Appunti Di Biochimica (Scienze Motorie), Appunti di Biochimica. Libera Università Mediterranea Jean Monnet di Casamassima
Mimmo11
Mimmo1128 agosto 2010

Appunti Di Biochimica (Scienze Motorie), Appunti di Biochimica. Libera Università Mediterranea Jean Monnet di Casamassima

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appunti biochimica. Capitolo I: Introduzione al metabolismo pag. 1 1. Cenni elementari di termodinamica chimica 2. Catalizzatori ed enzimi 3. ATP: la principale fonte diretta di energia chimica nei processi biologici...
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CO2CO2

CO2

CO2 NADH+H +NADH+H +

NADH+H +

FADH 2

GTP

Acetil-CoAOssalacetato +

GLUCOSIO

PIRUVATO

ACIDI GRASSI

beta ossidazione

CO2CO2

CO2

CO2 NADH+H +NADH+H +

NADH+H +

FADH 2

GTP

Acetil-CoAOssalacetato +

GLUCOSIO

PIRUVATO

ACIDI GRASSI

beta ossidazione

Università degli Studi di Catania Corso di Laurea in Scienze Motorie

APPUNTI DI

BIOCHIMICA Prof. D.F. Condorelli

PREFAZIONE

La motivazione iniziale per la preparazione di questa raccolta di appunti è stata fornita da un ciclo di lezioni di Biochimica per il Corso di Laurea in Scienze Motorie che ho tenuto, ogni sabato mattina, nell’Anno accademico 2001-2002 presso il Polo Universitario di Enna. In quell’occasione il Dott. Mario Veca ha svolto il pesante compito di trasformare i propri appunti in una versione elettronica che potesse essere utilizzata dagli altri colleghi del corso. Sono particolarmente grato a Mario per la qualità e la costanza del suo lavoro che mi ha fatto sentire obbligato a partecipare con altrettanto impegno. In realtà, in quella fase, il mio compito è stato quello di correggere, integrare dove necessario, dare un organizzazione generale alla raccolta e renderla disponibile tramite il sito web dell’Università di Catania. Negli anni successivi la raccolta è stata messa a disposizione on line anche per gli studenti del Polo di Catania. La risposta positiva degli studenti e l’entusiasmo di un altro laureato in Scienze Motorie, la Dott.ssa Roberta Garozzo (docente di Educazione fisica e, attualmente, dottoranda di ricerca), che ha partecipato all’elaborazione di quest’ultima versione, sono stati gli elementi decisivi che mi hanno convinto a continuare questo lavoro. Roberta ha elaborato le formule chimiche con un software dedicato, ha controllato e sistemato le bozze che avevo preparato e completato il testo di alcuni capitoli, svolgendo le funzioni di co-autore. In ogni caso si è cercato sempre di mantenersi fedeli ai contenuti e allo spirito di un corso di lezioni di soli 4 crediti. Nonostante ciò la raccolta non è ancora completa e anche questa versione si deve considerare come una tappa intermedia. Alcuni appunti non sono stati trasformati in un formato utilizzabile (per esempio la descrizione ordinata degli eventi metabolici del ciclo-digiuno alimentazione) e la breve durata del corso di lezioni non ha consentito finora lo svolgimento di alcuni argomenti di grande importanza (meccanismi biochimici dell’espressione genica e loro regolazione, struttura molecolare del muscolo scheletrico, ecc.). Speriamo di poter integrare al più presto questi argomenti senza sovraccaricare di contenuti il corso. Bisogna precisare che il corso di Biochimica, che si tiene nel secondo semestre del I anno, è preceduto, nel primo semestre, da un corso di Chimica e propedeutica biochimica e da un corso di Biologia. Gli elementi fondamentali di chimica generale (legami chimici, cinetica chimica, reazioni di ossido-riduzione, equilibrio acido-base), di chimica organica (gruppi funzionali, zuccheri, lipidi, aminoacidi) e di propedeutica biochimica (catalisi enzimatica, struttura delle proteine e degli acidi nucleici) vengono esposti in questi corsi. Alcune nozioni fondamentali sono state introdotte in queste raccolta di appunti sotto forma di richiami. In alcuni capitoli sono state anche introdotte delle schede di approfondimento. I contenuti di queste schede non sono richiesti nella preparazione dello studente di Scienze Motorie. Si è ritenuto utile, tuttavia, aiutare chi avesse voluto affrontare una comprensione più approfondita fornendo una prima traccia per una visione più completa. Vorrei concludere ricordando agli studenti che questi appunti non sostituiscono nè il corso di lezioni nè il libro di testo. L’esposizione schematica non consente un apprendimento adeguato; inoltre, durante le lezioni, vengono svolti argomenti che non sono stati ancora riportati in forma di appunti.

INDICE Capitolo I: Introduzione al metabolismo pag. 1

1. Cenni elementari di termodinamica chimica 2. Catalizzatori ed enzimi 3. ATP: la principale fonte diretta di energia chimica nei processi biologici 4. Definizione di metabolismo 5. Le reazioni di ossido-riduzione 6. Struttura e funzioni del NAD 7. Struttura e funzioni del FAD 8. Meccanismi di sintesi dell’ATP

Capitolo II: Glicolisipag. 17

1. Definizione di zuccheri o glucidi 2. Il trasporto del glucosio attraverso le membrane cellulari 3. Glicolisi: fasi e reazioni 4. La glicolisi anaerobica e la riduzione del piruvato a lattato 5. Bilancio energetico della glicolisi 6. Schema riepilogativo della glicolisi

Capitolo III: Decarbossilazione ossidativa del piruvato e Ciclo di Krebspag. 36

1. Il mitocondrio 2. Destini metabolici del piruvato (nell’uomo) 3. Decarbossilazione ossidativa del piruvato 4. Il Coenzima A (CoA): struttura e funzione 5. Schema Generale del Ciclo di Krebs 6. Le 8 reazioni del Ciclo di Krebs 7. Bilancio energetico del ciclo di Krebs 8. Il significato catalitico del ciclo di Krebs 9. Convergenza delle principali vie metaboliche nel ciclo di Krebs

Capitolo IV: Catena di trasporto degli elettroni mitocondriale e fosforilazione ossidativa pag. 54

1. La riossidazione del NAD ridotto e la sintesi di ATP 2. Il potenziale di ossido-riduzione standard 3. I componenti della catena respiratoria 4. Il complesso II e gli altri punti di ingresso della catena respiratoria 5. La fosforilazione ossidativa e la teoria chemiosmotica 6. ATP sintasi o FoF1 ATPasi 7. Il rapporto P:O 8. Controllo respiratorio 9. Inibitori e disaccoppianti 10. Proteine disaccoppianti 11. Il genoma mitocondriale 12. La teoria dell’origine endosimbiotica dei mitocondri

Capitolo V: I radicali liberi pag. 74

1. Introduzione 2. Riduzione completa dell’ossigeno 3. Le forme parzialmente ridotte dell’ossigeno 4. Formazione dei radicali liberi nei mitocondri e negli eritrociti 5. Reazioni chimiche innescate dall’anione superossido nei tessuti: la

dismutazione, la reazione di Haber Weiss, la reazione di Fenton 6. Reazioni innescate dal radicale idrossile nelle membrane cellulari: la

lipoperossidazione 7. Sistemi di difesa enzimatici 8. La vitamina E 9. I radicali liberi nei processi infiammatori

Capitolo VI : Il glicogeno pag. 87

1. I polisaccaridi 2. L’ amido 3. Il glicogeno 4. I depositi di glucosio in forma di glicogeno e la pressione osmotica

intracellulare 5. Distribuzione tissutale del glicogeno e significato funzionale 6. Glicogenosintesi 7. Glicogenolisi 8. Schema riepilogativo

9. Regolazione della glicogenolisi 10. Schema del sistema dell’AMP ciclico e della cascata delle reazioni protein chinasiche nella regolazione della glicogenolisi 11. Le attività della glicogeno sintasi e della glicogeno fosforilasi sono regolate in modo speculare

Capitolo VII: La gluconeogenesi pag. 871. Definizione di gluconeogenesi epatica 2. Reazioni della gluconeogenesi 3. Bilancio energetico della gluconeogenesi da piruvato 4. Glucogenesi da lattato 5. Ciclo Lattato-Glucosio (Muscolo – Fegato, Eritrocita-Fegato) 6. Significato funzionale della gluconeogenesi durante il digiuno 7. Gluconeogenesi da glicerolo 8. Gluconeogenesi da aminoacidi e cenni sul catabolismo ossidativo degli

aminoacidi 9. Relazione fra gluconeogenesi e ciclo di Krebs negli epatociti 10. Aminoacidi essenziali

Capitolo VIII: Digestione, assorbimento e trasporto ematico dei lipidi pag. 124

1. Digestione dei lipidi 2. Assorbimento degli acidi grassi e dei trigliceridi 3. Il trasporto dei lipidi 4. Apporto alimentare, attività fisica e lipoproteine plasmatiche

Capitolo IX: Catabolismo lipidico: β-ossidazione degli acidi grassi e lipolisipag. 138

1. Gli acidi grassi 2. Attivazione degli acidi grassi 3. Il sistema della carnitina ed il trasporto mitocondriale degli acil-CoA 4. Le reazioni della β-ossidazione degli acidi grassi 5. Bilancio energetico della beta-ossidazione dell’acido palmitico 6. Catabolismo dei trigliceridi nel tessuto adiposo: la lipolisi

Scheda di approfondimento: perosisomi e β-ossidazione perossisomale

Capitolo X: Sintesi degli acidi grassi (lipogenesi) pag. 1511. Sintesi degli acidi grassi 2. Allungamento della catena dell’acido grasso 3. Desaturazione degli acidi grassi 4. Acidi grassi essenziali 5. Biosintesi dei trigliceridi 6. Funzione di riserva energetica dei trigliceridi 7. Distribuzione del grasso corporeo: grasso essenziale e grasso di deposito

Scheda di approfondimento:Biosintesi degli acidi grassi Capitolo XI: Metabolismo e funzione della creatina pag. 170

1. Struttura della creatina 2. Sintesi della creatina 3. Fosfocreatina 4. Tamponamento energetico temporale della fosfocreatina 5. Tamponamento energetico spaziale della fosfocreatina 6. Gli isoenzimi della creatina chinasi citosolica 7. Conversione della creatina in creatinina 8. Schema del metabolismo della creatina 9. Integrazione alimentare di creatina

Capitolo XII: Biochimica dell’esercizio fisico pag. 184

1. Le fonti energetiche della contrazione muscolare: meccanismi anaerobici alattacidi, meccanismi anaerobici lattacidi, meccanismi aerobici

2. Potenza, capacità e resa energetica delle vie metaboliche coinvolte nella sintesi di ATP

3. Equilibrio acido-base ed acido lattico 4. La famiglia dei trasportatori per i monocarbossilati (MonoCarboxylate

Transporter: MCT) 5. La produzione di lattato durante lo sforzo muscolare e la soglia anaerobica 6. La produzione di acido lattico nel singolo muscolo 7. Potenza e capacità lattacida 8. Debito di Ossigeno 9. Utilizzazione del lattato 10. Equivalente calorico degli alimenti 11. Il quoziente respiratorio

Richiami di Chimica generale: acidi e basi

OH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

COOH

CH3

C=O COOH

CH3

CHOH

!?!

!?! !?!

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Capitolo I

Introduzione al metabolismo

1) Cenni elementari di termodinamica chimica 2) Catalizzatori ed enzimi 3) ATP: la principale fonte diretta di energia chimica nei processi biologici 4) Definizione di metabolismo 5) Le reazioni di ossido-riduzione 6) Struttura e funzioni del NAD 7) Struttura e funzioni del FAD 8) Meccanismi di sintesi dell’ATP 1) Cenni elementari di termodinamica chimica Energia Libera: energia che può essere utilizzata per compiere un lavoro. In un processo a temperatura e pressione costante, una trasformazione è possibile solo se porta ad una diminuzione dell'energia libera del sistema in esame. Affinché una reazione chimica possa aver luogo l’energia libera (G) basale delle molecole che vanno incontro alla reazione (reagenti R) deve essere superiore a quella posseduta dalle molecole che si producono nella reazione (prodotti P). Come si calcola la variazione di ENERGIA LIBERA (G) di una reazione

G prodotti (P) – G reagenti (R) = G (variazione di energia libera)

GG(P) - G(R) =

G < 0 la reazione decorre spontaneamente da sinistra a destra ∆G = 0 la reazione è all’equilibrio (la quantità di R che si trasforma in P è uguale alla quantità di P che si trasforma in R nella stessa unità di tempo) ∆G > 0 la reazione decorre spontaneamente da destra a sinistra L’energia libera dei reagenti e dei prodotti dipende sia dalla loro struttura molecolare che dalle loro concentrazioni. Quando il ∆G viene calcolato a concentrazioni unitarie (1 molare) di reagenti e prodotti si parla di variazione di energia libera standard (G°). In biochimica si usa la variazione di energia libera standard a pH 7 (∆G°’). Ciascuna reazione chimica ha un caratteristico G°'. In biochimica i valori di ∆G° sono espressi in kcal per mole. La caloria, l'unità di energia più usata in biologia, è

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definita come la quantità di energia (calore) che può aumentare la temperatura di 1 g di acqua a 15°C di 1°C. Quando il ∆G° di una reazione è negativo la reazione è esoergonica o termodinamicamente spontanea o possibile, in quanto il raggiungimento del suo stato finale (prodotti) non richiede apporto di energia. Quando il ∆G° di una reazione è positivo la reazione è endoergonica, quindi termodinamicamente non spontanea, e necessita di apporto energetico per decorrere da sinistra a destra. Un elevato valore negativo di ∆ non fornisce, però, indicazioni sulla velocità di reazione. Una reazione può essere termodinamicamente spontanea (∆G° negativo), ma decorrere ad una velocità così lenta a temperatura corporea da essere incompatibile con i bisogni fisiologici. La velocità (cinetica chimica) di alcune reazioni termodinamicamente spontanee può essere così lenta da essere trascurabile rispetto alla durata della vita umana. Tali reazioni sono termodinamicamente possibili, ma cineticamente impossibili. Eppure tali reazioni decorrono nel nostro organismo a velocità elevata. Ciò è possibile grazie all’esistenza di catalizzatori biologici, detti enzimi, che accelerano la velocità delle reazioni. 2) Catalizzatori ed enzimi Nella reazione mostrata nel grafico seguente, l’energia libera dei prodotti (P) (indicata in ordinata) è più bassa dell’energia libera dei reagenti (R): la variazione di energia libera è dunque negativa (∆G<0) e la reazione è possibile dal punto di vista termodinamico. Tuttavia una seconda condizione da soddisfare per consentire il decorso di una reazione chimica è che le molecole reagenti raggiungano il livello energetico dello stato di transizione (vedi grafico). Definiamo energia di attivazione di una reazione la quantità di energia che bisogna fornire al sistema perché esso raggiunga il livello energetico dello stato di transizione (indicata come ∆G* in figura). Quanto più bassa è l’energia di attivazione, tanto maggiore sarà la probabilità che le molecole reagenti raggiungano il livello energetico dello stato di transizione e tanto maggiore sarà la velocità di reazione. Quindi la velocità di una reazione (numero di molecole trasformate nell’unità di tempo) dipende dal valore dell’energia di attivazione e non dal ∆G°. La maggior parte delle reazioni termodinamicamente possibili si svolge con estrema lentezza in quanto la maggior parte delle molecole reagenti non è in grado di raggiungere lo stato di transizione per carenza dell’energia necessaria. Un catalizzatore è in grado di accelerare una reazione chimica abbassando l’energia di attivazione (linea rossa nel grafico e ∆G* enz.).

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P

R

∆ G*

energia libera (G)

coordinata di reazione

−∆ G°'

∆ G*enz.

stato basale

stato di transizione

stato basale

reazione catalizzata

reazione non catalizzata

Un catalizzatore è un composto chimico che ha le seguenti proprietà: 1) accelera la velocità di una reazione chimica 2) nella reazione non compare né tra i reagenti né tra i prodotti 3) non viene consumato durante la reazione 4) non sposta l'equilibrio della reazione e non modifica il G. 5) è usato in quantità minime, non in quantità stechiometriche 6) agisce diminuendo l'energia di attivazione Gli enzimi sono dei catalizzatori biologici. Dal punto di vista strutturale sono delle proteine (anche se oggi conosciamo delle molecole di RNA ad attività catalitica, dette ribozimi). DEFINIZIONE DI ENZIMA: biocatalizzatore specifico di natura proteica Si denominano substrati le sostanze che vengono trasformate nella reazione enzimatica e prodotti della reazione quelle che si formano. Il meccanismo di azione degli enzimi è basato sulla formazione transitoria di legami con i substrati, cioè sulla formazione del cosiddetto complesso enzima-substrato.

