Exercices de transfert de fluorescence, Exercices de Chimie Appliquée
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Melissa_s29 January 2014

Exercices de transfert de fluorescence, Exercices de Chimie Appliquée

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Exercices de chimie sur le transfert de fluorescence. Les principaux thèmes abordés sont les suivants: le facteur de transcription de levure, le principe du FRET, les figures.
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TD3MECB

TD 3 MEC

TD 3 : Transfert de fluorescence I. D’après Bhaumik et al 2004 Genes Dev18, 333

Gal4 est un facteur de transcription de levure (bien connu par son utilisation dans le système de double hybride). Gal4 stimule la transcription des gènes (tels que Gal1) sur les promoteurs desquels il se fixe, grâce à un domaine d’activation riche en acides aminés acides. Le mécanisme d’activation transcriptionnelle par Gal4 est largement inconnu. En particulier, un grand nombre de protéines sont capables d’interagir avec le domaine d’activation in vitro, dans des systèmes reconstitués faisans appel à des protéines recombinantes, mais l’identité des protéines qui interagissent réellement avec Gal4 dans la cellule reste méconnue.

Dans cet article, les auteurs analysent les interactions de Gal4 avec d’autres protéines dans un contexte cellulaire grâce à une technique de transfert de fluorescence (FRET, voir cours). Dans un premier temps, ils utilisent l’interaction déjà démontrée entre Gal4 et Gal80 pour développer le FRET (Figure 1).

Figure 1. Development of a FRET assay for detecting interactions with Gal4 in vivo. (A) Experimental strategy. Direct interaction between Gal4–ECFP and an EYFP-tagged protein (black) results in a peak of fluorescence emission at 525 nm and a concomitant reduction in donor (ECFP) emission. (B) Fluorescence emission spectra in yeast strains coexpressing Gal4–ECFP and Gal80–EYFP, or expressing Gal4–ECFP alone, Gal80–EYFP alone, or Gal4–ECFP and unfused EYFP expressed from the GAL80 promoter. (C) Fluorescence emission spectra in Gal4–ECFP/Gal80–EYFP cells in which the EYFP acceptor fluorophore was photobleached at 514 nm prior to excitation of the ECFP donor fluorophore with the 405-nm laser line. (PB) Photobleaching. I.1. Expliquez le principe du FRET, tel qu’il est exposé sur la Figure 1. Qu’est-ce que le « photobleaching » et pourquoi un photobleaching est il effectué en Figure 1C ? Un partenaire probable du domaine d’activation de Gal4 est le complexe SAGA, qui est composé de nombreuses sous-unités (voir Figure 2A). Des expériences de FRET ont été effectuées entre Gal4 et chacune des sous-unités de SAGA (Figure 2).

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Figure 2. Identification of the SAGA subunit that is contacted by Gal4. (A) Fluorescence emission spectra in yeast strains coexpressing Gal4–ECFP and one of the 14 SAGA subunits fused to EYFP. (B) FRET efficiency in yeast strains coexpressing Gal4–ECFP and Gal80–EYFP or one of the 14 SAGA subunits fused to EYFP. FRET efficiency (EFRET) was calculated using the formula EFRET = (Ipost − Ipre)/Ipost, where Ipre and Ipost are the fluorescence intensities of ECFP before and after photobleaching, respectively (see Materials and Methods for details). Spectra were recorded from three cells; the average FRET efficiency and standard deviation are shown. (C) Fluorescence emission spectra for all 14 Gal4–ECFP/SAGA subunit–EYFP strains following excitation of the EYFP acceptor fluorophore with the 488-nm laser line. (D) Growth of strains expressing SAGA subunit– EYFP fusions in dextrose (YPD) and galactose (YPG) media. (E) Analysis of PHO84 transcription in strains expressing SAGA–EYFP fusion proteins. Transcription was monitored by primer-extension analysis, quantitated, and presented as the percent PHO84 transcription relative to the untagged strain FY23. I.2. Analysez la Figure 2. En particulier, expliquez la fonction des contrôles qui sont effectués. Gal4 contrôle l’expression de gènes impliqués dans le catabolisme de ce nutriment, et est activé dans un milieu contenant du galactose. Le mécanisme d’activation a été analysé par FRET (Figure 3). I.3. Analysez la Figure 3

