exercices sur la génétique de la levure 2, Exercices de Mathématiques Appliqués
Caroline_lez
Caroline_lez28 January 2014

exercices sur la génétique de la levure 2, Exercices de Mathématiques Appliqués

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Exercices de mathématiques sur la génétique de la levure 2 Les principaux thèmes abordés sont les suivants: exercices, le principe du crible, une étape supplémentaire.
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TD 7 : Génétique de la levure 2

TD 7 : Génétique de la levure 2 Exercice 1

Des chercheurs s'intéressant aux mécanismes du transport des ARNm ont entrepris une approche génétique chez la levure Saccharomyces cerivisiae pour identifier des gènes impliqués dans le transport des ARNm. Les auteurs ont traité des levures sauvages avec de l'EMS à une concentration de 3% pendant 1h30 à la température ambiante.

Après une préincubation à 37°C pendant 3 heures, les levures survivantes (estimées à 15% de la fraction initiale) ont été incubées pendant 1 heure en présence de S-2-aminoéthyl L-cystéine qui est un analogue toxique de la L-cystéine. Une incorporation importante de cet analogue entraîne la mort de la levure au bout d'une dizaine d'heures. Les levures ont été étalées sur des boites contenant du milieu complet et placées à 37°C. Les levures survivantes après une quinzaine d'heures d'incubation ont été repiquées sur des boites contenant du milieu complet et incubées à 23°C jusqu'à l'apparition de colonies. Ces boites ont servi à réaliser des répliques qui ont été placées à 23°C et 37°C. 10 colonies poussant à la température de 23°C mais pas à la température de 37°C ont été sélectionnées comme mutants thermosensibles (ts). 1. Expliquez le principe du crible mis en place par les chercheurs et ce qu'ils pensent identifier comme mutants avec un tel crible.

Chacun des 10 mutants ts sélectionnés a ensuite été étalé sur deux boites et cultivés à 23 °C, le temps qu'apparaissent des colonies. Une boite a été maintenue à 23°C et la deuxième a été placée à 37°C pendant 5 heures. Après fixation et perméabilisation les levures ont été incubées en présence d'oligo-dT (oligonucléotide composé de 18 thymidines consécutives) couplé à un fluorochrome et la fluorescence dans les levures a été visualisée. Les résultats sont donnés dans le tableau suivant.

FluorescenceFluorescence 25°C 37°C 25°C 37°C mutant 1 cytoplasmique nucléaire (aspect granulaire) mutant 6 cytoplasmique nucléaire (aspect taches) mutant 2 cytoplasmique cytoplasmique mutant 7 cytoplasmique nucléaire (aspect granulaire) mutant 3 cytoplasmique nucléaire (aspect granulaire) mutant 8 cytoplasmique nucléaire (aspect taches) mutant 4 cytoplasmique nucléaire aspect granulaire mutant 9 cytoplasmique cytoplasmique mutant 5 cytoplasmique cytoplasmique mutant 10 cytoplasmique cytoplasmique

Tableau 1 Localisation de la fluorescence dans les mutants M1 à M10 2. Quelle(s) information(s) a été apportée par cette étape supplémentaire?

Les mutants 1, 3, 4, 6, 7, 8 ont été retenus pour la suite de l'étude. Ils ont été

croisés selon les différentes combinaisons possibles. Les phénotypes des levures diploïdes ont été observés et sont donnés dans le tableau 2.

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mutant 1 mutant 3 mutant 4 mutant 6 mutant 7 mutant 8 mutant 1 mutant sauvage mutant mutant sauvage sauvage

mutant 3 mutant sauvage sauvage sauvage mutant mutant 4 mutant mutant sauvage sauvage mutant 6 mutant sauvage sauvage mutant 7 mutant sauvage mutant 8 mutant

Tableau 2 analyse des diploides produit par croisements des différents mutants

3. Que pouvez vous conclure de cette expérience? Les chercheurs ont également réalisé des croisements pour s'assurer que les

mutants isolés n'étaient affectés que sur un seul gène.

4. Indiquez les croisements réalisés et le résultat de cette analyse. Les auteurs se sont intéressés par la suite plus particulièrement au mutant M4. Ils ont réussi à cloner le gène correspondant par une stratégie de complémentation. 5. Décrivez la procédure utilisée par les chercheurs pour cloner le gène et s'assurer que le gène cloné correspond bien au gène initialement muté dans la souche M4. Exercice 2 (d'après Russel and Nurse, 1987, Cell 49, 559-567) Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, les cellules s'allongent pendant la phase G2, jusqu'à atteindre une taille critique à laquelle elles entrent en mitose. L'entrée en mitose est provoquée par l'activation de la protéine cdc2p. A température restrictive, une souche ayant une mutation thermosensible de cdc2 est incapable d'entrer en mitose : elle est bloquée en G2 et s'allonge. Parmi les nombreux régulateurs de la protéine cdc2, wee1p est une kinase inhibitrice de cdc2p, tandis que cdc25p est une phosphatase activatrice. Le phénotype de mutants perte de fonction de wee1 et cdc25 sera donc, respectivement, une petite taille (due à l'activation prématurée de cdc2p à chaque cycle. C'est le phénotype wee, "petit" en écossais) et une grande taille et une incapacité d'entrer en mitose (similaire au phénotype d'un mutant perte de fonction cdc2. C'est le phénotype cdc, cell division control).