E + S EPES E + P

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L’enzima entra nella reazione combinandosi con il substrato per formare il complesso ES. Questo si trasforma nel complesso EP che quindi si dissocia nel prodotto di reazione P rilasciando l’enzima E allo stato libero. Grazie a questo continuo riciclaggio gli enzimi sono attivi in piccolissime quantità. Il sito attivo, o sito catalitico, di un enzima è la regione della sua molecola che interagisce specificamente con il substrato. La specificità del sito attivo è stata simbolizzata dal concetto della “chiave-serratura”, che esprime l’adattamento perfetto del substrato al sito attivo. Attualmente si ritiene che tale adattamento non sia di tipo rigido, ma che il sito attivo si adatti al substrato mediante un cambiamento di conformazione che è indotto dal legame iniziale con il substrato stesso (teoria dell’adattamento indotto). Nomenclatura enzimatica. La denominazione degli enzimi viene fatta aggiungendo il suffisso –asi al nome che indica la reazione catalizzata; questo termine è preceduto dal nome del substrato. Esempio: lattato deidrogenasi. Gli enzimi sono stati raggruppati da una Commissione Internazionale in 6 classi: CLASSI AZIONE CATALITICA 1) ossidoreduttasi reazioni di ossido-riduzione 2) trasferasi trasferimento di gruppi atomici (es: transaminasi) 3) idrolasi rottura di legami per mezzo dell’acqua (esterasi-fosfatasi-proteasi) 4) liasi Rottura non idrolitica e formazione di legami covalenti (aldolasi) 5) isomerasi reazioni di isomerizzazione 6) ligasi formazione di legami accoppiati all’idrolisi dell’ATP (sintetasi e

carbossilasi) Isoenzimi Gli isoenzimi sono enzimi esistenti in forme molecolari diverse che tuttavia catalizzano la stessa reazione. Un tipico esempio è l’enzima lattato deidrogenasi di cui si parlerà in dettaglio nel capitoloII.

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3) ATP: la principale fonte diretta di energia chimica nei processi biologici. L’ATP è un nucleotide. In generale un nucleotide è formato da una base azotata eterociclica (purinica o pirimidinica), da uno zucchero (ribosio o deossiribosio) e da uno o più fosfati. Vengono detti nucleosidi i composti che si ottengono dall’unione (con legame N- glicosidico) tra la base azotata e il ribosio (ribonucleosidi) o il deossiribosio (deossiribonucleosidi). Gli esteri fosforici dei nucleosidi sono i nucleotidi. L’ ATP è formato da:

L’adenina e il ribosio formano l’adenosina, che è un nucleoside. L’adenosina più un fosfato forma una molecola di AMP (adenosin monofosfato) o acido adenilico. L’AMP può legare un altro fosfato diventando ADP (adenosin difosfato). Una molecola di ADP puo legare un altro fosfato diventando ATP (adenosin trifosfato).

N

N

N

N

NH2

O O

O O O

CH2

OHHO

O P O ~ P O ~ P

O O O

AMP

ADP

ATP

adenosina

adenina

ribosio

α β γ gruppi fosfato

ATP base azotata: ADENINA zucchero:

RIBOSIO

3 gruppi FOSFATO

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I tre fosfati dell’ATP vengono indicati con le lettere dell’alfabeto greco: alfa (quello legato al ribosio), beta e gamma gli altri due (beta il fosfato intermedio e gamma il fosfato terminale). Mentre il residuo fosforico alfa è legato al ribosio con legame estereo, i residui beta e gamma sono legati fra loro, e con l’alfa, mediante legami anidridici. Il legame tra il fosfato alfa ed il fosfato beta ed il legame tra il fosfato beta ed il fosfato gamma sono indicati con il simbolo ∼ (legame ad alta energia). Il distacco idrolitico dei fosfati beta e gamma libera 7,5 kcal per mole (mentre il distacco del fosfato alfa ne libera solo 3,5). L’ATP è un tipico esempio di un composto ad elevato contenuto energetico o ad alta energia. Possiamo dire che la reazione di distacco idrolitico del fosfato gamma dell’ATP decorre con una elevata variazione negativa di energia libera:

ATP + H2O ! ADP + Pi ∆G: - 7,5 kcal/mole

Nelle reazioni il fosfato inorganico è stato indicato con Pi. Come vedremo l’energia liberata nel corso di questa reazione verrà utilizzata in numerosi processi biologici per compiere diverse forme di lavoro. Anche il distacco idrolitico del fosfato beta dell’ADP decorre con una elevata variazione negativa di energia libera:

ADP + H2O ! AMP + Pi ∆G: - 7,5 kcal/mole In realtà le cellule utilizzano l’energia chimica contenuta nella molecola dell’ADP per sintetizzare ATP mediante la seguente reazione:

ADP + ADP ! ATP + AMP Si osserva il trasferimento di un fosfato beta dell’ADP ad un’altra molecola di ADP con formazione di ATP ed AMP. La reazione è catalizzata dall’enzima adenilato chinasi o miochinasi. Il distacco idrolitico del fosfato alfa dell’AMP decorre con una variazione negativa di energia libera di 3,5 kcal/mole e l’AMP non è considerato un composto ad alta energia.

AMP + H2O ! Adenosina + Pi ∆G = - 3,5 Kcal/moleUna molecola sarà definita un “composto ad alta energia” se la reazione di rottura idrolitica di uno specifico legame decorre con una variazione negativa di energia libera superiore a 7,5 kcal/mole.

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Esistono composti biologici che hanno una energia più elevata di quella dell’ATP, infatti in una scala energetica l’ATP assume una posizione intermedia:

Variazione dell’energia libera standard in alcuni composti di

interesse biologico Composto Legame ∆G°’ (kcal/mole)

fosfoenolpiruvato estereo -15 1,3-bisfosfoglicerato anidridico -12 fosfocreatina N-fosforico -10,3 acetil-CoA tioestereo -8,2 ATP anidridico -7,5 ADP anidridico -7,5 AMP estereo -3,4 glucosio-6-fosfato estereo -3,5

4) Definizione di metabolismo. L’insieme di tutte le reazioni chimiche che hanno luogo in un organismo vivente. Il metabolismo si divide in:

CATABOLISMO (degradazione di molecole biologiche) ANABOLISMO (sintesi di molecole biologiche)

Le reazioni cataboliche sono generalmente di natura ossidativa, producono energia ed alcune di esse sono accoppiate alla sintesi di ATP. Le reazioni anaboliche sono generalmente di natura riduttiva e richiedono energia (consumo di ATP). Questa suddivisione è una semplificazione didattica e spesso le stesse reazioni metaboliche hanno significato catabolico o anabolico a seconda dell’integrazione funzionale in una complessa rete metabolica. Si definisce via metabolica una serie di reazioni chimiche sequenziali dove il prodotto di una reazione è il substrato della reazione successiva. Ogni tappa di una via metabolica è catalizzata da un enzima, per cui ogni via metabolica risulta dall’attività sequenziale di una serie di enzimi che operano “in catena”. Cominceremo ad esaminare le reazioni del catabolismo ossidativo che permette di utilizzare l’energia contenuta negli alimenti per la sintesi dell’ATP. A tale scopo è necessario definire alcuni aspetti elementari delle reazioni di ossido-riduzione in biologia.

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5) Le reazioni di ossido-riduzione. Una reazione di ossido-riduzione consiste in un trasferimento di elettroni da una sostanza che si ossida (donatore di elettroni) ad una che si riduce (accettore di elettroni). Il trasferimento di atomi di idrogeno è equivalente al trasferimento di elettroni, per cui una sostanza può ossidarsi per trasferimento di idrogeni (deidrogenazione) ad una sostanza che si riduce. Una molecola può anche ossidarsi per incorporazione dell’ossigeno nella molecola del substrato (l’ossigeno possiede un valore elevato di elettronegatività e quando si combina con un altro elemento tende ad acquistare gli elettroni di legame) Nel corso del metabolismo sono molto comuni le reazioni di ossidazione di un substrato per deidrogenazione (catalizzate da enzimi chiamati deidrogenasi). Un sostanza S (donatore degli atomi di idrogeno) può ossidarsi per deidrogenazione solo se avviene la simultanea riduzione di un’altra molecola X (accettore degli idrogeni).

SH2 + X S + XH2

Mentre il substrato S è diverso nelle varie reazioni metaboliche l’accettore X degli atomi di idrogeno è quasi sempre rappresentato da due molecole biologiche indicate con le sigle:

NAD FAD

Quindi la riduzione del NAD e del FAD durante le reazioni di deidrogenazione di vari metaboliti è uno degli eventi chiave del catabolismo ossidativo. Infatti la successiva riossidazione del NAD e del FAD in un processo che richiede ossigeno (catena di trasporto degli elettroni mitocondriale) fornisce l’energia per uno dei meccanismi principali di sintesi dell’ATP (fosforilazione ossidativa; vedi avanti).

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6) Struttura e funzioni del NAD

STRUTTURA La sigla NAD indica il Nicotinamide Adenin Dinucleotide Il NAD è quindi composto da 2 nucleotidi (dinucleotide) legati tra loro a livello dei fosfati: il primo nucleotide è l’AMP il secondo è il nucleotide che ha come base eterociclica la nicotinamide

nicotinammide ribosio P P ribosio adenina

NH2 N

NN

OH

CH2O

OH

H

O

N

OH

CH2O

OH

H

O P OH

O

O

P OH

O

N

CONH2

AMP

+nicotinamide

nucleotide della nicotinamide

Conosciamo già uno dei due nucleotidi (AMP), mentre l’altro ha come base azotata eterociclica la nicotinamide. Dal punto di vista chimico l’acido nicotinico e la sua ammide (la nicotinammide) sono derivati della piridina. Per questo motivo il NAD (e il NADP che incontreremo più avanti) vengono chiamati coenzimi piridinici.

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NNN

CONH2COOH

piridina acido nicotinico nicotinammide

FUNZIONE Il NAD ha la funzione di accettore o donatore degli atomi di idrogeno in reazioni catalizzate da deidrogenasi (trasportatore di atomi di idrogeno). Quindi:

SH2 + NAD+ S + NADH+H+ Il NAD ossidato viene indicato con una carica positiva NAD+, mentre il NAD ridotto viene indicato come NADH+H+. Infatti, dei due atomi di idrogeno (cioè 2 protoni+ 2 elettroni) ceduti dal substrato ossidabile, il NAD accetta (a livello dell’anello della nicotinamide) 2 elettroni e un protone (cioè uno ione idruro H-); il restante protone (H+) viene rilasciato nel mezzo.

N R

H

N R

H H

R N

+

H H

H +

CONH2 CONH2 CONH2+

+

Il NAD come Coenzima

Alcuni enzimi sono proteine coniugate, formati cioè da una componente proteica (apoenzima) ed una non proteica (coenzima); il NAD è il coenzima di numerose deidrogenasi. Un enzima completo(Oloenzima) è formato da 2 parti:

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Il legame del coenzima NAD con l’apoenzima è un legame debole; il NAD può dissociarsi facilmente da un enzima ed associarsi ad un altro; quindi il NAD può essere definito nel seguente modo:

NAD: coenzima mobile di deidrogenasi.

La vitamina PP come precursore del coenzima NAD. Definizione generale di vitamina: le vitamine sono molecole organiche che devono essere introdotte in piccole quantità con la dieta per il normale funzionamento dell’organismo. La Vitamina PP come precursore del NAD La vitamina PP è un precursore del Coenzima NAD; questa vitamina è rappresentata da due vitameri (forme diverse da punto di vista chimico, ma equivalenti dal punto di vista biologico): l’ Acido Nicotinico e la Nicotinamide che vengono anche designati con il termine comprensivo di Niacina;. il fabbisogno giornaliero di Vitamina PP è di circa 20 mg; essa è contenuta in grande quantità nelle carni, mentre è scarsa nei vegetali. Sintesi della vitamina PP La vitamina PP viene sintetizzata nell’organismo umano (questa è un’eccezione per una vitamina!) a partire da un amminoacido: il Triptofano

Triptofano Acido Nicotinico

Tuttavia la quantità sintetizzata a partire dal triptofano non è sufficiente a coprire il fabbisogno giornaliero. La patologia da carenza di vitamina PP si chiama Pellagra; una grave malattia caratterizzata da:

Dermatite Diarrea coleriforme Demenza

La Pellagra è stata perciò definita la malattia delle 3 D.

Oloenzima

parte proteica Apoenzima

parte non proteica Coenzima NAD

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La dermatite è l’espressione più precoce e caratteristica della malattia, consiste in un ispessimento ed annerimento della pelle in corrispondenza delle parti generalmente esposte alla luce. La somministrazione di niacina è in grado di curare la pellagra (da ciò il nome di vit.PP = Pellagra Preventive) La pellagra si riscontrava in popolazioni con dieta ipoproteica e ricca di mais (dieta basata sulla polenta). Il mais, privo di nicotinamide, contiene come componente proteica la zeina, una proteina povera di triptofano. 7) Struttura e funzioni del FAD. La sigla FAD indica il Flavin Adenin Dinucleotide Il FAD è composto da 2 nucleotidi: AMP e FMN (flavin mononucleotide):

H

P O

OH OP

O

N

CH2

C

C

C

CH2

OH

H

OH

H

OH

H

O O OH

CH2

NH2 N

N N

N

H

OH

O

OH

C C N

C N

C C

C C C

C N H

CH3

CH3

O

O H

FMN AMP

FAD

riboflavina P P ribosio adenina

FMN AMP Anche il FAD ha la funzione di accettore o donatore degli atomi di idrogeno in reazioni catalizzate da deidrogenasi (coenzima trasportatore di atomi di idrogeno). Gli azoti 1 e 5 degli anelli flavinici (indicati in rosso nella figura) sono in grado di

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13

accettare reversibilmente 2 atomi di idrogeno; indicheremo il FAD in forma ridotta con la sigla FADH2

SH2 + FAD S + FADH2 A differenza del NAD il coenzima FAD è legato strettamente (legame covalente) con la porzione proteica (apoenzima) e viene, quindi, ossidato e ridotto in associazione con lo stesso enzima. La Vitamina B2 o Riboflavina precursore del FMN e del FAD Anche la Riboflavina è una vitamina (Vit. B2) e deve essere introdotta nell’organismo con l’alimentazione; la sua ampia diffusione sia nel regno animale che vegetale spiega la difficile evenienza di una avitaminosi da riboflavina; una carenza alimentare (rara) si manifesta con:

glossite stomatite angolare dermatite seborroica

Concludendo, i Coenzimi delle deidrogenasi possono essere:

Piridinici: NAD, NADP Flavinici: FMN, FAD

Similarità di struttura tra l’ATP e alcuni coenzimi

ATP NAD+ FAD CoA adenina adenina adenina adenina ribosio ribosio ribosio ribosio fosfato fosfato fosfato fosfato fosfato fosfato fosfato fosfato fosfato ribosio ribitolo acido pantotenico

niacina flavina b-mercaptoetilammina

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14

Vitamine: coenzimi derivati, distribuzione, fabbisogno e deficienza

Vitamina Coenzima Fonti alimentari

Dose giornaliera raccomandata

Sindrome carenziale

Nicotinamide (Vit.PP)

NAD e NADP carni 20 mg pellagra

Riboflavina (B2) FAD e FMN ubiquitaria 2 mg (rara) Glossite; stomatite angolare; dermatite seborroica

Tiamina (vit B1) Difosfotiamina o tiamina pirofosfato (es: coenzima della piruvato deidrogenasi)

Piselli- fagioli- lenticchie- lieviti

1,5 mg (0,5mg ogni 1000 Kcal introdotte con la dieta)

Beri-Beri

Acido pantotenico

Coenzima A

ubiquitaria

5-10 mg

assente

Biotina Coenzima di alcune carbossilasi (es: piruvato carbossilasi)

Fegato-rene e tuorlo d’uovo

0,1 mg Presente solo in soggetti che si alimentano con albume crudo (avidina)

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8) Meccanismi di sintesi dell’ATP. A) Composti ad alta energia e fosforilazione a livello del substrato Nel corso delle reazioni metaboliche si formano dei composti ad alta energia del tipo SP (vedi definizione di composti ad alta energia)dove S indica il resto della molecola del substrato e P indica il fosfato (dall’inglese Phosphate). Nella reazione successiva alla loro formazione l’ energia chimica viene utilizzata per la sintesi di una molecola di ATP. Nel caso dei composti S∼P la reazione consiste nel trasferimento del fosfato ad una molecola di ADP:

S P + ADP S + ATP

Questa modalità di sintesi di ATP è indicata come fosforilazione a livello del substrato. Per fosforilazione si intende una reazione in cui un gruppo fosforico viene legato ad un substrato. Nel corso dello studio della Biochimica incontreremo diversi tipi di fosforilazione. Nel caso specifico della “fosforilazione a livello del substrato” si fa riferimento alla fosforilazione dell’ADP che acquistando un fosfato si trasforma in ATP. L’energia per la sintesi dell’ATP deriva dalla reazione di rottura del legame ad alta energia () del substrato. B) Reazioni di deidrogenazione, coenzimi NAD e FAD ridotti e fosforilazione ossidativa. In reazioni di deidrogenazione nel corso del metabolismo si formano coenzimi NAD e FAD ridotti

SH2 + NAD+ S + NADH+H+ SH2 + FAD S + FADH2

La riossidazione dei Coenzimi NAD e FAD ridotti avviene mediante trasferimento degli idrogeni all’ossigeno con formazione di acqua.