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Figure 3. (A) Fluorescence emission spectra in Gal4–ECFP/Tra1–EYFP cells at various time points following a shift from raffinose to galactose medium. (B) Kinetics of the Gal4–Tra1 interaction, monitored by FRET (data from A), and transcriptional induction of GAL1, monitored by primer- extension (Bhaumik and Green 2002; inset), following a shift from raffinose to galactose medium. (C) Fluorescence emission spectra in Gal4–ECFP/Gal80–EYFP cells in dextrose, raffinose, and galactose media. II. D’après Park et al 2004, J Biol Chem279, 24274 Les nucléosomes sont des complexes macromoléculaires impliqués dans la structuration de l’ADN. Chaque nucléosome est composé de 8 protéines histones (2 histones H2A, 2 histones H2B, 2 histones H3, 2 histones H4), autour desquelles s’enroule un fragment d’ADN de 147 pb de longueur, formant 1.65 tours. Les nucléosomes peuvent se former spontanément en solution à partir de ses composants purifiés. La dynamique de formation des nucléosomes a été étudiée par FRET. Dans ce but, deux fluorophores ont été utilisés, le CPM (longueur d’onde d’excitation 384 nm, d’émission 469 nm) et le FM (excitation 492 nm, émission 515 nm). Chacun de ces deux fluorophores a été lié de façon covalente, soit à l’une ou l’autre des extrémités (extrémité W ou C) du fragment d’ADN, soit à la thréonine 71 de l’histone H4, soit à la thréonine 112 de l’histone H2B. Différentes combinaisons donneur/accepteur de FRET ont été utilisées, elles sont données en tableau 1.

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La première combinaison (marquage des deux extrémités de l’ADN) a été utilisée dans l’expérience suivante. Le spectre d’émission après excitation à 385 nm a été mesuré, soit sur de l’ADN libre, soit sur de l’ADN en présence des histones composant le nucléosome (NCP), soit sur de l’ADN en présence des histones composant le nucléosome et d’une forte concentration saline qui dénature le nucléosome (unfolded NCP) (Figure 1).

FIG. 1. Both ends of nucleosomal DNA have been labeled with CPM and FM, respectively (fluorophore combination I, Table I). The excitation wavelength was set at 385 nm to monitor donor emission. Acceptor emission for folded NCP is observed at 520 nm. Free DNA, labeled identically (gray trace), and NCP in 1.5 M NaCl (black trace) are shown as controls. Note the absence of fluorescence acceptor emission at 520 nm in the two control samples. II.1. Interprétez la Figure 3 Des expériences d’ajout de concentrations croissantes de sel (NaCl) ont été effectuées (Figure 2).

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FIG. 2.A, normalized equilibrium dissociation curves (obtained by monitoring changes fluorescence donor emission upon donor excitation at 385 nm) are shown for major NCP. Curves are shown for the three fluorophore combination groups listed in Table I (indicated by black triangles, and gray and white squares, respectively for group I, II, and III). B, nucleosomes and DNA labeled with fluorescence donor only were analyzed over the same salt range. Black triangles, NCPs labeled with CPM on the 5_ ends of the DNA; gray squares, DNA labeled with CPM on its 5_ends; white squares, NCPs with CPM on histone H4. C, donor and acceptor emission for a nucleosome core particle from fluorophore combination I was monitored simultaneously in response to increased ionic strength. Excitation wavelength was set at 385 nm, and donor emission white circles) was monitored at 479 nm, whereas acceptor emission black squares) was monitored at 520 nm. II.2. Quel paramètre analyse-t-on par FRET dans cette expérience?

L’histone H2A.Z est un variant de H2A. Des nucléosomes (NCP) ont été constitués, soit avec l’histone H2A classique (Major NCP), soit avec H2A.Z (H2A.Z-NCP). La dissociation des nucléosomes par le sel a été mesurée par FRET (Figure 3).

FIG. 3.A, comparison of dissociation of major-NCP (white circles) and H2A.Z-NCP (black squares), by monitoring loss of FRET between the ends of the DNA (fluorophore combination I, Table I). The lower panel shows a least-square fit through the central part of the dissociation curve. B, as A, but here the loss of FRET between H4 and the DNA ends was monitored (combination II). C as A, but obtained by monitoring the loss of FRET between H4 and H2B upon increasing ionic strength.

II.3. Interprétez la figure 3

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