La transformation d'une souche thermosensible cdc25-22 avec une banque génomique de S. pombe a permis d'identifier un gène suppresseur extragénique. Ce gène complémente de manière efficace la souche cdc25-22 à la température restrictive de 36°C. Le sauvetage du plasmide et son séquençage ont montré que ce gène ne correspondait pas à cdc25+ , il a été appelé nim1+.

Le gène nim1+ possède un cadre ouvert de lecture de 1110 nt et code une protéine de 370 AA. La comparaison de cette séquence déduite avec les protéines

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présentes dans les banques de données indique qu'elle appartient à la famille des protéines kinases.

Deux constructions ont été réalisées. 1. la phase codante du gène nim1+ a été placée en aval du promoteur fort adh

dans un plasmide d'intégration comportant le gène de sélection Leu2 pour donner le plasmide padhnim1+. Le gène Leu2 est un gène de S. Cerevisiae il permet de complémenter un mutant leu1-32 sans cependant pouvoir s'intégrer au locus leu1.

2. la phase codante du gène nim1+ a été interrompue par l'insertion du gène de sélection ura4+ et placée dans un vecteur d'intégration pour donner le plasmide pnim1::ura4+.

Le plasmide padhnim1+ a été introduit dans une souche leu1-32 ura4-d18

(mutations entraînant l'auxotrophie respectivement à la leucine et à l'uracile) et les levures prototrophes à la leucine ont été sélectionnées. Le plasmide pnim1::ura4+ a été introduit dans une souche diploïde ura4-d18/ura4-d18 h+/h-. Après sporulation les levures prototrophes à l'uracile ont été sélectionnées. Le croisement des levures adhnim1+ avec les levures nim1::ura4+ donne après sporulation 50 % de levures prototrophes pour la leucine et 50 % de levures prototrophes pour l'uracile mais pas de levures prototrophes pour la leucine et l'uracile.

Les effets de l'expression de nim1+ dans un environnement cdc25+ sont également donnés dans le tableau suivant.

génotype Longueur de la cellule au moment de la division sauvage 14,2 µm adh-nim1+ 7,2 µm nim1::ura4+ 18 µm

1. Expliquez à quelles fins ont été réalisées les deux constructions. Pourquoi la construction pnim::ura4+ a-t-elle été transformée dans un diploïde ? Pourquoi la souche nim1::ura4+ a-t-elle été croisée avec la souche adhnim1+ ? Quelles conclusions pouvez vous tirer de ces expériences ? Une souche diploïde cdc25::ura4+/cdc25+ leu1-32/leu1-32 ura4-d18/ura4-d18 h+/h- a été ensuite transformée avec le plasmide padhnim1+. Après sporulation les levures prototrophes à la leucine ont été sélectionnées. Parmi celles ci 50 % se sont avérées également prototrophes à l'uracile. 2. Quelle est la caractéristique de la souche diploïde utilisée et pourquoi les auteurs ont-ils utilisé une telle souche ? Que représentent les levures prototrophes à la leucine et à l'uracile ? Quelles conclusions pouvez vous tirer de cette expérience ?

Une souche thermosensible cdc2- a été transformée avec le plasmide padhnim+ et les cellules prototrophes pour la leucine ont été sélectionnées à 25°C et 36°C. Les phénotypes observés sont données dans le tableau suivant.

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longueur des cellules au moment de la division croissance à 25°C 7,4 µm croissance à 35°C arrêtées en G2 3. Quelle conclusion pouvez vous tirer de cette expérience ?

Une souche thermosensible wee1-50 [Leu2] a été croisée avec la souche nim1::ura4+ . Après sporulation les levures prototrophes pour l'uracile et la leucine ont été sélectionnées à 25°C et 36°C. Les phénotypes observés sont données dans le tableau suivant.

longueur des cellules au moment de la division

croissance à 25 °C 7,4 µm croissance à 35°C 7,4 µm

4. Quel est le génotype des levures sélectionnées ? Quelle conclusion pouvez vous tirer de cette expérience ?

La souche VG1 (adh-wee1-50 [ura4+] ura4-d18 leu1-32) dans laquelle le gène thermosensible wee1-50 a été placé sous le contrôle du promoteur fort adh a été transformée avec la construction padhnim1+. Les levures prototrophes pour la leucine et l'uracile ont été placées à 25°C et 36°C. Les longueurs des levures au moment de la division cellulaire sont données dans le tableau suivant.

VG1 VG1 + padhnim1+ croissance à 25°C arrêt du cycle 7 à 28 µm croissance à 36°C 14,2 µm 7,1 µm 5. Commentez ces résultats. Quelle conclusion pouvez vous en tirer?

Des levures wee1-50 adhcdc25+ et wee1-50 adhnim1+ ont été placées à 25°C et 36°C et leurs phénotypes observés. wee1-50 adhcdc25+ wee1-50 adhnim1+ croissance à 25°C wee wee croissance à 36°C catastrophe mitotique wee

létale 6. Interprétez ces résultats sachant qu'une levure adh cdc25+ présente un phénotype wee à 25°C et 36°C. 7. Proposer un modèle du contrôle de la mitose chez la levure S. pombe qui intègre la protéine nim1.

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