NADH+H++1/2 O2 NAD++H2O

FADH2+1/2 O2 FAD+H2O

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16

Questo trasferimento avviene mediante una serie di reazioni nella cosiddetta “catena di trasporto degli elettroni mitocondriale” (processo della respirazione mitocondriale). L’energia che si libera durante la riossidazione del NAD consente la sintesi di ATP quindi: Il processo di sintesi dell’ATP accoppiato alla riossidazione del NAD e del FAD ridotto nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriale prende il nome di: fosforilazione ossidativa. In conclusione abbiamo due meccanismi principali di sintesi dell’ATP:

la fosforilazione a livello del substrato (processo anaerobico) la fosforilazione ossidativa (processo aerobico)

NADH+H++1/2O2 NAD++H2O

ADP+Pi sintesi di ATP

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Capitolo II

Glicolisi 1) Definizione di zuccheri o glucidi 2) Il trasporto del glucosio attraverso le membrane cellulari 3) Glicolisi: fasi e reazioni 4) La glicolisi anaerobica e la riduzione del piruvato a lattato 5) Bilancio energetico della glicolisi 6) Schema riepilogativo della glicolisi 1) Definizione di zuccheri o glucidi. Gli zuccheri o glucidi sono derivati aldeidici o chetonici di polialcoli. I glucidi sono anche denominati carboidrati, poiché nella loro formula il rapporto idrogeno/ossigeno è di 2/1 come nell’acqua: (CH2O)n (formula bruta degli zuccheri) dove n può variare da 3 a 9, donde le denominazioni di triosi, tetrosi, pentosi, esosi, eptosi, ecc. Essi si distinguono in aldosi o chetosi: i primi contengono il gruppo carbonilico (C=O) in posizione terminale, mentre gli altri in posizioni intermedie. Il glucosio è una molecola a 6 atomi di carbonio che rientra tra gli aldosi in quanto, nella forma aperta, il gruppo aldeidico è presente in posizione C1, in C(2-3-4-5) sono presenti quattro gruppi alcolici secondari e in C6 il gruppo alcolico primario. Il gruppo aldeidico reagisce intramolecolarmente con il gruppo alcolico del carbonio 5 dando origine ad una struttura ciclica (semiacetale interno)

H CH2OH

OH

O

H

H

C H

C

C

OH C

H C O H

OH

O

H OH

H

H OH

C

C

COH

C

C

CH2OH

H OH

H

:

1

23

4

5

6

1

3

4

5

2

6

glucosio in forma

aperta “rettilinea”glucosio in forma aperta “ripiegata”

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In seguito a tale legame si ottiene uno spostamento dell’idrogeno dal gruppo alcolico in C5 al gruppo carbonilico in C1, che diventa così gruppo alcolico. C1 e C5 sono legati covalentemente all’ossigeno e viene stabilizzata la struttura ciclica del glucosio (forma piranosica). Nota: da questo momento in poi non verranno indicati gli atomi di carbonio: nelle strutture cicliche si intende siano espressi ai vertici dei poligoni che le rappresentano.

OH

OHO H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

HOH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

Il fruttosio è sempre un esoso, ma rientra tra i chetosi, in quanto il gruppo carbonilico, nella forma aperta rettilinea, è in posizione C2. Anche nel fruttosio avviene una reazione intramolecolare che dà origine ad un anello pentaciclico (furanosico), in quanto il legame si stabilisce tra C2 e C5.

OH

OH

HO

H2OH

H

H

H

C

C

C

C

C

C

H2OH

O CH2OH

OH

O

H

OH

H

H

CH2

HO

HO

1

3

4

5

2

6

1

2

4

5

6

3

alfa-glucosio: il gruppo ossidrile in C1 è disposto al di sotto dell’anello piranosico

beta-glucosio: il gruppo ossidrile in C1 è disposto al di sopra dell’anello piranosico

Fruttosio: forma rettilinea “aperta”

Fruttosio: forma ciclica o “furanosica”

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2) Il trasporto del glucosio attraverso le membrane cellulari. Il glucosio viene trasportato dal sangue all’interno delle cellule dei vari tessuti a favore di gradiente di concentrazione, mediante un processo di diffusione facilitata mediato da carriers specifici, i trasportatori del glucosio. Tali molecole, di natura proteica, sono localizzate nelle membrane cellulari e sono costituite da una lunga catena polipeptidica a 12 tratti transmembrana.

Sono stati identificati 5 membri appartenenti a questa famiglia di proteine transmembrana, denominati GLUT(1-5) con differente espressione tissutale:

I. GLUT1 e GLUT3 sono espressi ubiquitariamente nelle cellule dei mammiferi

e sono responsabili del trasporto continuo del glucosio ad una velocità pressoché costante. La concentrazione fisiologica di glucosio nel sangue (5 mM equivalente a 90 mg/100ml; valore fisiologico della glicemia: 60-125 mg/100ml) è infatti più elevata del valore di KT (1 mM) di questi trasportatori. Si ricorda che per KT si intende la concentrazione di substrato alla quale si raggiunge la metà della velocità massimale di trasporto: maggiore è la KT minore è l’affinità del substrato per il trasportatore.

II. GLUT5 è localizzato nelle cellule epiteliali dell’intestino tenue e libera il

glucosio captato dal lume intestinale (da un sistema di cotrasporto Na+- glucosio) verso il circolo sanguigno.

III. GLUT2 è presente nel fegato e nelle cellule β pancreatiche. Ha un’elevata KT

per il glucosio (15-20 mM) e quindi la velocità di ingresso del glucosio nelle cellule di questi tessuti è proporzionale ai livelli di glicemia. L’alta KT del GLUT2 garantisce che il glucosio entri rapidamente nelle cellule epatiche solo durante i periodi in cui è in eccesso. Nelle cellule beta del pancreas l’alta KT assume un significato funzionale in quanto il tessuto risponde ad un eccesso di glucosio modulando la secrezione di insulina.

IV. GLUT4 (KT 5 mM) è responsabile del trasporto del glucosio nelle cellule

muscolari e adipose. L’insulina, secreta in seguito ad innalzamento dei valori glicemici, induce, in questi tessuti, un aumento del numero di trasportatori GLUT4 presenti sulla membrana cellulare.

COOH

NH2

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20

Espressione KT

Sensibilità all’insulina

GLUT-1 ubiquitaria 1 mM no GLUT-2 cellule epatiche e β pancreatiche 15-20 mM no GLUT-3 ubiquitaria 1 mM no GLUT-4 Cellule muscolari e adipose 5 mM si GLUT-5 Cellule intestinali 15-20 mM no 3) Glicolisi: fasi e reazioni. La Glicolisi è la via metabolica (serie di reazioni in cui il prodotto di una reazione diventa il substrato della successiva) che realizza la degradazione del Glucosio in 2 molecole di Acido Piruvico (o Piruvato). Il prodotto finale della glicolisi è l’acido piruvico, un chetoacido a 3 atomi di carbonio.

OH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

CH3

C

COOH

O gruppo chetonico

gruppo carbossilico 2

La degradazione del glucosio in acido piruvico avviene nel citoplasma attraverso 10 reazioni biochimiche scandite in 3 fasi:

Fase endoergonica :dalla 1a alla 3a reazione

Fase intermedia: 4a e 5a reazione

Fase esoergonica: dalla 6a alla 10a reazione

glucosio acido piruvico

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21

Fase Endoergonica

Prima reazione: fosforilazione del glucosio

OH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

O

OH OH

O H

H

CH2

H

OH

OH

H

H

ATP ADP !

Il glucosio riceve un gruppo fosforico dall’ATP in posizione 6 (Glucosio 6 fosfato!G6P). Il glucosio fosforilato non può più attraversare la membrana cellulare verso l’ambiente extracellulare. Questa reazione ha quindi intrappolato il glucosio nell’ambiente intracellulare a spese di una molecola di ATP. Gli enzimi che catalizzano la prima reazione sono le esochinasi, enzimi ubiquitari che trasferiscono gruppi fosforici dall’ATP (chinasi) a composti a 6 atomi di carbonio (esosi), con maggiore affinità per il glucosio. Un altro enzima, glucochinasi, agisce specificamente sul glucosio ma è espresso solo nel fegato e nella porzione endocrina del pancreas. Enzimi diversi che catalizzano la stessa reazione sono detti isoenzimi. Si ricorda che gli enzimi con il suffisso chinasi catalizzano il trasferimento del gruppo fosforico dall’ATP ad un substrato dal cui nome deriva il prefisso dell’enzima.

Seconda reazione: Isomerizzazione del glucosio 6-P a fruttosio 6-P

O

OH OH

O H

H

CH2

H

OH

OH

H

H HO

OCH2 CH2OH

OH

O

H

OH

H

H

1

6

1

6

fosfoglucoisomerasi

! !

esochinasi

glucosio glucosio 6 fosfato (G6P)

glucosio 6 fosfato (G6P)

fruttosio 6 fosfato (F6P)

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22

La isomerizzazione del glucosio 6-P in fruttosio è catalizzata dall’enzima fosfoglucoisomerasi.

Terza reazione: fosforilazione del F 6-P in fruttosio 1,6 bisfosfato (F1,6BP)

HO

OCH2 CH2OH

OH

O

H

OH

H

H

HO

OCH2

OCH2

OH

O

H

OH

H

H

fosfofruttochinasi

ATP ADP ! !

!

Questa reazione, catalizzata dall’enzima fosfofruttochinasi, costituisce un importante tappa di regolazione della glicolisi, infatti determina la definitiva ed irreversibile immissione del glucosio nel processo glicolitico. L’attività dell’enzima è regolata allostericamente* in senso positivo da alte concentrazioni di AMP, mentre viene inibita da alte concentrazioni di citrato e di ATP. Ciò significa che se i livelli energetici intracellulari sono elevati, la glicolisi rallenta, mentre se sono bassi la glicolisi accelera.

F 6-P F 1, 6-BP

Fosfofruttochinasi (PFK)

AMP

+

ATP Citrato

- -

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23

*La regolazione allosterica ( da allo = differente e sterico = struttura o stato) si verifica mediante la combinazione reversibile di sostanze con siti sull’enzima diversi dal sito attivo (che catalizza la reazione). Il termine allosterico si riferisce al fatto che gli enzimi regolati da questo meccanismo esistono almeno in due forme differenti, controllati da sostanze regolatrici. Nello stato R (R = Rilassato) l’enzima ha una notevole affinità per le molecole di substrato. Nello stato T (T = Teso o contratto) l’enzima ha scarsa o nessuna affinità per il substrato. Il sito nel quale si lega la sostanza regolatrice si definisce allosterico o regolatorio. Il legame con le sostanze regolatorie può indurre o lo stato R o lo stato T: il legame con un inibitore allosterico (o effettore allosterico negativo) induce la trasformazione di un enzima allosterico dallo stato R a quello T mentre il legame con un attivatore allosterico (o effettore allosterico positivo) ne induce la trasformazione dallo stato T a quello R. Le tappe della fase iniziale endoergonica possono essere definite preparatorie alle successive tappe della glicolisi. Infatti non vi è produzione bensì spesa energetica: vengono utilizzate due molecole di ATP per attivare il glucosio e promuoverne la successiva degradazione, durante la quale l’energia liberata verrà nuovamente immagazzinata sotto forma di ATP.

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24

Quarta reazione :degradazione del fruttosio 1, 6 BP ( F1,6 BP).

HO

OCH2

OCH2

OH

O

H

OH

H

H

H2C O

C

H2C OH

O

O C

H

H

C OH

OH2C

Diossiacetonfosfato (DAP)

Gliceraldeide3fosfato (GAP)

aldolasi +

!

!

!

!

In questa reazione, catalizzata dall’enzima aldolasi avviene la demolizione del fruttosio1,6BP in due triosi: diossiacetonfosfato (DAP) e gliceraldeide3fosfato(GAP).

Quinta reazione: isomerizzazione del DAP in GAP

O C

H

H

C OH

H2C OH2C O

C

OH

O

H

C OH

H2C O

OH CC

H

H

GAP(endiolo)DAP

triosofosfato isomerasi

! ! !

Questi due triosi sono interconvertibili: la reazione catalizzata dall’enzima triosofosfato isomerasi, implica la formazione di un composto intermedio (l’endiolo). Il GAP viene consumato nelle reazioni successive della glicolisi e il DAP viene convertito in GAP affinché possa procedere nel processo catabolico.

Fase Intermedia

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25

Premessa alla fase esorgonica La GAP è un Aldeide:

O

R

C H gruppo aldeidico

L’aldeide è un alcol deidrogenato (ossidato). Infatti da un gruppo alcolico per deidrogenazione si ottiene un’aldeide:

C H 2 O H

R

g rup p o a lco lico

de id rogenazione Se si passa dall’aldeide all’acido carbossilico avverrà un’altra ossidazione:

COOH O

R

C H

R

ossidazione gruppo carbossilico

aldeide acido Ricapitolando:

R

C H 2 O H O

R

C H

C O O H

R

a ld e id e a c id o a lc o o l

composti in scala di ossido-riduzione

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26

Fase Esoergonica

Sesta reazione : deidrogenazione e fosforilazione del GAP

O

C

H

H

C OH

O C

H

O

C OH

H2C OOH2C Pi gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi

NAD NADH+H++

!

!

!

gliceraldeide-3-fosfato acido bifosfoglicerico o bifosfoglicerato

1,3BPGGAP

L’enzima che catalizza tale reazione è la gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi. L’enzima catalizza simultaneamente a) una reazione di deidrogenazione (ossidazione) e b) una di fosforilazione (trasferimento del fosfato). a) Reazione di ossidazione: due atomi di idrogeno provenienti dal GAP e dal fosfato libero (Pi) presente nella soluzione vengono trasferiti al coenzima delle deidrogenasi, il NAD+, che così viene ridotto in NADH+H+. b) Reazione di trasferimento del fosfato: Il fosfato si lega mediante legame fosfoanidridico al gruppo carbossilico in posizione 1. Si noti che in seguito alla reazione di ossidazione il gruppo aldeidico è stato convertito in un gruppo carbossilico (impegnato mediante legame fosfoanidridico con un fosfato).

O C

H

H

C OH

H2C O

OH P O O

O

O C

H

O

C OH

H2C O

NAD NADH+H++

!

! !

GAP 1,3 BPG

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27

(Nota: in realtà nella reazione interviene un residuo di cisteina del sito attivo dell’enzima, con formazione di intermedi catalitici semiacetalici e tioestere. Si rimanda ai testi di Biochimica per i dettagli) L’Acido 1,3 Bisfosfoglicerico è un composto ad alta energia. La variazione di energia libera nella reazione di distacco idrolitico del fosfato in posizione 1 è pari a 12 kcal/mole. ∆G° = -12 kcal/mole (notare il simbolo ∼di legame ad alta energia utilizzato per indicare il legame fosfoanidridico del 1,3 BPG).L’energia derivante dall’ossidazione dell’aldeide è stata utilizzata per la formazione del composto ad alta energia. Nel corso della sesta reazione sono, dunque, avvenuti 2 eventi molecolari importanti:

I. Formazione di un composto ad alta energia (1,3 BPG) che nella reazione successiva sarà utilizzato per la sintesi di una molecola di ATP (fosforilazione a livello del substrato);

II. Formazione di NAD ridotto che nel processo della fosforilazione ossidativa potrà consentire la sintesi di 3 molecole di ATP.

Settima Reazione : 1a fosforilazione a livello del substrato

O C

H

O

C OH

H2C

O C

H

O

C OH

H2C OO

ADP ATP _

fosfoglicerato chinasi !

!

!

1,3 Bisfosfoglicerato 3 Fosfoglicerato Si realizza la prima fosforilazione a livello del substrato: il radicale fosforicoP in posizione 1 del 1,3BPG viene trasferito sull’ADP dall’enzima fosfoglicerato chinasi. La sintesi di ATP si realizza mediante l’energia chimica fornita dalla rottura del legame fosfoanidridico del 1,3 BPG.

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Ottava reazione: isomerizzazione del 3PG

O C

H

O

C OH

OH2C

O C

H

O

C O

OHH2C

_

!

_

! fosfoglicerato mutasi

3 Fosfoglicerato 2 Fosfoglicerato

Si realizza lo spostamento del fosfato da C3 a C2 catalizzato dall’enzima fosfoglicerato mutasi. Si ricorda che il termine mutasi indica enzimi che catalizzano il trasferimento di un raggruppamento da una posizione ad un’altra posizione della stessa molecola.

Nona reazione: rimozione di una molecola di acqua e formazione del fosfoenolpiruvato

O C

H

O

C O

OHH2C

O C

O

C

O

CH2

O

_

!

_

!

H2

enolasi

2 Fosfoglicerato PEP2 PG

Acido fosfoenolpiruvico o fosfoenolpiruvato

La reazione catalizzata dall’enolasi ha un particolare interesse in quanto trasforma un estere fosforico a basso contenuto energetico (2-fosfoglicerato) in un enolfosfato ad alto contenuto energetico ( ∆G° = -15 Kcal/mole).

∼∼

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29

Decima reazione: seconda fosforilazione a livello del substrato

O C

O

C

O C

O

C

CH2

O OH CH2

O C

O

C O

CH3piruvato kinasi

ADP ATP

!

___

tautomeria cheto-enolica

Nel corso della 10ma reazione, catalizzata dall’enzima piruvato kinasi, avviene la seconda fosforilazione a livello del substrato: il gruppo fosforico del PEP viene trasferito all’ADP per formare ATP. Il prodotto dalla reazione è l’acido piruvico (o piruvato) in forma enolica (en=doppio legame; ol=gruppo ossidrile). Il passaggio (interconversione) del piruvato dalla forma enolica alla forma chetonica avviene spontaneamente e rapidamente (tautomeria cheto-enolica). Si ha uno spostamento di un atomo di idrogeno dal carbonio 2 al 3; si perde così il gruppo alcolico e il doppio legame si ritrova tra il carbonio e l’ossigeno (C=O gruppo chetonico). Il prodotto finale della 10° reazione è dunque il piruvato in forma chetonica.

