Exercices de complémentation de fragments protéiques, Exercices de Chimie Appliquée
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Melissa_s29 January 2014

Exercices de complémentation de fragments protéiques, Exercices de Chimie Appliquée

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Exercices de chimie sur la complémentation de fragments protéiques. Les principaux thèmes abordés sont les suivants: Le récepteur à l'EGF, Les spectres d'absorption et d'émission, Analyse des résultats.
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TD 1 MEC

TD 1 MEC

TD 1 : Complémentation de fragments protéiques I. D'après Blakely et al. 2000, Nature Biotech18, 218 Le récepteur à l'EGF (Epidermal Growth Factor) est un récepteur transmembranaire. La liaison de son ligand provoque son homodimérisation, ce qui conduit à son autophosphorylation et stimule fortement son activité tyrosine kinase. La méthode décrite ici permet le suivi de la dimérisation du récepteur en réponse à la liaison du ligand dans les cellules de mammifères vivantes. Le principe et des résultats sont montrés dans la figure suivante.

Figure 1. EGF receptor dimerization monitored using β-gal complementation. (A) Two weakly complementing deletion mutants of β-gal linked to the extracellular and transmembrane domains of the EGF receptor to determine whether receptor dimerization, which is stabilized by the addition of EGF, can drive β-gal complementation. (B) The human EGF receptor (EGFR) extracellular and transmembrane domains cloned 5′ to and in frame with the E. coli lacZ deletion mutants ∆α and ∆ω in retroviral vectors expressing neomycin or hygromycin resistance, respectively. (E) β-gal activity in a population of C2C12 cells expressing both chimeric receptors and treated with EGF for 2 h (red curve). Untreated cells are shown by the black curve. Des cellules C2C12 sont infectées par les vecteurs rétroviraux décrits en Figure 1B. Après sélection des cellules résistantes à la néomycine et à l'hygromycine, l'activité β- galactosidase des cellules est mesurée au FACS après ajout d'un réactif qui devient fluorescent quand il est métabolisé par cet enzyme. I.1. Décrire les vecteurs utilisés (Figure 1B). Que représentent les cellules résistantes à la néomycine et à l'hygromycine? I.2. Comment mesure-t-on une activité β-galactosidase au FACS? I.3. Interpréter la Figure 1E. I.4. Quels contrôles faudrait il effectuer avant de pouvoir conclure que l'activité β- galactosidase mesurée dans les cellules est un reflet de la dimérisation du récepteur à l'EGF? I.5. Quel est l'intérêt de cette méthode d'étude de la dimérisation? II. D'après Hu et Kerppola 2003, Nature Biotech21, 539 La première protéine fluorescente utilisée de façon large en biologie a été la GFP (Green Fluorescent Protein). Il s'agit d'une petite protéine (20 kDa environ), qui adopte

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spontanément une conformation dans laquelle elle a des propriétés de fluorescence (absorption d'énergie lumineuse d'une certaine longueur d'onde, et émission de lumière à une longueur d'onde supérieure). Son maximum d'émission est dans le vert ; des dérivés de la GFP (qui dérivent de la GFP par quelques mutations ponctuelles) ont des spectres d'absorption et d'émission différents, avec des maxima d'émission dans le rouge (RFP), le jaune (YFP), le bleu-cyan (CFP) et le bleu (BFP). Dans un précédent article, les auteurs de l'article analysé ici avaient analysé les propriétés de fluorescence de deux fragments complémentaires de la YFP. Ils avaient montré que, ni le fragment N-terminal, ni le fragment C-terminal de la YFP n'étaient fluorescents ; cependant, quand ces deux fragments étaient exprimés en fusion avec deux protéines capables d'interagir, l'interaction de ces protéines rapprochait les deux fragments de la YFP, ce qui recréait une protéine douée des mêmes propriétés de fluorescence que la YFP ; il s'agit donc de complémentation de fragments de protéines fluorescentes. Dans cet article, les auteurs ont construit des vecteurs permettant l'expression de fusions entre différents fragments de quatre protéines fluorescentes (GFP, YFP, CFP, BFP), avec, soit le domaine bZIP de Fos (bFos), soit le domaine bZIP de jun (bJun) ; ces deux domaines interagissent. Ces vecteurs ont été transfectés par paires, et la fluorescence des cellules transfectées a été analysée. Les résultats sont donnés en Figure 1 pour quelques paires.

Figure 1. Visualization of complementation between fragments of different fluorescent proteins fused to bFos and bJun. (A) Diagram of amino acid substitutions among enhanced green fluorescent protein variants and the positions where they were fragmented (155 and 173). (B−K) Fluorescence images of COS-1 cells transfected with plasmids expressing the protein fragments indicated in each panel fused to the bZIP domains of Fos and Jun. The C-terminal fragments were fused to bFos and the N-terminal fragments were fused to bJun. Structural models of the bimolecular fluorescent complexes shown to the right of each image are based on the X-ray crystal structure of full-length GFP10. The positions of fragmentation are indicated by arrows in the structures. The position and structure of the duplicated - strand shown in H−J is unknown. The excitation/emission maxima of each complex are shown below the images. The bar represents 10nm in all images.

