción utilizamos acetona, eter y etanol, siendo el disolvente mas polar el etanol seguido de la acetona y por ultimo el menos polar, eter. En la tabla 3 se ven los valores de su respectiva constante dielectrica.

Por tanto la Fracción 3 de glucolípidos es la mas polar, enseguida la Fracción 1 de colesterol y la Fracción 2 de eter, es la menos polar.

¿Qué otro tipo de moléculas lipidicas se deben encontrar en el tejido cerebral?

Los lípidos del cerebro han sido objeto de estudios intensivos y se ha podido saber mas acerca de estos gracias a tecnicas como la cromatografía. Gracias a estos metodos es posible determinar la composición de lípidos con mas precision y descubrir ademas, componentes secundarios.

El analisis de lípidos se representa en porcentajes molares, de manera que la composición de lípidos de un tejido puede compararse directamente con la de otro. Se estudiaron acidos grasos de los lípidos del lóbulo frontal incluidos en el cuadro.

Tabla 4. Naturaleza de lípidos de los acidos grasos en el cerebro.

Porcentaje de acidos grasos poliinsaturados en: Porcentaje de acidos grasos con cadenas de mas de 18 atomos de carbono en:

Tejido Glicerofosfátidos Glicerofosfátidos Glicerofosfátidos Esfingomielina Cerebrósido Sulfato de

9

de etanolamina de serina de colina cerebrósodo

Sustancia gris

Sustancia blanca

Mielina

46.9

13.9

12.9

53.0

23.5

11.5

sujeto: 10 meses

9.1

3.5

1.0

2.7

20.3

23.6

9.4

70.1

80.1

16.1

71.2

−−−

Sustancia gris

Sustancia blanca

Mielina

41.2

24.9

5.7

36.0

9.0

2.4

sujeto: 6 años

9.5

2.6

indicios

5.8

50.4

54.2

15.0

65.7

86.5

34.0

88.3

90.0

Sustancia gris

Sustancia blanca

Mielina

28.4

23.7

17.4

25.1

12.5

9.0

sujeto: 9 años

7.9

4.3

3.7

7.9

42.8

46.0

34.7

85.1

87.1

32.5

85.6

89.4

Sustancia gris

Sustancia blanca

Mielina

41.0

15.5

4.1

48.5

14.9

4.4

sujeto: 55 años

7.6

2.1

0.4

25.5

63.2

59.8

90.2

86.4

87.5

90.0

82.1

86.0

BIBLIOGRAFIA

Stevens, Alan, Texto y Atlas de Histología. editorial Mosby/Doyma Libros, 1995.

Mathews y Van Holde. Bioquímica. Edit. McGraw Hill− Interamericana, 2a. edición, 2001.

Staunton, W., Bioquímica medica. editorial Interamericana, 1969.

Voet, D. y Voet, J., Bioquímica. Omega, España, 1992.

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