PEP Acido Enol Piruvico o Piruvato

(forma enolica)

Acido Enol Piruvico o Piruvato

(forma chetonica)

Interconversione spontanea

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30

OH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

O

OH OH

O H

H

CH2

H

OH

OH

H

H HO

OCH2 CH2OH

OH

O

H

OH

H

H

HO

OCH2

OCH2

OH

O

H

OH

H

H

O C

H

H

C OH

OH2C H2C O

C

OH

O

C

H

H O

C

H

O

C OH

H2C O

O C

H

O

C OH

H2C O

O C

H

O

C O

OHH2C

C O

C

CH2

O

O C

O

C OH

CH2

O C

O

C O

CH3

O

OH2

ATP ADP

fosfoglucoisomerasi

! !

esochinasi fosfofruttochinasi

!

!

aldolasi

!

GAP

triosofosfato isomerasi

! Pi

gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi

NADNADH+H ++!

!

1,3BPG

_

fosfoglicerato chinasi !

3 PG

_

!

fosfoglicerato mutasi

2 PG

_

!

enolasi

PEP

piruvato kinasi

__

piruvato (forma chetonica)

piruvato (forma enolica)

ATP ADP

DAP

Glucosio G6P F6P

ATP ADP

ADP ATP

F1,6BP

~

REAZIONI DELLA GLICOLISI

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31

4) La glicolisi anaerobica e la riduzione del piruvato a lattato Abbiamo visto che la sesta reazione della glicolisi, catalizzata dall’enzima GAP deidrogenasi, necessita di NAD ossidato (NAD+) come accettore di H. Se la glicolisi procedesse ad alta velocità fino alla decima reazione tutto il NAD ossidato citosolico sarebbe rapidamente convertito in NAD ridotto e la glicolisi stessa si arresterebbe alla sesta reazione. E’ necessario quindi un meccanismo di riossidazione del NAD ridotto. In condizioni aerobiche la riossidazione del NAD ridotto avviene durante la fosforilazione ossidativa mitocondriale con consumo di ossigeno, formazione di acqua e sintesi di ATP. In condizioni anaerobiche la riossidazione del NAD ridotto (NADH+H+) avviene nel corso dalla 11° reazione, durante la riduzione del piruvato a lattato. La reazione di riduzione del piruvato in lattato può essere, quindi, considerata un meccanismo alternativo di riossidazione del NAD ridotto in condizioni anaerobiche.

undicesima reazione

O C

O

C O

CH3

O C

O

C

CH3

OHH

_ _

NAD NADH+H ++

lattato deidrogenasi

L’11ma reazione ha la funzione di riossidare il NAD ridotto (NADH+H+) in NAD ossidato (NAD+) in condizioni anaerobiche (vedi schema del movimento pendolare del NAD tra gli enzimi GAP deidrogenasi e lattato deidrogenasi nella pagina seguente). In condizioni di anaerobiosi, e quindi di impossibilità per le cellule di produrre ATP mediante il ciclo di Krebs e la fosforilazione ossidativa, la glicolisi anaerobica rappresenta il meccanismo metabolico fondamentale per la sintesi di ATP.

Piruvato (Cheto-acido)

Lattato (Ossi-acido)

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GLUCOSIO

G6P

F6P

1,3BPG

3PG

F1,6BP

GAP DAP

2PG PEP PYR LATTATO

NADH+H+

NAD+ NADH+H+

NAD+

Movimento pendolare del NAD tra gli enzimi GAP deidrogenasi e lattato deidrogenasi. Concetto del NAD come coenzima mobile.

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33

La produzione intracellulare di un metabolita con proprietà acide, come il lattato, ha delle importanti conseguenze funzionali che esamineremo nei capitoli sulla biochimica dell’esercizio fisico. Uno dei meccanismi che intervengono per evitare che il rapido accumulo intracellulare di questo metabolita porti a variazioni eccessive del pH intracellulare è l’efflusso del lattato nell’ambiente extracellulare mediato da specifici trasportatori localizzati nella membrana plasmatica. E’ un errore considerare il lattato come un catabolita terminale di scarto. Il lattato, prodotto in tessuti privi di mitocondri (eritrociti) o nelle fibre muscolari di tipo II durante sforzi di intensità superiore alla soglia anaerobica (vedi cap XII) e trasferito al circolo sanguigno, può essere poi captato ed utilizzato da altri tessuti a scopo energetico (cuore, altri tessuti) o per la sintesi di glucosio (fegato; vedi gluconeogenesi e ciclo di Cori). Per essere avviato a tali destini metabolici il lattato deve essere riconvertito in piruvato con riduzione del NAD+, reazione catalizzata dallo stesso enzima lattato deidrogenasi. La proteina che costituisce l’enzima lattato deidrogenasi è un tetramero, cioè è formata da quattro catene polipeptidiche (subunità). Si conoscono due tipi diversi di catene polipeptidiche che entrano nella composizione della LDH: le catene H (da heart: cuore) e le catene M (da muscolo).

Un tetramero formato da due tipi diversi di subunità può esistere in 5 forme diverse: Gli isoenzimi sono distribuiti in modo differenziale nei vari tessuti dell’organismo. Per esempio, LDH1 è l’isoenzima che predomina nel cuore, mentre LDH5 è l’isoenzima che predomina nelle fibre di tipo II del muscolo scheletrico. Si ritiene che gli isoenzimi 1, 2 e 3 siano caratteristici dei tessuti

con predominante metabolismo aerobico, mentre gli isoenzimi 4-5 dei tessuti con forte componente anaerobica.

composizione in subunità

sigla

H4 LDH1 H3M1 LDH2 H2M2 LDH3 H1M3 LDH4 M4 LDH5

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5) Bilancio energetico della glicolisi.

Bilancio energetico della glicolisi anaerobica

Bilancio energetico della glicolisi aerobica

In condizioni aerobiche il piruvato prosegue la sua degradazione nella decarbossilazione ossidativa e nel ciclo di Krebs nei mitocondri. Il NADH+H+ ottenuto a livello della VI reazione glicolitica non verrà ossidato nel citosol dalla LDH (nella glicolisi aerobica non si produce lattato!) e quindi potrà essere immesso nei mitocondri: per ogni molecola di NADH+H+ riossidata nella catena di trasporto degli elettroni si otterranno 3 molecole di ATP*. Dato che 2 triosi attraversano la fase esoergonica, per ogni molecola di glucosio otteniamo 2 NADH+H+ e, quindi, 6 ATP nella fosforilazione ossidativa. In condizioni aerobiche otteniamo quindi 8 ATP nella conversione del glucosio in 2 molecole di piruvato. *In realtà la membrana mitocondriale interna non è permeabile al NAD. Esistono due sistemi di trasporto degli equivalenti riducenti dal citosol al mitocondrio: la spola aspartato-malato e la spola fosfodiossiacetone-glicerolo3fosfato: la prima veicola l’ingresso nel mitocondrio di una molecola di NADH+H+ e quindi la resa energetica sarà di 3 molecole di ATP, la seconda scambia una molecola di NADH+H+ con una di FADH2 e quindi, la resa energetica sarà di 2 molecole di ATP.

Fase endoergonica

Glucosio

F1,6BP

- 2 ATP

Fase esoergonica

2 GAP

2Piruvato

+ 4 ATP

Guadagno energetico + 2 ATP

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6) Schema riepilogativo della glicolisi

1)1°Fosforilazione E! Esochinasi

2) Isomerizzazione E! Fosfoglucoisomerasi

3) 2° Fosforilazione E! Fosfofruttochinasi

4) Degradazione del F 1,6BP E! Aldolasi

5) Isomerizzazione E!tr iosofosfatoisomerasi

6)Deidrogenazione e fosforilazione del GAP

E! GAP-deidrogenasi

7) 1°Fosforilazione a livello del substrato

E! Fosfoglicerato kinasi

8) Isomerizzazione E! Mutasi

9) Rimozione di una molecola di acqua e formazione del PEP

E! Enolasi

10) 2°Fosforilazione a livello del substrato

E! Piruvato chinasi

F A S E E N D O E R G O N I C A

F A S E E S O E R G O N I C A

GLUCOSIO

G6P

F6P

F1, 6BP

GAP DAP

1,3BPG

3PG

2PG

PEP

PYR

ATP

ADP

NAD+

NADH+H+

ADP

ATP

H2O

ATP

ATP

ADP

ADP

Pi

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Capitolo III

Decarbossilazione ossidativa del piruvato e Ciclo di Krebs

1) Il mitocondrio 2) Destini metabolici del piruvato (nell’uomo) 3) Decarbossilazione ossidativa del piruvato 4) Il Coenzima A (CoA): struttura e funzione 5) Schema Generale del Ciclo di Krebs 6) Le 8 reazioni del Ciclo di Krebs 7) Bilancio energetico del ciclo di Krebs 8) Il significato catalitico del ciclo di Krebs 9) Convergenza delle principali vie metaboliche nel ciclo di Krebs

1) Il mitocondrio I mitocondri sono organuli cellulari delle dimensioni di pochi micron (10-3mm) delimitati da due membrane concentriche (membrana mitocondriale esterna e membrana mitocondriale interna). Presentano usualmente forma ellissoidale, ma possono assumere forme assai diverse. Lo spazio tra le due membrane viene chiamato “spazio intermembrana”; la membrana interna delimita la “matrice mitocondriale”, nella quale si invagina con numerose introflessioni della membrana dette “cristae”. Dalla superficie interna della membrana interna si proiettano nella matrice numerosi corpuscoli sferoidali peduncolati (vedremo più avanti il ruolo delle proteine che formano questi corpuscoli).

cristae

membrana mitocondriale esterna

membrana mitocondriale interna

spazio intermembrana

matrice

corpuscoli sferoidali

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37

Dal punto di vista funzionale la membrana esterna è permeabile a tutte le molecole con peso molecolare < 5kDa attraverso dei canali formati da proteine dette “porine”. La membrana interna rappresenta invece una barriera selettiva. Il passaggio di metaboliti specifici (per es. il piruvato) avviene grazie a delle proteine carrier (trasportatrici) specifiche. Gli enzimi della decarbossilazione ossidativa del piruvato, della carbossilazione del piruvato, del ciclo di Krebs (con l’eccezione della succinato deidrogenasi), della beta-ossidazione degli acidi grassi e della chetogenesi sono localizzati nella matrice mitocondriale. 2) Destini metabolici del piruvato (nell’uomo). 3) Decarbossilazione ossidativa del piruvato In condizioni aerobiche il piruvato che si forma direttamente dalla glicolisi o indirettamente dall’ossidazione del lattato passa all’interno dei mitocondri (matrice mitocondriale) dove viene trasformato in acetil-CoA mediante decarbossilazione ossidativa, catalizzata dal complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi. Tale complesso comprende tre diversi enzimi (piruvato deidrogenasi, lipoil transacetilasi, diidrolipoil deidrogenasi) a cui sono associati i rispettivi coenzimi (difosfotiamina, acido lipoico, FAD). Inoltre sono saldamente associati al complesso i coenzimi NAD+ e Coenzima-A. La difosfotiamina (o tiamina pirofosfato) è la forma attiva della tiamina. Questa molecola non viene sintetizzata nell’organismo umano e deve essere introdotta in piccole quantità con la dieta (0,5 mg ogni 1000 kcal introdotte con la dieta): la tiamina è, dunque, una vitamina (vitamina B1). La avitaminosi B1 è il Beri Beri che colpisce le popolazioni orientali la cui nutrizione è a base di riso brillato, cioè privo della cuticola. Questa patologia colpisce i nervi periferici con conseguente paralisi ai muscoli scheletrici (Beri

PIRUVATO

LattatoAcetil-CoA

Ossalacetato

Alanina Glucosio

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Beri secco → polineuropatia periferica) e danni al cuore (Beri Beri umido → edemi diffusi con insufficienza circolatoria). La carenza di Tiamina impedisce al sistema aerobico di proseguire; ne deriva che per produrre energia bisognerà avvalersi del sistema anaerobico e ciò non è compatibile con una normale funzionalità dei neuroni e delle cellule del miocardio. In questo corso non esamineremo in dettaglio le reazioni catalizzate dalle singole componenti enzimatiche del complesso della piruvato deidrogenasi, ma ci limiteremo ad una visione globale semplificata. La reazione di degradazione del piruvato ad acetil-CoA può essere suddivisa a scopo didattico in tre fasi: la decarbossilazione del piruvato, l’ossidazione dell’aldeide ottenuta e la condensazione con il coenzima A. Analizziamo singolarmente le singole tappe:

decarbossilazione del piruvato:

O C

O H

C O

C H 3

C O

C H 3

H C O 2

p iru va to a c e ta ld e id e Il piruvato (3 atomi di carbonio) perde il gruppo carbossile sotto forma di CO2 (decarbossilazione) con formazione di un composto a 2 atomi di carbonio. Se si trattasse di una decarbossilazione semplice il prodotto della reazione sarebbe un’ aldeide a due atomi di carbonio (aldeide acetica o acetaldeide). In realtà l’acetaldeide subisce un processo di ossidazione NAD-dipendente. Inoltre l’acido che si ottiene dall’ossidazione dell’acetaldeide (acido acetico) viene coniugato al Coenzima A sotto forma di tioestere (acetil-CoA).

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ossidazione e trasferimento al CoA:

C O

CH3

H C O

CH3

SCoA

+ CoASH

NAD NADH+H+ +

acetaldeide acetil-CoA La reazione complessiva è, dunque, una decarbossilazione ossidativa:

O C

OH

C O

CH3

CO2C O

CH3

SCoA

CoASH

NAD NADH+H+ +

+ +

acetil-CoApiruvato In conclusione la decarbossilazione ossidativa del piruvato consiste nella trasformazione del piruvato in acetil-CoA, con la produzione di una molecola di NAD ridotto e la liberazione di una molecola di CO2.

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4) Il Coenzima A (CoA): struttura e funzione. Nella decarbossilazione ossidativa del piruvato abbiamo incontrato per la prima volta una importante molecola biologica: il Coenzima A. Seguono alcune brevi informazioni sulla sua struttura e funzione.

Struttura del CoA:

AM P P P C H2N H 2 C H2 SH

Acid o Panto tenico

g rup p o sulfid rilico o tio lico

C

CH3

NH2 N

NN CH2O

OH

H

O O P

O N

O O P OH

O

O O P O

O

CH2 CH3

H

CC H

OH N H

CH2

CH2O

C O

CH2 NH

CH2

SH

-mercaptoetilaminaβ

pantotenato

Adenosin-3' fosfato

Il coenzima è dunque formato da un nucleotide (AMP: adenosin-3’-fosfato) legato (in 5’) con un ponte pirofosforico all’acido pantotenico (pantotenato) a sua volta legatoad una piccola molecola, la beta-mercaptoetilammina, che termina con un gruppo sulfidrilico o tiolico (-SH) libero (l’acido pantotenico legato alla beta- mercaptoetilammina viene anche chiamato panteteina). Il gruppo funzionale del coenzima A è il gruppo tiolico (-SH) e questa è la caratteristica più importante da

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ricordare (vedi più avanti le funzioni). Spesso il CoA viene indicato con il simbolo CoASH, mettendo in evidenza il gruppo tiolico terminale. Il CoA può essere sintetizzato nel nostro organismo utilizzando l’acido pantotenico preformato, l’ATP ed un aminoacido solforato (cisteina). L’acido pantotenico non viene sintetizzato nel nostro organismo e deve essere introdotto con la dieta: è, dunque, una vitamina. Nell’uomo non è nota una avitaminosi da deficienza di acido pantotenico. Ciò dipende dalla ubiquitarietà di questo fattore vitaminico negli alimenti naturali (donde la denominazione di pantotenico).

Funzione del CoA:

Il CoA è un attivatore metabolico dell’acido acetico e degli altri acidi carbossilici. Si lega al gruppo carbossile (-COOH) degli acidi con il suo gruppo tiolico o sulfidrilico (-SH) mediante un legame tioestereo. Si ricorda che gli esteri sono formati da una molecola di acido carbossilico (R- COOH) e da una molecola di alcool (R-OH) con eliminazione di una molecola di acqua: R-COOH + HO-R’ → R-CO-O-R’ il gruppo R-CO- viene chiamato acile. I tioesteri sono esteri di un composto tiolico (R-SH) con un acido e, a differenza degli esteri ordinari dell’ossigeno, sono composti ad alta energia di idrolisi: R-COOH + HS-R’→ R-CO~S-R’ Esteri → composti ottenuti mediante un legame tra un gruppo carbossilico (-COOH) e un gruppo alcolico (-OH) Es.: trigliceridi (esteri di acidi grassi con glicerolo) Esteri fosforici o fosfoesteri → acido fosforico + gruppo alcolico Es. glucosio-6-fosfato Tioestere → gruppo carbossilico (-COOH) + gruppo tiolico (-SH) Es. acetilCoA Quindi dal punto di vista chimico l’acetil-CoA si può considerare derivato dalla condensazione dell’acetato al CoASH mediante rimozione di una molecola di acqua e formazione di un legame tioestereo:

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C O

CH3

SCoA

C O

OH2

CH3

OH

+ CoASH

acetato acetil-CoA

legame tioestereo

In realtà, come abbiamo visto precedentemente, la sintesi biochimica dell’acetilCoA può avvenire mediante la complessa reazione della decarbossilazione ossidativa del piruvato. Vedremo più avanti altri esempi di sintesi biochimica di acilCoA. Il legame tioestereo viene indicato con il simbolo ~ in quanto ricco di energia (8 kcal/mole). L’elevato contenuto di energia degli acilCoA (o acil~SCoA) li rende metabolicamente reattivi; i corrispondenti acidi grassi liberi sono invece metabolicamente inerti. La combinazione di un acido carbossilico con il coenzima A, mediante un legame tioestere, produce un composto ad alta energia di idrolisi. La rottura del legame tioestereo con formazione di CoA libero può fornire l’ energia:

a. per la sintesi di ATP in reazioni di fosforilazione a livello del substrato (ad es. fosforilazione a livello del substrato nel ciclo di Krebs: la trasformazione di succinilCoA in succinato e CoA libero fornisce l’energia necessaria per la sintesi di una molecola di GTP);

b. per la condensazione del gruppo acilico ad altri composti organici (ad es. reazione di condensazione dell’acetile con l’ossalacetato per formare citrato nella prima reazione del ciclo di Krebs).