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Les spectres d'absorption (Figure 2A) et d'émission (Figure 2B) de plusieurs combinaisons ont été déterminés

Figure 2. Excitation and emission spectra of cells expressing fragments of different fluorescent proteins fused to bFos and bJun. Solid lines correspond to bimolecular fluorescent complexes and dashed lines to intact fluorescent proteins. (A) The excitation spectra were collected by measuring emissions at 535 nm through a 530 nm long-pass filter, and were normalized by the ratio between the emission maximum of each complex and the emission intensity at 535 nm. (B) The emission spectra of YN173-YC173 and YFP were collected through a 500 nm long-pass filter using excitation at 480 nm and the other emission spectra were collected through a 450 nm long-pass filter using excitation at 430 nm; the spectra were normalized on the basis of the ratio between the excitation maximum of each complex and the excitation efficiencies at 480 nm and 430 nm, respectively. The cells were transfected with 0.5 g of the plasmids encoding the fluorescent protein fragments fused to bFos and bJun or with 0.05 g of the plasmids encoding the full-length proteins. II.1. Analysez ces résultats. Quel contrôle proposeriez vous afin de s'assurer que les propriétés de fluorescence observées nécessitent l'association entre bJun et bFos? Les auteurs ont effectué les expériences montrées en Figure 3, 4, 5. Dans la figure 5, notez que, dans certains cas, la protéine Jun pleine longueur (Jun), et non seulement son domaine bZIP (bJun), est exprimé en fusion avec un fragment de protéine fluorescente.

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Figure 3. (gauche) Effects of a deletion in the leucine zipper on the efficiencies of complementation between fragments of different fluorescent proteins fused to the bZIP domains of Fos and Jun. The efficiencies of fluorescence complementation were determined in individual cells by measuring the ratio between the fluorescence emissions of the bimolecular fluorescent complex and that of a coexpressed intact fluorescent protein. Plasmids encoding the proteins indicated in each panel were transfected into cells (0.25 g of each fusion protein and 0.025 g of the ECFP or EYFP internal control) and the ratio of fluorescence emissions produced by the bimolecular complex and the internal control (Y/C or C/Y) was measured. Note the logarithmic scaling of the categories in the histograms. Figure 4. (milieu) Comparison of the efficiencies of bimolecular complex formation by fragments of different fluorescent proteins fused to bFos and bJun. We examined the competition between different ratios of bJun fused to fragments of different fluorescent proteins for a limiting concentration of bFos fused to the complementary fragment. (A) The indicated ratios of GN173 and CN173 fused to bJun were mixed with a fixed concentration of YC173 fused to bFos. The excitation spectra were collected after 12 h by measuring emissions at 530 nm. (B) The indicated ratios of YN173 and CN173 fused to bJun were mixed with a fixed concentration of YC173 fused to bFos. The emission spectra were collected after 12 h during excitation at 450 nm. Figure 5. (droite) Multicolor BiFC analysis of the subcellular sites of interactions between different proteins in the same cell. (A) Colocalization of bJunCN173-bFosYC173 and bJunYN173-bFosYC173 bimolecular fluorescent complexes. (B) Differential localization of bJunCN173-bFosYC155 and JunYN155-bFosYC55 complexes. Plasmids encoding the proteins indicated below the images were cotransfected into COS-1 cells. The images show the fluorescence emissions of the same cell using a 436 nm and 470 nm 'C' filter or a 500 nm and 530 nm 'Y' filter. The bar represents 10 nm in all images. II.2. Analysez ces résultats Le domaine bZIP de Jun est capable d'interagir, non seulement avec bFos, mais également avec bATF2 et avec lui-même. Les auteurs ont étudié la compétition entre bFos, bATF2, et bJun pour la formation d'un complexe avec bJun par complémentation de fluorescence (Figure 6)

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Figure 6. Multicolor BiFC analysis of the competition between alternative interaction partners in cells. Two combinations of interaction partners producing bimolecular complexes with different spectra were transfected into different cell populations (cyan and yellow bars) or cotransfected into the same cell population (green bars) as indicated above each graph. The ratio between the fluorescence emissions corresponding to each complex (Y/(C + Y)) was determined in individual cells in each population, and was plotted in the histograms. (A) Competition between bFosCN173 and bATF2YN155 for dimerization with bJunCC155. (B) Competition between bFosYN155 and bATF2CN173 for dimerization with bJunCC155. (C) Competition between bFosYN155 and bJunCN173 for dimerization with bJunCC155. Plasmids encoding the proteins indicated in each panel were cotransfected into cells. The plasmid encoding the shared interaction partner fused to CC155 was used at limiting concentration (0.1 g), whereas the other plasmids were used at a higher concentration (0.5 µg). The fluorescence intensities of individual cells were quantified using a 436 nm/470 nm 'C' filter and a 500 nm/535 nm 'Y' filter and the Y/(Y + C) ratios were plotted in the histograms. II.3. Analysez ces résultats

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