Si dice che il coenzima A “attiva” il gruppo acetile e, in passato, l’acetilCoA è stato chiamato “acetato attivo”.

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5) Schema Generale del Ciclo di Krebs Ciclo di Krebs o ciclo dell’acido citrico o ciclo degli acidi tricarbossilici

O

CH3 CoA SH

-

-

CH2

COOH

CoASC

OH CH2 COOH

COOH

C CH2 COOH

HOOC

C

COOH

H OH

H

CH2 CH2 COOH

C

COOH

O

CO2

CH2 CH2 COOH

C O

CoAS CoA SH

CO2

CH2 CH2 COOH

COOH

CoA SH

CH

CH

COOH

COOH

C

C

COOH

H OH

CH2 COOH

OH

CH2

C

COOH

O

COOH

OH

acetilCoA

citrato

isocitrato

NAD

NADH+H +

+

NAD NADH+H +

+

chetoglutaratoα GDP+Pi

GTP

succinato

succinil-CoA

fumarato FADH

FAD

2

malato

2

ossaloacetato

NADH+H NAD

+

+

1

2

3

4

5

6

8

7

condensazione

isomerizzazione

1°decarbossilazione ossidativa

2°decarbossilazione ossidativa

fosforilazione a livello del substrato

1°deidrogenazione

idratazione

2°deidrogenazione

1 2

3

4

5

6

7

8

2

Ciclo di Krebs: enzimi 1 citrato sintasi 5 succinil-CoA sintetasi 2 aconitasi 6 succinato deidrogenasi 3 isocitrato deidrogenasi 7 fumarasi 4 α-chetoglutarato deidrogenasi 8 malato deidrogenasi

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6) Le 8 reazioni del Ciclo di Krebs: Definizione di Ciclo metabolico: Il Ciclo è una via metabolica alla cui fine si ritrova uno dei composti di partenza. Il ciclo di Krebs ha inizio con la condensazione di acetilCoA ed ossalacetato. Il gruppo acetile (2 atomi di carbonio) si condensa con l’ossalacetato (chetoacido a 4 atomi di carbonio) e si ha la liberazione di CoA e la formazione di citrato (acido tricarbossilico a 6 atomi di carbonio). Termina con la formazione di ossalacetato, uno dei due composti di partenza. Durante il ciclo si ha:

1) liberazione di due atomi di carbonio sotto forma di CO2, catabolita terminale che sarà eliminato con la respirazione polmonare;

2) formazione di coenzimi NAD e FAD ridotti; 3) sintesi di una molecola di GTP.

Possiamo dividere schematicamente il ciclo di Krebs in quattro fasi: 1)Fase iniziale (reazioni1 e 2) Reazione n°1sintesi del citrato mediante la condensazione di acetilCoA e ossalacetato

O

OH2

C O -

CH2

COOH

OH CH2 COOH

COOH

COOH CH2 COOH

OH CH2

C COOH

C O

CH2

COOH

C

C

H

H

H

CoA SH C

acetilCoA

ossalacetato

+

SCoA

citrato

SCoA

citril-CoA

Tale reazione è catalizzata dall’enzima citrato sintasi. Il gruppo metilico (-CH3) dell’acetil-CoA tende a perdere in forma di protone uno dei tre idrogeni, rendendo possibile lo stabilirsi di un legame covalente tra il C del gruppo metilico dell’acetile ed il C del gruppo carbonilico (-CO) dell’ossalacetato. Si forma così il citril-CoA, un intermedio catalitico che non viene rilasciato in forma libera dall’enzima (per tale motivo è indicato in parentesi quadra), da cui dopo il distacco idrolitico del coenzima A, si genera il citrato, un acido tricarbossilico.

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Reazione n°2 : isomerizzazione del citrato in isocitrato:

COOH

OH CH2 COOH

COOHC C CH2 COOH

COOH

C

COOH

H OH

HC CH2 COOH

COOH

C

COOH

HOH2CH H OH2

citrato isocitratocis-aconitato

aconitasi aconitasi

2) Fase delle decarbossilazioni ossidative (reazioni 3, 4): Reazione n°3:1a decarbossilazione ossidativa.

C CH2 COOH

COOH

C

COOH

H OH

H C CH2 COOH

COOH

C

COOH

H

O

CH2 COOH

C

COOH

O

CH2

CO2

isocitrato

NADH+H+ +NAD

chetoglutaratoα(ossalosuccinato)

isocitrato deidrogenasi

ossidazione decarbossilazione

Durante la terza reazione del ciclo di Krebs avviene la conversione di una molecola a 6C (l’isocitrato) ad una a 5C (acido alfa-chetoglutarico o alfa-chetoglutarato). La reazione, catalizzata dall’enzima isocitrato deidrogenasi, prevede l’ossidazione dell’isocitrato con formazione di un intermedio, l’ossalsuccinato, dal quale si distacca una molecola di CO2. Si ha dunque formazione di NAD ridotto e liberazione di una molecola di anidride carbonica. L’ossalsuccinato viene decarbossilato mentre si trova legato all’enzima e non compare mai in forma libera (per questo è stato posto in parentesi quadra).

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Reazione n° 4:2a decarbossilazione ossidativa.

CH2 COOH

C

COOH

O

CH2 CoA SH CH2 COOH

C O

CH2

CO2

α chetoglutarato

SCoA

+

NADH+H+ +NAD

chetoglutarato deidrogenasiα succinil-CoA

La seconda decarbossilazione ossidativa che trasforma un chetoacido, l’alfa- chetoglutarato, in un derivato acilico a 4 C legato al CoA, il succinilCoA, somiglia alla reazione di conversione del piruvato in acetilCoA. Il complesso multienzimatico che la catalizza, l’alfa-chetoglutarato deidrogenasi, è simile alla piruvato deidrogenasi. Anche in questa reazione si è formata una molecola di NAD ridotto e si ha liberazione di una molecola di CO2. Il succinilCoA è un composto ad alta energia (reazione di idrolisi del legame tioestereo ∆G° =-7,8 Kcal/mole): tale energia sarà sfruttata nella reazione successiva. 3) Fase della fosforilazione a livello del substrato: Reazione n° 5 !

C H 2 C O O H

C O

C H 2 C H 2 C O O H

C O

C H 2

C o A S H

O H

s u c c in i l -C o A

S C o A G D P + P i G T P

s u c c in a to s u c c in il-C o A s in te ta s i

L’energia derivata dalla rottura del legame tioestereo del succinil-CoA,composto ad alta energia, viene utilizzata per convertire GDP e Pi in GTP (fosforilazione a livelllo del substrato). Si ha la formazione di succinato e CoA libero. La generazione del GTP costituisce la terza fosforilazione a livello del substrato: si ricorda che le altre due fosforilazione sono avvenute nel corso della 7° e 10° reazione della glicolisi.

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4) Fase delle deidrogenazioni (reazione 6, 7, 8): in realtà sono due deidrogenazioni separate da una idratazione. Reazione n° 6: deidrogenazione del succinato a fumarato

CH2 COOH

CH2

COOH

COOH

C

COOH

CH

H

FADHFAD 2

succinato fumarato

succinato deidrogenasi

La reazione è catalizzata dall’enzima succinato deidrogenasi, enzima FAD- dipendente. Si ottiene quindi una molecola di FAD ridotto (FADH2) Reazione n° 7: idratazione del fumarato.

COOH

C

COOH

CH

H CH2

COOH

COOH

CH OH

OH2

fumarato malato

fumarasi

Reazione n° 8 : deidrogenazione del malato ad ossalacetato.

CH2

COOH

COOH

CH OH

CH2

COOH

COOH

C O

malato

NAD NADH+H+ +

ossalacetato

malato deidrogenasi

In questa reazione, catalizzata dall’enzima malato deidrogenasi, si ha la formazione di una molecola di NAD ridotto e la generazione del composto di partenza, l’ossalacetato che può così ricominciare il ciclo e consentire l’ossidazione di un’altra molecola di acetil-CoA.

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Acetil-CoA

Riassumendo:

CO2

CO2

NADH+H +

NADH+H+

NADH+H +

FADH2

GTP

1° metà del ciclo: due decarbossilazioni ossidative

2° metà del ciclo: due deidrogenazioni

7) Bilancio energetico del ciclo di Krebs Per ogni molecola di Acetil-CoA che entra nel ciclo di Krebs si producono 12 molecole di ATP.

3 NADH+H+ 9 ATP

1 FADH2 2 ATP

1 GTP 1

TOTALE 12 ATP 2CO2

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Per ogni molecola di Glucosio completamente degradata attraverso la:

Glicolisi

Decarbossilazione Ossidativa del Piruvato

Ciclo di Krebs

si ottiene il seguente rendimento in ATP e produzione di CO2: Via metabolica Substrato Fosforilazione

a livello del substrato

Fosforilazione ossidativa

ATP prodotto

Co2 prodotta

Glicolisi aerobica

1 glucosio

2 6 (2 NADH+H+)

8 no

Decarbossilazione ossidativa del piruvato

2 piruvato

no 6 (2 NADH+H+)

6 2 CO2

Ciclo di Krebs 2 acetil- CoA

2 22 (6 NADH+H+ 2 FADH2)

24 4 CO2

TOTALE 4 34 38 6 CO2

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+

Schema riassuntivo della formazione di ATP (glicolisi!ciclo di Krebs)

2 ATP

2 NADH+H+

2 NADH+H+

6 NADH+H+

2 FADH2

x 3ATP

x 2ATP

30 ATP

Catena respiratoria

GLUCOSIO

GLICOLISI AEROBICA

2 Piruvato

2 Acetil-CoA

Ciclo

di KREBS

2 CO2

+

+ 4

ATP

2 GTP

=

6 O2

+

38 ATP

4 CO2 = 6

CO2

+

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8) Il significato catalitico del ciclo di Krebs Come abbiamo visto l’ossalacetato è necessario per iniziare il ciclo di Krebs ma viene rigenerato alla fine del ciclo, per cui formalmente non viene consumato durante il ciclo. Al contrario il gruppo acetile dell’acetil-CoA viene formalmente consumato (convertito in CO2) in ogni ciclo. Considerando, quindi, il ciclo di Krebs nella sua globalità l’ossalacetato non viene né consumato né prodotto, ma consente una rapida ossidazione del gruppo acetile. Se consideriamo le 8 reazioni del ciclo come un’unica reazione chimica che converte l’acetile in CO2 possiamo dire che l’ossalacetato si è comportato come una sorta di catalizzatore: i catalizzatori per definizione non sono prodotti consumati durante una reazione ma accelerano la velocità di reazione. Il ciclo di Krebs ha dunque una natura catalitica: questo concetto non deve essere confuso con la normale attività catalitica degli enzimi che agiscono a livello delle singole reazioni. La partecipazione dell’acetil-CoA al ciclo viene detta stechiometrica per distinguerla dalla partecipazione catalitica dell’ossalacetato (stechiometrico è un termine che indica che il substrato viene consumato quantitativamente; la stechiometria è quella parte della chimica che studia gli aspetti quantitativi delle reazioni chimiche). Ogni giro del ciclo viene consumata una molecola di acetil- CoA e quindi bisogna rifornire continuamente il ciclo di acetil-CoA affinché possa continuare. Acetil-CoA: substrato stechiometrico Ossalacetato: substrato rigenerato. (NOTA: Anche se è stato dimostrato, mediante studi con radioisotopi, che gli atomi di carbonio che sono liberati sotto forma di CO2 sono quelli dell’ossalacetato di partenza, alla fine del ciclo l’ossalacetato viene rigenerato e, quindi, dal punto di vista della reazione globale abbiamo trasformato un gruppo acetile in 2 molecole di CO2 senza consumare ossalacetato). 9) Convergenza delle principali vie metaboliche nel ciclo di Krebs. Il piruvato e l’acetil-CoA per il ciclo di Krebs non derivano solo dai glicidi. Il piruvato può derivare da aminoacidi (ad es. alanina per transaminazione). L’acetil- CoA può derivare da aminoacidi o dell’ossidazione degli acidi grassi. Diversi intermedi del ciclo di Krebs possono derivare dal metabolismo degli aminoacidi (chetoglutarato, ossalacetato, fumarato, succinil-CoA). Il ciclo di Krebs rappresenta, quindi, un punto di convergenza del metabolismo glicidico, lipidico ed aminoacidico.

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10) Il significato anfibolico del ciclo di Krebs Il ciclo di Krebs è fondamentalmente un processo catabolico ossidativo: ossidazione dell’acetil-CoA ad anidride carbonica con la concomitante formazione di nucleosidi trifosfati e coenzimi NAD e FAD ridotti. Tuttavia gli intermedi del ciclo di Krebs possono servire anche da precursori per una serie di reazioni biosintetiche (anaboliche). Per questo si dice che il ciclo di Krebs è anfibolico cioè può avere sia significato catabolico che anabolico. Intermedi del ciclo di Krebs possono essere impiegati per la sintesi di glucidi, lipidi, proteine o altri composti azotati. Citrato mitocondriale!citrato citosolico! sintesi di acidi grassialfa-chetoglutarato!glutammato (aminoacido) Ossalacetato!aspartato (aminoacido)Ossalacetato!gluconeogenesiSuccinil-CoA!sintesi porfirine 11) Le reazioni anaplerotiche del ciclo di Krebs. Dobbiamo ora capire l’origine metabolica dell’ossalacetato che dà inizio al ciclo di Krebs. Inoltre, sebbene l’ossalacetato non venga consumato durante il ciclo, le reazioni anaboliche che utilizzano intermedi del ciclo di Krebs (vedi sopra) possono ridurre i livelli di ossalacetato. Sono necessarie , quindi, delle reazioni che abbiano il compito di formare ossalacetato ed intermedi del ciclo di Krebs (reazioni anaplerotiche o di riempimento). Un’importante reazione anaplerotica è quella che porta alla formazione di ossalacetato da piruvato e anidride carbonica (carbossilazione del piruvato). La reazione viene catalizzata dall’enzima piruvato carbossilasi e richiede l’idrolisi di una molecola di ATP.

COOH

C O

CH3 CH2

COOH

COOH C O

CO2

ossalacetatopiruvato

piruvato carbossilasi

ATP ADP

Quindi ambedue i substrati di partenza del ciclo di Krebs (ossalacetato ed acetil- CoA) possono formarsi dal piruvato (decarbossilazione ossidativa del piruvato o carbossilazione del piruvato).

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E’ significativo che l’attività della piruvato carbossilasi sia stimolata dall’acetil- CoA, cioè dal metabolita che deve essere ossidato nel ciclo di Krebs con l’ausilio dell’ossalacetato.

CO2

CO2

CO2CO2

NADH+H +

NADH+H+

NADH+H+

FADH 2

GTP

PIRUVATO

Acetil-CoAOssalacetato +

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Capitolo IV

Catena di trasporto degli elettroni mitocondriale

e fosforilazione ossidativa

1) La riossidazione del NAD ridotto e la sintesi di ATP 2) Il potenziale di ossido-riduzione standard 3) I componenti della catena respiratoria 4) Il complesso II e gli altri punti di ingresso della catena respiratoria 5) La fosforilazione ossidativa e la teoria chemiosmotica 6) ATP sintasi o FoF1 ATPasi 7) Il rapporto P:O 8) Controllo respiratorio 9) Inibitori e disaccoppianti 10) Proteine disaccoppianti 11) Il genoma mitocondriale 12) La teoria dell’origine endosimbiotica dei mitocondri 1) La riossidazione del NAD ridotto e la sintesi di ATP. Come abbiamo visto nei capitoli precedenti, uno dei meccanismi fondamentali del catabolismo ossidativo è la formazione di NAD ridotto (NADH+H+) durante la deidrogenazione di intermedi metabolici. La successiva riossidazione del NAD ridotto in un processo che richiede ossigeno (catena di trasporto degli elettroni mitocondriale) fornisce l’energia per uno dei meccanismi principali di sintesi dell’ATP (fosforilazione ossidativa). La riossidazione del NAD ridotto (NADH+H+) avviene mediante trasferimento degli idrogeni all’ossigeno con formazione di acqua.

NADH+H++1/2 O2 NAD++H2O

Si tratta, quindi, di una reazione di ossido-riduzione nel corso della quale viene riossidato il NAD (da NADH+H+ a NAD

+ ) e l’ossigeno (1/2O2) viene ridotto ad

acqua. (reazioni di ossido-riduzione = reazioni di trasferimento di elettroni).

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2) Il potenziale di ossido- riduzione standard E’ possibile calcolare quanta energia viene liberata in una reazione di ossido- riduzione, come la riossidazione del NAD? Per rispondere a questa domanda introduciamo alcuni semplici concetti di elettrochimica. Innanzitutto in una reazione di ossidoriduzione possiamo individuare due coppie redox dove per coppia redox si intende un elemento o un composto sia nella forma ossidata che nella forma ridotta. Nel caso della reazione di riossidazione del NAD con ossigeno le due coppie redox saranno:

NADH+H++ ½ O2 NAD++H2O Ogni coppia redox può essere caratterizzata da un valore chiamato “potenziale di ossidoriduzione standard”. Il potenziale di ossidoriduzione standard (in biochimica viene calcolato a 25°C e a pH 7 ed indicato con il simbolo E'o) indica la tendenza di una coppia redox a cedere o ad acquistare elettroni. Non si tratta di un valore assoluto, ma di un valore relativo. Per costruire una scala di potenziali di ossido riduzione per tutte le coppie redox è stata scelta una coppia redox di riferimento alla quale è stato assegnato il valore 0. Tale coppia di riferimento è la coppia redox dell'idrogeno (elettrodo ad idrogeno).

H+ + e- 1/2 H2 (Pt)

Potenziale di ossido-riduzione standard (E’o): differenza di potenziale tra la semicella di prova contenete concentrazione 1M della coppia redox in esame e la semicella di riferimento (elettrodo ad idrogeno). In biochimica: E’o a 25°C e a pH7. Tanto più negativo è il potenziale di ossido-riduzione tanto maggiore sarà la tendenza a cedere elettroni. La coppia redox NADH+H+ NAD+ ha un potenziale redox standard di:

- 0,32 Volt. L’altra coppia redox H2O ½ O2 ha un potenziale redox standard di:

+ 0,82 Volt.

NAD+ / NADH + H+1/2 O2 / H2O

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Tra le due Coppie Redox c’è una differenza di 1,14Volt:+ 0,82 Volt. – (- 0,32 Volt.) = E°’1,14 Volt.

In definitiva gli elettroni scorreranno dal componente con potenziale redox più negativo (NADH+H

+ -0.32 volt) a quello con potenziale più positivo (O2 + 0.82

volt). Conoscendo il ∆E’o è possibile calcolare la variazione di energia libera standard (∆G°) associata al flusso di elettroni dal NAD all’ossigeno. Il valore E1,14 volt corrisponde ad un G di - 52.11 Kcal per mole di NADH riossidato. La formula che mette in relazione ∆G° e ∆E° è la seguente:

G°= -n F dove n indica il numero di elettroni coinvolti nella reazione di ossido-riduzione e F è la costante di Faraday. E’ stato dimostrato sperimentalmente che l’energia liberata durante il trasferimento di 2 elettroni dal NADH+H

+ all’ossigeno (52.11 Kcal) permette la sintesi di 3

molecole di ATP (energia: 3 X 7.5 Kcal= 22.5 Kcal). Pertanto la resa del processo di fosforilazione ossidativa risulta del 43% (22.5 / 52.11 X 100). E’ importante chiarire che non si tratta di un trasferimento diretto degli elettroni dal NADH+H+ all’ossigeno: in realtà tra il NADH+H+ e l’ossigeno sono interposte una serie di coppie redox (trasportatori di elettroni) a potenziale redox progressivamente crescente. Il salto di potenziale redox di 1.14 volt è quindi suddiviso in una serie di salti minori e l’energia viene liberata gradualmente durante il trasporto degli elettroni lungo questa sequenza di coppie redox. Questa serie di coppie redox a potenziale crescente che permette il flusso degli elettroni dal NAD ridotto (o come vedremo più avanti dal FAD ridotto e da altri substrati) fino all’ossigeno viene chiamata “catena di trasporto degli elettroni mitocondriale” o “catena respiratoria mitocondriale”. Considerando, infatti, il consumo di ossigeno (che viene ridotto in acqua) la catena respiratoria rappresenta l’essenza del fenomeno della respirazione cellulare (consumo di ossigeno). 3) I componenti della catena respiratoria. La catena respiratoria è formata da una serie di trasportatori di elettroni, a potenziale redox crescente, localizzati nella membrana mitocondriale interna e deputati al trasferimento degli elettroni dal NAD ridotto e dal FADH2 all’ossigeno con formazione di acqua. L’energia liberata durante questo trasferimento di

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elettroni viene utilizzata per la sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa), per il trasporto di ioni e metaboliti o dispersa sotto forma di calore. Tra i componenti della catena respiratoria possiamo distinguere: i complessi lipoproteici (complessi I, II, III, IV) e i componenti mobili (coenzima Q e citocromo C)

COMPLESSO I Trasferisce gli elettroni dal NAD ridotto (che si è formato nelle reazioni deidrogenasiche del metabolismo: vedi glicolisi, decarbossilazione ossidativa del piruvato, ciclo di Krebs, beta ossidazione degli acidi grassi) al coenzima Q.

NADH+H + + CoQ NAD

+ + CoQH2

Questo complesso enzimatico localizzato nello spessore della membrana mitocondriale interna (detto anche NADH+H+ deidrogenasi o NADH+H+: CoQ riduttasi) è formato da numerosi polipeptidi e contiene come centri redox il flavin mononucleotide (FMN) e dei centri ferro-zolfo. Il complesso I occupa l’intero spessore della membrana mitocondriale interna, ma possiede il sito di legame per il NADH+H+ rivolto verso la matrice mitocondriale, così da poter interagire con il NAD ridotto prodotto dalle varie reazioni deidrogenasiche che hanno luogo nella matrice mitocondriale (vedi decarbossilazione ossidativa del piruvato, ciclo di Krebs, beta ossidazione degli acidi grassi). La NADH+H+ deidrogenasi riceve gli elettroni dal NAD ridotto mitcondriale e li trasferisce al FMN che a sua volta li cede ai centri ferro-solfo . Gli ioni ferro partecipano al trasferimento degli elettroni passando dalla forma ossidata (Fe++) alla forma ridotta (Fe+++)

COENZIMA Q o UBICHINONE. E’ un chinone (dichetone ciclico) liposolubile dotato di una lunga catena laterale isoprenoide formata nei mammiferi da 10 unità isopreniche (ogni unità isoprenica è formata da 5 atomi di carbonio). Per tale motivo è anche indicato come Q10. Grazie a questa lunga catena laterale alifatica, idrofobica e non ancorata a proteine, l’ubichinone gode di ampia mobilità nello spessore della membrana mitocondriale interna (componente mobile). Può interagire con il complesso I (e con altri complessi, come vedremo più avanti) accettando elettroni e riducendosi ( ubiquinolo: forma ridotta o idrochinonica) e successivamente, può riossidarsi cedendo gli elettroni al complesso III. Il coenzima Q funge da collettore di tutti gli equivalenti riducenti mitocondriali.

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Il prefisso ubi (dal latino ubique dappertutto) indica la sua presenza in tutti gli organismi che respirano.

CO CH2

CH3CO O

O

CH

CH3 CH2C

H3

H3 10

Coenzima Q (CoQ) o ubiquinone forma ossidata o chinonica

CO

CH3CO OH

R OH

H3

H3

Coenzima QH2 o ubiquinolo forma ridotta o idrochinonica

CITOCROMI

I citocromi sono componenti della catena respiratoria che trasportano in serie gli elettroni dal CoQ all’ossigeno. Sono proteine coniugate, cioè formate da una porzione proteica e da una porzione non-proteica. La porzione non proteica dei citocromi è rappresentata da un gruppo eme A sua volta il gruppo eme è formato da una porfirina (composto ciclico formato da 4 anelli pirrolici legati fra di loro e da diversi sostituenti angolari) e da un atomo di ferro legato agli azoti degli anelli pirrolici.

CITOCROMO

PORZIONE PROTEICA

GRUPPO EME

PORFIRINA

FERRO

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CH2

N

CH

CH N

CH

N

CH N CH3

CH2CH2COOH

CH2CH2COOHCH3

CH

Fe

CH3 CH CH2

CH3

N H

GRUPPO EME

pirrolo

A differenza delle emoproteine che trasportano l’ossigeno (emoglobina e mioglobina) nelle quali il ferro è sempre allo stato ridotto, il ferro dei citocromi può accettare e cedere un elettrone oscillando reversibilmente tra lo stato ridotto (Fe

++ , ferro bivalente, ferroeme, stato ridotto, forma ferrosa) e lo stato ossidato

(Fe +++

, ferro trivalente, ferrieme, stato ossidato, forma ferrica). I citocromi sono, quindi, dei trasportatori di elettroni singoli. Per ogni molecola di CoQH2 da riossidare è quindi necessaria una coppia di citocromi. Si distinguono diversi citocromi (indicati con lettere minuscole) che differiscono:

a) per la porzione proteica; b) per la struttura del gruppo eme (sostituenti laterali dell’anello porfirinico:

eme a, eme b, eme c); c) per i legami tra gruppo eme e proteina.

I seguenti citocromi fanno parte della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale: nel complesso III → citocromo b566, citocromo b562, citocromo c1 componente mobile → citocromo c nel complesso IV → citocromo a, citocromo a3 Esistono altri citocromi che non fanno parte della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale, ma che intervengono in altri processi metabolici (es.: citocromi P450, citocromo b5).

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porzione proteica

gruppo eme

FERRO

PIRROLO

ponti metinici che legano i 4 anelli pirrolici

FERRO

Struttura del gruppo

eme

Struttura del

citocromo

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COMPLESSO III Trasferisce gli elettroni dal coenzima Q ridotto al citocromo c. Viene chiamato anche citocromo C reduttasi.

CoQH2 + 2cit c (Fe +++

) CoQ + 2cit c (Fe ++

) Il complesso III contiene diverse coppie redox: i citocromi b566 e b562, un centro ferro-zolfo, ed il citocromo c1.

CITOCROMO C Il citocromo c rappresenta il secondo componente mobile della catena respiratoria e trasferisce gli elettroni dal complesso III al complesso IV. E’ il più piccolo tra i citocromi (la sua catena proteica è formata da 104 aminoacidi) e, come tutti i citocromi, contiene un gruppo eme. I sei legami coordinativi del ferro del gruppo eme sono così impegnati: 4 legami con gli azoti degli anelli pirrolici della porfirina, i rimanenti 2 legami con residui aminoacidici della porzione proteica (istidina 18 e metionina 80). Il ferro del citocromo c non ha quindi legami coordinativi liberi e, a differenza dell’’emoglobina, non può legare ossigeno. Il citocromo c è localizzato sulla superficie esterna della membrana mitocondriale interna a cui è legato con legami deboli. Si tratta, dunque, di una proteina periferica o estrinseca di membrana (gli altri citocromi fanno parte dei complessi lipoproteici di membrana formati da proteine intrinsenche di membrana, cioè proteine immerse nello spessore della membrana).

COMPLESSO IV Il complesso IV trasferisce gli elettroni dal citocromo c all’ossigeno con formazione di acqua. Viene anche chiamato citocromo C ossidasi (Cox).

4 cit c (Fe ++

) + O2 4 cit c (Fe +++

) + 2 H2O Contiene come coppie redox 2 citocromi (citocromo a e citocromo a3) e 2 atomi di rame (CuA e CuB). Il complesso binucleare citocromo a3 e CuB reagisce con l’ossigeno. Questi due citocromi, in particolare il cit.a3, differiscono sostanzialmente dai precedenti: la struttura proteica dei citocromi b,c e c1 consente di schermare l’atomo di Ferro presente all’interno della struttura porfirinica in modo che non riesca a reagire con l’ossigeno. Il citocromo a3 deve invece poter reagire con l’ossigeno, l’accettore finale di elettroni della catena respiratoria.

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In breve gli elettroni vengono trasportati dal complesso I al complesso III mediante il coenzima Q e dal complesso III al complesso IV mediante il citocromo c. Ogni volta che una coppia di elettroni attraversa uno dei complessi (complesso I, III, IV) il salto di potenziale redox rilascia energia libera sufficiente per promuovere la sintesi di una molecola di ATP.

MMI

spazio intermembrana

Matrice

I

III

CoQ

Cit.C

IV

NADH+H+ NAD+

H+ H+ H+

½O2+2H+ H2O

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4) Il complesso II e gli altri punti di ingresso della catena respiratoria. Oltre alla NADH+H+ deidrogenasi FMN dipendente, un’altra deidrognasi convoglia elettroni al CoQ riducendolo. Questa deidrogenasi è un enzima del ciclo di Krebs, la succinato deidrogenasi FAD-dipendente, enzima che catalizza la deidrogenazione del succinato in fumarato.

Succinato + CoQ Fumarato + CoQH2

COMPLESSO I

CoQH2 CoQ

COMPLESSO III

NADH+H+ NAD+

2 cit c(Fe3+)2 cit c (Fe2+)

COMPLESSO IV

½ O2 H2O

POTENZIALI REDOX STANDARD

-0.32 V

+0.05 V

+0.25 V

+0.82 V

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E’ il solo enzima del ciclo di Krebs ad essere legato alla membrana mitocondriale interna. Contiene una molecola di FAD, dei centri ferro-zolfo e un citocromo (b560). Gli elettroni passano dal succinato al FAD e poi attraverso i centri Fe-S ed il citocromo all’ubichinone. Diversamente dai complessi I-III-IV il complesso II non presenta attività di pompa protonica ed il potenziale redox della coppia succinato/ fumarato è più positivo (+0.03) rispetto alla coppia NADH/NAD+. Quindi il trasferimento di elettroni da una mole di succinato (o di FADH2) fino all’ossigeno tramite i complessi II-III-IV fornirà l’energia per la sintesi di 2 moli di ATP. Esistono altri complessi che permettono il trasferimento di elettroni da substrati metabolici al coenzima Q, senza però presentare attività di pompa protonica:

1) Acil-CoA deidrogenasi. E’ primo enzima della beta-ossidazione (vedi lezione sull’argomento). E’ un enzima FAD-dipendente che viene poi riossidato da un altro enzima FAD-dipendente, la “electron trasferring flavoprotein” (ETFP). La ETFP, tramite un centro ferro-solfo, trasferisce gli elettroni al Coenzima Q.

2) Glicerolo-3-fosfato deidrogenasi FAD-dipendente mitocondriale. E’ un enzima localizzato nella membrana mitocondriale interna, ma con il sito catalitico che lega il glicerofosfato rivolto verso lo spazio intermembrana. Fa parte di uno dei sistemi shuttle per il trasporto degli equivalenti riducenti dal citosol al mitocondrio.

Quindi il coenzima Q rappresenta un punto di convergenza per l’ingresso nella catena respiratoria di elettroni provenienti da diversi substrati.

H+ H+ H+

I

Succinato fumarato

NADH+H+ NAD+

III

CoQ

Cit.C

IV

½O2+2H+ H2O

II

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fumarato

COMPLESSO II FAD, Fe-S, cit

COMPLESSO I FMN, Fe-S

CoQH2 CoQ

COMPLESSO III cit b, cit c1, Fe-S

NADH+H+ NAD+

2 cit c (Fe+++)

2 cit c (Fe++)

COMPLESSO IV CuA, Cit a, Cit a3,

CuB Cua, CuB

½ O2 H2O

succinato

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5) La fosforilazione ossidativa e la teoria chemiosmotica. Nei mitocondri la sintesi dell’ATP da ADP e Pi è catalizzata da un altro complesso proteico della membrana interna: il complesso V o ATP sintasi. L’energia liberata durante il trasporto degli elettroni attraverso i complessi I-IV deve essere trasferita in una forma utilizzabile dall’ATP sintasi. Si parla di un accoppiamento energetico tra trasporto degli elettroni nella catena respiratoria e la sintesi di ATP a livello dell’ATP sintasi. Il meccanismo più accreditato è quello descritto nella cosiddetta “teoria chemiosmotica”. elaborata da Peter Mitchell, il quale ha ricevuto per i suoi lavori il premio Nobel per la chimica nel 1978. Tale teoria sostiene che l’energia liberata durante il trasporto degli elettroni viene utilizzata per pompare idrogenioni (H

+ o protoni) dalla matrice mitocondriale allo

spazio intermembrana. Si crea così, una differenza nella concentrazione di protoni nelle zone adiacenti i due lati della membrana mitocondriale interna: la zona della matrice presenta una concentrazione protonica più bassa rispetto al lato citosolico della membrana mitocondriale interna. Si dice che si è stabilito un gradiente elettrochimico di H

+ (protoni) tra i due lati della membrana mitocondriale interna.

L’energia conservata in questo gradiente è formata da due componenti (come indicato dal termine “elettrochimico”):

1) una componente è l’energia potenziale chimica associata alla differenza di concentrazione della specie chimica H

+ tra le due regioni separate dalla

membrana; 2) la seconda componente è la differenza di potenziale elettrico tra i due lati

della membrana dovuta al fatto che la specie chimica, con differente concentrazione tra i due lati della membrana, è uno ione e presenta una carica positiva.

Ricordiamo che la concentrazione degli H + , idrogenioni, viene misurata in unità di

pH. Il pH è il logaritmo negativo della concentrazione idrogenionica. Il gradiente elettrochimico protonico ha dunque 2 componenti:

il ∆pH, la differenza di pH tra le due regioni separate dalla membrana mitocondriale interna (matrice più alcalina)

il ∆ψ, la differenza di potenziale elettrico tra i due lati della membrana mitocondriale interna (matrice più negativa).

L’energia libera conservata sotto forma di un gradiente elettrochimico protonico (detta anche forza motrice protonica) verrà successivamente utilizzata per sintetizzare ATP mediante l’ATP sintasi. I complessi I, III, IV possono essere considerati delle vere pompe protoniche che utilizzano l’energia liberata dal trasporto degli elettroni per pompare contro gradiente protoni dalla matrice allo spazio intermembrana.

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6) ATP sintasi o FoF1 ATPasi. L’ATP sintasi, conosciuta anche come FoF1 ATPasi, è una proteina transmembrana (della membrana mitocondriale interna) costituita da due unità funzionali: una porzione Fo che attraversa l’intero spessore della membrana (Fo significa fattore che lega l’antibiotico oligomicina) e una porzione globulare F1che sporge nella matrice mitocondriale (vedi figura). Fo è un canale protonico transmembrana, mentre F1 è una proteina periferica di membrana che contiene i siti catalitici per la sintesi di ATP rivolti verso la matrice. La componente F1 è associata alla componente Fo per mezzo di uno stelo proteico. I corpi sferoidali, osservabili in microscopia elettronica, sulla superficie interna della membrana mitocondriale interna sono le porzioni F1. La forza motrice protonica (o gradiente elettrochimico protonico), precedentemente formata durante il trasporto di elettroni nella catena respiratoria, permette un movimento di protoni a favore di gradiente lungo il canale rappresentato dalla porzione Fo (la membrana mitocondriale interna non è permeabile ai protoni). Il passaggio di protoni lungo la porzione Fo provoca un cambiamento di conformazione nella porzione F1 che determina la sintesi di ATP.

F1

V Fo

I

III

CoQ

Cit.C

IV

Succinato fumarato

½ O2 +2H+ H2O

II

NADH+H+ NAD+

3ADP+ 3Pi 3ATP

+ + + + + + + + + + + +

+ + + + + + +

Spazio intermembrana

MATRICE

-- - - - - -- - - - - - - - -

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È possibile dissociare in provetta la porzione F1 dalla porzione Fo mediante un trattamento con urea. F1 dissociato da Fo non è in grado di sintetizzare ATP, ma lo idrolizza: per questo motivo la proteina F1 è stata anche chiamata ATPasi mitocondriale. 7) Il rapporto P:O. Il rapporto P:O indica il numero di molecole di fosfato inorganico (P) che vengono incorporate nell’ADP (per formare ATP) per ogni atomo di ossigeno che viene ridotto ad acqua. Nel caso della riossidazione del NADH il rapporto P:O è uguale a 3, cioè 3 moli di ATP si formano per mole di NAD riossidato. L’ossidazione del succinato e degli altri substrati (glicerofosfato, acilCoA) che cedono gli elettroni al CoQ attraverso i rispettivi complessi (complesso II, glicerolofosfato deidrogenasi, acilCoA deidrogenasi e ETFP) producono un P:O di 2. Nel corso di queste lezioni abbiamo utilizzato i valori classici del rapporto P:O cioè 3 ATP formati per mole di NADH riossidato e 2 ATP per mole di FADH2 riossidato. Alcuni dati attualmente disponibili indicano che questi valori andrebbero rivisti e suggeriscono 2,5 ATP per il NAD e 1,5 ATP per il FAD. Con i nuovi valori dall’ossidazione completa di una mole di glucosio (attraverso la glicolisi, la decarbossilazione ossidativa del piruvato, il ciclo di Krebs e la fosforilazione ossidativa) si otterrebbero 32 ATP (anziché 38 come calcolato con i valori classici). In questo corso continueremo ad utilizzare i valori classici per il calcolo del bilancio energetico delle vie metaboliche, ma ricordatevi che questi valori sono in discussione. 8) Controllo respiratorio. In condizioni fisiologiche il trasporto degli elettroni è strettamente accoppiato alla sintesi dell’ATP. Non si ha trasporto degli elettroni e consumo di ossigeno nella catena respiratoria se contemporaneamente l’ADP non viene fosforilato ad ATP. Questo stretto accoppiamento è rivelato dal fatto che la velocità di consumo di ossigeno di una sospensione mitocondriale dipende dalle concentrazioni di ADP disponibile per la fosforilazione. Se tutto l’ADP è stato convertito in ATP il consumo di ossigeno diminuisce drasticamente. Nei mitocondri isolati è possibile misurare il consumo di ossigeno mediante l’ossigrafo, un apparecchio dotato di un elettrodo sensibile alle variazioni della concentrazione di ossigeno. Nel grafico (a) sono riportati i valori sperimentali del consumo di ossigeno in mitocondri incubati con substrato ossidabile e fosfato: il consumo di ossigeno è scarso come si evince dalla lieve pendenza della curva. Quando si aggiunge ADP la velocità del consumo di ossigeno aumenta (forte

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pendenza della curva) per rallentare nuovamente quando tutto l’ADP è stato fosforilato in ATP. Ulteriori aggiunte di ADP provocano una risposta analoga alla precedente.

Si chiama indice di controllo respiratorio il rapporto tra la velocità di consumo di ossigeno in presenza di ADP e la velocità in assenza di ADP.

. Attraverso la traccia ossigrafica è possibile misurare il consumo di ossigeno un minuto prima e un minuto dopo l’aggiunta di ADP, ovvero in assenza ( stato 2 0 4) e in presenza (stato 3) di ADP. L’indice di controllo respiratorio equivale al rapporto tra la velocità del consumo di O2 in stato 3 e la velocità del consumo di O2 in stato 4:

Indice Controllo Respiratorio = velocità respiratoria velocità respiratoria (Stato 4)

(Stato 3)

Stati respiratori

0

470

tempo

re sp

ira zi

on e

(in cu

ba zi

on e

nm ol

O /m

l)

Un alto valore dell’indice di controllo respiratorio indica un buon accoppiamento mitocondriale. In genere più elevato è questo indice, maggiore è l’efficienza fosforilativa dei mitocondri e più stretto l’accoppiamento tra processo ossidativo e fosforilativo.

1 2

4

3

4

5

mitocondri succinato

500 nmol ADP

Esaurimento ADP

anossia

o

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Per definire l’indice di controllo respiratorio abbiamo utilizzato le definizioni di stato 3 e stato 4. Questa terminologia è stata introdotta per identificare le possibili condizioni sperimentali di una sospensione mitocondriale durante gli esperimenti di consumo di ossigeno. Ecco schematicamente il significato degli altri stati: Stato 1: mitocondri isolati in presenza di fosfato ma senza substrato Stato 2: viene aggiunto il substrato (la respirazione resta bassa a causa della mancanza di ADP) Stato 3: viene aggiunto l’ADP (respirazione rapida) Stato 4: tutto l’ADP è stato convertito ad ATP (la respirazione rallenta) Stato 5: anossia (è stato consumato tutto l’ossigeno) Vedremo nei prossimi paragrafi come il livello di accoppiamento mitocondriale si può abbassare fino all’abolizione del controllo respiratorio (ICR=0): in presenza di agenti disaccoppianti il consumo di ossigeno procede a velocità massimale senza sintesi di ATP. 9) Inibitori e disaccoppianti. Inibitori sito-specifici del trasporto di elettroni. Ricordiamo alcuni esempi di composti chimici in grado di bloccare il trasporto di elettroni (e quindi il consumo di ossigeno e la sintesi di ATP) a livello della catena respiratoria:

il rotenone, una tossina vegetale usata dagli Indiani dell’Amazzonia per avvelenare i pesci, blocca il trasporto degli elettroni nel complesso I;

il cianuro blocca il trasporto nel complesso IV. Inibitori di FoF1 ATPasi Un caso interessante dal punto di vista sperimentale è rappresentato dall’azione della tossina naturale oligomicina. Questa molecola si lega a Fo (la o che segue la F nella sigla indica proprio l’oligomicina) e blocca il passaggio dei protoni attraverso Fo e quindi la sintesi di ATP. Il gradiente elettrochimico, che non viene consumato, raggiunge un valore massimale, oltre al quale l’attività delle pompe protoniche, il trasporto di elettroni ed il consumo di ossigeno si arrestano. Agenti disaccoppianti. Gli agenti disaccopppianti bloccano la sintesi di ATP, ma non il trasporto di elettroni ed il relativo consumo di ossigeno, che continua a velocità massimale. La teoria chemiosmotica fornisce una spiegazione razionale del meccanismo di azione dei disaccoppianti. Alcune di queste molecole (ad esempio il dinitrofenolo) sono infatti dei protonofori, sono cioè in grado di trasportare protoni attraverso la membrana mitocondriale interna. Rendendo la membrana permeabile ai protoni

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provocano una dissipazione del gradiente elettrochimico senza sintesi di ATP. Il trasporto di elettroni continua a velocità massimale ma l’energia viene dispersa sotto forma di calore. Gli effetti disaccoppianti degli ionofori possono essere considerati una delle prove sperimentali a favore del meccanismo chemio-osmotico della fosforilazione ossidativa. 10) Proteine disaccoppianti. Oggi conosciamo delle proteine endogene (cioè prodotte nel nostro organismo) che sono in grado di provocare un disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa (disaccoppiamento del trasporto degli elettroni dalla sintesi di ATP) simile a quello provocato dagli agenti disaccoppianti esogeni. In realtà si tratta di una famiglia di proteine chiamate proteine disaccoppianti (in sigla UCP dall’inglese uncoupling protein). Le proteine più note di questa famiglia sono tre:

UCP1 o termogenina che si trova nel cosiddetto grasso bruno; UCP2 espressa in diversi tessuti; UCP3 espressa in maniera predominante nel muscolo scheletrico.

Diamo qualche informazione in più sulla termogenina o UCP1. La funzione del tessuto adiposo bruno (grasso bruno) è quella di generare calore. Questo tessuto è diverso dal tipico tessuto adiposo (bianco) in quanto contiene numerosi mitocondri i cui citocromi conferiscono la caratteristica colorazione scura. I mammiferi appena nati che sono privi di pelliccia, come gli uomini, e i mammiferi che vanno in letargo sono caratterizzati dalla presenza, nella regione del collo e nella parte superiore della schiena, di grasso bruno che genera calore mediante termogenesi non da brividi (l' idrolisi dell' ATP durante la contrazione muscolare causata dai brividi produce anch' essa calore). Il meccanismo di generazione del calore nel tessuto adiposo bruno richiede il disaccoppiamento regolato della fosforilazione ossidativa. I mitocondri del grasso bruno contengono

UCP-2 varr ii tt essutt ii

UCP-1 ttessutt o adii poso brr uno

UCP-3 muscoll ii

schell ett rr ii cii e tt essutt o

adii poso brr uno

Proteine disaccoppianti

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un canale per i protoni conosciuto con il nome di proteina disaccoppiante (UCP1, chiamata anche termogenina), una proteina assente nei mitocondri degli altri tessuti. Negli animali adattati al freddo, l'UCP costituisce nel grasso bruno fino al 15% delle proteine presenti nella membrana mitocondriale interna. Il flusso dei protoni attraverso l'UCP viene inibito da concentrazioni fisiologiche di nucleotidi purinici (ADP, ATP, GDP, GTP), ma questa inibizione può essere rimossa dagli acidi grassi liberi. Nei mitocondri del grasso bruno la termogenesi è sotto controllo ormonale. La noradrenalina stimola la produzione del secondo messaggero cAMP e quindi attiva la proteina chinasi cAMP dipendente. La chinasi successivamente attiva la triacilglicerolo lipasi ormone sensibile fosforilandola. La lipasi attivata idrolizza i trigliceridi per ottenere acidi grassi liberi che vanno a contrastare l' effetto inibitorio dei nucleoti purinici sull' UCP. Il risultante flusso di protoni attraverso l'UCP porta alla dissipazione del gradiente protonico presente attraverso la membrana mitocondriale interna. Questo processo consente all'ossidazione del substrato di procedere (e di generare calore) senza sintesi di ATP.

11) Il genoma mitocondriale.

I mitocondri contengono un loro genoma, costituito da una molecola di DNA circolare a doppia elica di 16569 paia di basi. Nel genoma mitocondriale dell’uomo vi sono 37 geni , compresi 13 che codificano per proteine della catena respiratoria.

I Q

II

Cit C III

IV

V

UCP

H+ H+ H+ H+

H+ H+ H+ H+

accoppiamento disaccoppiamento

H+ H+

H+ ADP+Pi ATP OH-

Fosforilazione ossidativa CALORE

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I geni rimanenti codificano per RNA ribosomiali ed RNA transfer essenziali per l’apparato di sintesi proteica dei mitocondri. Molte delle proteine mitocondriali sono codificate da geni nel nucleo e sono sintetizzate da ribosomi citoplasmatici e successivamente importate nei mitocondri. Sono note mutazioni del DNA mitocondriale che provocano malattie nell’uomo (ad es. la neuropatia ottica ereditaria di Leber che provoca perdita bilaterale della visione). Le malattie da mutazione del DNA mitocondriale presentano una modalità caratteristica di trasmissione ereditaria: sono malattie ad ereditarietà materna. La patologia viene trasmessa dalla madre come conseguenza del fatto che tutti i mitocondri dell’embrione sono derivati dalla madre. Il numero di mitocondri nell’oocita è di gran lunga maggiore che nello spermatozoo. Sembra inoltre che i mitocondri dello spermatozoo non entrino nell’oocita al momento della fecondazione. 12) La teoria dell’origine endosimbiotica dei mitocondri. Questa ipotesi presuppone che i primi organismi con un metabolismo aerobico completamente funzionante, cioè compresa la sintesi di ATP associata alla respirazione (fosforilazione ossidativa), fossero dei procarioti (batteri). Gli eucarioti primitivi che vivevano anaerobicamente acquisirono la capacità di utilizzare la fosforilazione ossidativa quando stabilirono delle relazioni simbiotiche con batteri che erano penetrati nel loro citosol. Il fatto che i mitocondri contengano un loro DNA ed un apparato di sintesi proteica è in favore della teoria. Le sequenze del DNA mitocondriale sono molto simili a quelle del genoma di certi batteri aerobici ed i ribosomi mitocondriali hanno dimensioni, struttura e sequenze dell’RNA ribosomiale più simili a quelli dei batteri che ai ribosomi presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche. Inoltre numerosi enzimi mitocondriali ricordano quelli dei batteri.

Se i mitocondri sono i discendenti degli endosimbionti primitivi, numerosi geni del progenitore devono essersi trasferiti dal DNA mitocondriale al DNA nucleare dell’eucariota ospite nel corso dell’evoluzione. Infatti i mitocondri non contengono tutti i geni necessari a specificare tutte le loro proteine; molte di esse sono codificate dal DNA nucleare, vengono tradotte da ribosomi citoplasmatici e importate nei mitocondri.

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Capitolo V

I radicali liberi

1) Introduzione 2) Riduzione completa dell’ossigeno 3) Le forme parzialmente ridotte dell’ossigeno 4) Formazione dei radicali liberi nei mitocondri e negli eritrociti 5) Reazioni chimiche innescate dall’anione superossido nei tessuti: la

dismutazione, la reazione di Haber Weiss, la reazione di Fenton 6) Reazioni innescate dal radicale idrossile nelle membrane cellulari: la

lipoperossidazione 7) Sistemi di difesa enzimatici 8) La vitamina E 9) I radicali liberi nei processi infiammatori

1) Introduzione I radicali liberi sono atomi o molecole con un elettrone spaiato nell’orbitale esterno. Un orbitale può essere occupato da due elettroni e in questa condizione è saturo. Di norma atomi o molecole con orbitali non saturi, tendono a formare legami con altri atomi o molecole, condividendo gli elettroni mediante legame covalente, cedendo il proprio elettrone spaiato, oppure appropriandosi di un altro elettrone, a seconda della elettronegatività delle molecole interagenti (legame ionico). A causa della loro conformazione i radicali liberi sono molecole altamente reattive. Un radicale libero può essere elettricamente neutro, negativo o positivo e può partecipare alle reazioni ossidandosi (cedendo l’elettrone) o riducendosi (acquistando l’elettrone). L’ossigeno è un elemento che ha la tendenza a formare radicali liberi e data l’elevata elettronegatività, attira elettroni dando luogo alle forme ridotte dell’ossigeno, distinguibili in complete o parziali.

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2) Riduzione completa dell’ossigeno:

Riduzione tetravalente La riduzione tetravalente dell’ossigeno avviene normalmente alla fine della catena respiratoria e non dà luogo alla formazione di radicali liberi. La molecole di ossigeno, acquistando 4 elettroni, si lega facilmente con gli idrogenioni (H+) formando 2 molecole di acqua.

3) Le forme parzialmente ridotte dell’ossigeno

Riduzione monovalente L’ossigeno, acquistando un elettrone, diventa un radicale libero, l’anione superossido. La molecola con l’elettrone spaiato si indica con un puntino ad apice del simbolo chimico e poiché l’ossigeno è una molecola elettricamente neutra, con un elettrone in più assume carica negativa (anione, simbolo -).

Riduzione bivalente L’ossigeno, acquistando due elettroni, immediatamente si lega a due idrogenioni formando il perossido di idrogeno, più comunemente noto come acqua ossigenata. I perossidi sono molecole in cui due atomi di ossigeno sono legati in modo covalente tra loro e ciascun atomo di ossigeno è legato ad un’altra specie chimica. Se quest’ultima è l’idrogeno, otterremo il perossido di idrogeno o acqua ossigenata:

H-O-O-H

O2 + 4H+ + 4 e - 2 H2O

O2 + 1e - O2 .

O2 + 2 H+ + 2e - H2O2

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Tale molecola non è un radicale libero, però la sua presenza favorisce la formazione della specie più pericolosa tra i radicali liberi dell’ossigeno, il radicale idrossile.

Riduzione trivalente La molecola di ossigeno che acquista due elettroni, si scinde: un atomo accetta due elettroni e diventa l’anione ossidrile (OH-), una molecola carica elettricamente che non è un radicale libero, in quanto non presenta elettroni spaiati. Ricordiamo che nella configurazione dell’atomo di ossigeno, dei quattro orbitali esterni, due sono occupati da elettroni appaiati, mentre gli altri due sono occupati da un singolo elettrone. In tale forma l’ossigeno è elettricamente neutro ( numero di elettroni uguale al numero di protoni). Ricevendo i due elettroni, l’atomo di ossigeno completa gli orbitali, ma assume carica doppiamente negativa, quindi tenderà a legarsi con H+ , formando l’anione ossidrile. L’altro atomo di ossigeno accetta un elettrone, completa un orbitale e assume carica negativa che viene neutralizzata dal legame con un idrogenione: si forma quindi il radicale idrossile (.OH), elettricamente neutro ma radicale, in quanto presenta un elettrone spaiato. Questa, tra le specie dei radicali, è la più pericolosa e con maggiore reattività chimica; reagisce, infatti, con tutte le principali macromolecole organiche danneggiandone la struttura. E’ definita pertanto una specie “killer”.

H

.O H configurazione esterna dell'atomo di ossigeno con celle (orbita li) e freccette (ele ttroni): a) riceve 2 elettroni e un protone (idrogenione) e forma l'anione ossidrile; b) riceve 1 elettrone e un protone (idrogenione) e forma il radica le idrossile.

O H -

H a)

b)

anione ossidrile

radicale idrossile

O2 + 2H+ + 3e - OH- + .OH

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4) Formazione dei radicali liberi nei mitocondri e negli eritrociti -Mitocondri- La maggior parte dell’ossigeno utilizzato nei processi metabolici mitocondriali , va incontro a riduzione completa dando luogo alla formazione di molecole di acqua. Tuttavia, una piccola quota di ossigeno (1-3%), può ridursi parzialmente. Le forme parzialmente ridotte dell’ossigeno si formano per perdita (leakage) di elettroni durante il trasporto nella catena respiratoria. In particolare tale perdita avviene a livello del coenzima Q (ubichinone) che può reagire con l’ossigeno molecolare. In larga misura, la struttura molecolare del coenzima Q impedisce questo fenomeno e trasferisce correttamente gli elettroni al complesso III, ma a volte degli elettroni possono sfuggire e ridurre parzialmente l’ossigeno in modo monovalente formando l’anione superossido (O2

.). Questa fuga impedisce agli elettroni di essere correttamente inviati verso la citocromo ossidasi e di ridurre in modo tetravalente l’ossigeno, formando acqua. Nei tessuti con intensa attività metabolica e molti mitocondri (ad es. nel tessuto muscolare), la produzione di radicali liberi è elevata: si ipotizza, quindi, che, durante lo sforzo muscolare, si producano radicali liberi. Tuttavia, nei soggetti allenati, si dovrebbero sviluppare adeguati sistemi di difesa. -Eritrociti- Gli eritrociti, pur non avendo mitocondri e utilizzando quindi solo il sistema anaerobico, sono tra le cellule con la maggiore produzione di anioni superossidi. L’eritrocita è un sacchetto membranoso appiattito, a forma di disco biconcavo, nel cui interno è presente l’emoglobina, la molecola che trasporta l’ossigeno. Si ricorda che l’emoglobina contiene uno ione ferroso (in forma bivalente, Fe++) al centro dell’anello tetrapirrolico; la struttura molecolare che circonda lo ione Fe++ impedisce che quest’ultimo possa reagire con l’ossigeno nonostante la notevole affinità. In questo modo l’emoglobina trasporta l’ossigeno sotto forma di emoglobina ossigenata (e non ossidata). Tuttavia, la struttura molecolare che scherma il ferro può consentire, in minima quota (1-2%), un trasferimento di elettroni dal ferro all’ossigeno: l’ossigeno si riduce parzialmente formando l’anione superossido (O2

.), mentre il ferro viene ossidato nella forma trivalente Fe+++. L’emoglobina ossidata, detta metaemoglobina, non è in grado di trasportare l’ossigeno. L’eritocita viene dunque danneggiato sia a causa della formazione di anione superossido, sia perché non riesce più a trasportare l’ossigeno. Ma negli eritrociti si sono sviluppati adeguati sistemi di difesa contro i radicali liberi : l’enzima metaemoglobina reduttasi è in grado di ridurre il ferro nella forma bivalente e di rigenerare l’emoglobina, limitando così il danno da radicali liberi. Descriveremo più avanti gli enzimi che renderanno innocua la produzione di anione superossido.

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5) Reazioni chimiche innescate dall’anione superossido nei tessuti: la dismutazione, la reazione di Haber Weiss, la reazione di Fenton La formazione dell’anione superossido dà il via alla produzione della specie killer dei radicali dell’ossigeno, il radicale idrossile. Tale formazione avviene in seguito a una prima reazione, la dismutazione tra due molecole di anione superossido. Come sarà esaminato successivamente, il prodotto di tale reazione (perossido di idrogeno) può generare il radicale idrossile accettando un elettrone da un donatore diverso a seconda che avvenga la reazione di Haber-Weiss o la reazione di Fenton.

La dismutazione dell’anione superossido In generale la dismutazione è una reazione di ossido-riduzione tra due molecole uguali in cui una molecola si ossida (cede l’elettrone) e l’altra si riduce (acquista l’elettrone). La dismutazione dell’anione superossido è la reazione che avviene tra due molecole di anione superossido: una di queste molecole, cedendo l’elettrone, diventa O2; l’altra, accettando l’elettrone, si riduce in modo bivalente, formando il perossido di idrogeno H2O2 (acqua ossigenata).

Quindi la reazione di dismutazione conduce alla riduzione bivalente dell’ossigeno: è sufficiente che si formi anione superossido (riduzione monovalente dell’ossigeno) affinchè si generi perossido di idrogeno mediante dismutazione. La reazione di dismutazione è una reazione chimica ad alta velocità.

La reazione di Haber Weiss Il perossido di idrogeno formato in seguito alla dismutazione, reagisce con una molecola di anione superossido. E’ anche questa una reazione di ossido-riduzione in cui l’anione superossido cede l’elettrone alla molecola di perossido di idrogeno che, ricevendo l’elettrone, si divide in due molecole: lo ione ossidrile (OH-) e il radicale idrossile (.OH).

e-

O2 . + O2

. + 2H+ O2 + H2O2

e-

O2 . + H2O2 O2 + OH

- + .OH

79

La reazione di Haber Weiss conduce alla riduzione trivalente dell’ossigeno e quindi alla formazione del radicale idrossile, la specie pericolosa dei radicali liberi dell’ossigeno.

La reazione di Fenton La formazione del radicale idrossile può avvenire anche attraverso un’altra reazione, nella quale il donatore di elettroni al perossido di idrogeno è il ferro libero bivalente. In tale reazione, detta di Fenton, il ferro cede un elettrone al perossido di idrogeno passando così dalla forma bivalente (ferrosa) alla forma trivalente (ferrica). Anche in questo caso il perossido di idrogeno, ricevendo l’elettrone, si scinde in ione ossidrile e radicale idrossile. Alte concentrazioni di ferro libero o patologie quali l’emocromatosi (accumulo di ferro nei tessuti per un difetto genetico) possono causare danni da radicali liberi. La reazione di dismutazione dell’anione superossido è quindi la prima tappa a seguito della quale, attraverso la reazione di Haber Weiss o mediante la reazione di Fenton, si genera il radicale idrossile.

6) Reazioni innescate dal radicale idrossile nelle membrane cellulari: la lipoperossidazione. Il radicale idrossile può reagire con le molecole costituenti le membrane cellulari, in particolare, con le catene di acidi grassi insaturi presenti nei fosfolipidi. Il radicale idrossile stacca un atomo di idrogeno da un atomo di carbonio (gruppo metilenico) della catena di acido grasso (vedi figura, punto 1), formando così una molecola di acqua. La molecola dell’acido grasso è diventata un radicale in quanto, l’atomo di carbonio, privato dell’atomo di idrogeno, presenta un elettrone spaiato e questo conferisce alla molecola elevata reattività. Questa molecola, dopo essersi riarrangiata (2) a diene coniugato (due doppi legami separati da un legame singolo), reagisce con l’ossigeno presente ad elevate concentrazioni (3), formando così il radicale perossile (3): un atomo della molecola di ossigeno condivide l’elettrone (cioè forma un legame chimico) con il carbonio, mentre l’altro atomo di ossigeno rimane con un elettrone spaiato.

e-

Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH- + .OH

80

C H C H C HC

H

H

C H

OH 2 H

C H C H C C H C H

H

CC H C H C H C H

O 2

H

CC H C H C H

O O

C H

H

CC H C H C H

O O H

C H

O H.

.

.

.

a c id o g ra s s o p o lin s a tu ro

e s tra zio n e d i u n a to m o d i id ro g e n o

ra d ic a le l ib e ro d e ll'a c id o g ra s s o p o lin s a tu ro

r ia rra n g ia m e n to

d ie n e c o n iu g a to

ra d ic a le p e ro s s ile

id ro p e ro s s id o

p e ro s s id i c ic lic i e p ro d o tti v a r i d i d e c o m p o s iz io n e

ra d ic a le in iz ia to re1 )

2 )

3 )

4 )

5 )

81

Si è formato dunque un nuovo radicale altamente reattivo, che a sua volta può reagire con un altro acido grasso dei fosfolipidi delle membrane cellulari, staccando un atomo di idrogeno (freccia rossa 1!4) ed innescando un altro ciclo di lipoperossidazione. Il radicale perossile è diventato un idroperossido di acido grasso (4) La molecola di acido grasso che ha ceduto l’atomo di idrogeno è diventato un nuovo radicale che potrà ricominciare il ciclo di reazioni (a partire dalla 2) che conduce alla formazione di un altro idroperossido dell’acido grasso. In teoria, questa catena di reazioni potrebbe portare alla distruzione totale delle membrane cellulari (ricordiamo che gli acidi grassi fanno parte della struttura dei fosfolipidi di membrana) se non esistessero adeguati sistemi di difesa contro i radicali liberi

82

Gli idroperossidi sono gruppi polari e conferiscono caratteristiche polari alle catene degli acidi grassi dei fosfolipidi di membrana; le membrane cellulari perdono l’impermeabilità al passaggio di acqua e ioni garantita dalla presenza delle catene idrofobiche degli acidi grassi dei fosfolipidi: vengono così annullati i gradienti ionici elettrochimici generati dalle pompe ATP-asi di membrana. La membrana cellulare si disintegra e avviene la morte cellulare per lisi delle membrane.

7) Sistemi di difesa enzimatici

Enzima superossido dismutasi Il primo sistema di difesa enzimatica contro i radicali liberi dell’ossigeno utilizza l’enzima superossido dismutasi (SOD). Tale enzima accelera la reazione di dismutazione tra due molecole di anione superossido: questa reazione enzimatica potrebbe apparire paradossale perché è la stessa reazione chimica che avviene già ad alta velocità. In realtà, un’ulteriore accelerazione della dismutazione consente di eliminare velocemente l’anione superossido impedendogli di reagire con H2O2 e di generare il radicale idrossile. Inoltre, l’ossigeno prodotto dalla reazione catalizzata da SOD è l’ossigeno tripletto, una forma di O2 allo stato fondamentale che, a differenza della molecola di ossigeno generata nella reazione di dismutazione non catalizzata (ossigeno singoletto), è una forma molecolare con minore reattività.

Enzima catalasi Il secondo sistema di difesa utilizza l’enzima catalasi. Tale enzima catalizza la reazione di dismutazione tra due molecole di perossido di idrogeno.

e-

O2 . + O2

. SOD O2 + H2O2

H2O2 + H2O2

catalasi O2 + 2H2O

83

Nella reazione di dismutazione una molecola di H2O2 si ossida, l’altra si riduce formando così una molecola di ossigeno e due molecole di acqua. L’importanza di tale reazione consiste nel rimuovere l’acqua ossigenata in modo che non possa reagire con l’anione superossido: l’obiettivo della superossidodismutasi e della catalasi è quello di bloccare la reazione di Haber Weiss e quindi di impedire la formazione del radicale idrossile.

Enzima glutatione-perossidasi Il terzo sistema di difesa enzimatica agisce sugli idroperossidi ed utilizza l’enzima glutatione-perossidasi. Tale enzima utilizza come donatore di atomi di idrogeno il glutatione ridotto (GSH). Il glutatione (glutamilcisteinilglicina) è un tripeptide formato da glutammato, cisteina e glicina; la cisteina possiede il gruppo sulfidrile SH dal quale si distacca l’atomo di idrogeno. In realtà per neutralizzare l’idroperossido sono necessarie due atomi di idrogeno e quindi due molecole di glutatione. Il glutatione ossidato è, quindi, un dimero formato da due molecole di glutatione legate fra di loro per mezzo di un ponte disolfuro (GSSG). E’ importante ricordare che l’enzima glutatione perossidasi utilizza come cofattore il selenio. Le scorte di glutatione utilizzato dalla glutatione perossidasi vengono rigenerate grazie all’azione di un enzima, glutatione reduttasi, che riduce il glutatione ossidato e lo rende nuovamente disponibile. L’enzima glutatione reduttasi agisce in coppia con un donatore di elettroni, il NAD fosfato ridotto (NADPH+H+).

GSH HSG GS-SG 2H! all’idroperossido

84

Il NADPH+H+ è un coenzima mobile di deidrogenasi che agisce in coppia con l’enzima G6P-deidrogenasi. Tale enzima ossida il glucosio-6-P in lattone dell’acido 6-fosfogluconico, formando NADPH+H+ . Questa reazione appartiene ad una via di utilizzazione del glucosio alternativa alla glicolisi, la via dei pentoso- fosfati detta anche shunt dell’esoso mono-fosfato. Questa via è particolarmente utilizzata dalle cellule muscolari e dagli eritrociti dove sono necessarie grandi concentrazioni di NADPH+H+ per combattere i radicali liberi.

8) La vitamina E La vitamina E (tocoferolo) esercita un’azione antiperossidante, proteggendo dalla perossidazione gli acidi grassi. Esercita la sua azione protettiva sulle membrane cellulari grazie alla sua capacità di inserirsi nel doppio strato fosfolipidico: possiede infatti una coda idrofobica che gli permette di integrarsi nella struttura di membrana. Un’altra porzione della molecola gli permette invece di reagire con i radicali liberi, interrompendo la cascata ciclica di reazioni radicaliche. L’azione antiperossidativa della vitamina E è potenziata notevolmente dal selenio, cofattore della glutatione perossidasi. Gli oli vegetali sono ricchi di vitamina E, specialmente l’olio di germe di grano. Il fabbisogno giornaliero per l’uomo è di 10-15 mg/die.

glutatione perossidasi

2GSH GS-SG

glutatione reduttasi

NADP+ NADPH+H+

85

9) I radicali liberi nei processi infiammatori I globuli bianchi o leucociti, svolgono un ruolo di difesa nei confronti di batteri, virus e parassiti. Il sistema difensivo dei globuli bianchi è specializzato, data la varietà di agenti patogeni. I particolare ai linfociti è affidata la produzione di anticorpi, ai monociti, dopo essersi trasformati in macrofagi, è affidato il compito di fagocitare e quindi digerire gli agenti patogeni. I primi agenti che fanno barriera contro le infezioni sono però i leucociti polimorfonucleati granulosi (o granulociti) e tra questi i neutrofili presentano la maggiore capacità fagocitante. Per ottenere la morte dei batteri aggrediti e fagocitati, i neutrofili adottano particolari tecniche tra cui quella di produrre sostanze tossiche quali l’anione superossido, l’acqua ossigenata, il radicale idrossile e l’ossigeno singoletto. Appena i neutrofili entrano in contatto con l’agente esterno si attivano consumando un’ elevata quantità di ossigeno e di glucosio. Questa risposta cellulare è definita “respiratory burst”.

NADPH+H+ + 2O2

O2 . O2 . O2 .

H2O2 H2O2 H2O2

H2O2

NADP+ + 2H+ + 2O2 . O2 .

H2O2 2H+

86

L’enzima principale coinvolto nel burst respiratorio è il NADPH ossidasi in grado di produrre anione superossido utilizzando come riducente il NAD fosfato ridotto formatosi nel metabolismo ossidativo degli esosi.

Il NADP+ prodotto in questa reazione, assieme a quello prodotto dalla reazione catalizzata dalla glutatione reduttasi, è in grado di stimolare la via metabolica dei pentoso fosfati per cui si spiega l’aumentato consumo di glucosio che si verifica durante la fagocitosi. La NADPH ossidasi sembra essere localizzata nella membrana plasmatica o connessa ad essa mediante i microtubuli in quanto durante la stimolazione una grande quantità di superossido viene rilasciato all’esterno della cellula. In seguito alla fagocitosi, l’agente estraneo viene inglobato in un vacuolo costituito da invaginazioni della membrana stessa e quindi il superossido viene direttamente riversato sull’agente estraneo: ciò spiega l’elevata capacità distruttiva dei neutrofili nei confronti di sostanze estranee. Resta ancora da chiarire il meccanismo mediante il quale il superossido provochi l’uccisione dei batteri; l’ipotesi più avvalorata riconduce all’azione combinata del superossido e dell’acqua ossigenata proveniente dalla dismutazione di due molecole di superossido. Questi due agenti possono infatti reagire tra loro e dare origine al radicale idrossile.

NADPH+H ++ 2 O2 NADP+ + 2O2 . + 2H+

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Capitolo VI

Il Glicogeno

1) I polisaccaridi 2) L’ amido 3) Il glicogeno 4) I depositi di glucosio in forma di glicogeno e la pressione osmotica

intracellulare 5) Distribuzione tissutale del glicogeno e significato funzionale 6) Glicogenosintesi 7) Glicogenolisi 8) Schema riepilogativo 9) Regolazione della glicogenolisi 10) Schema del sistema dell’AMP ciclico e della cascata delle reazioni protein

chinasiche nella regolazione della glicogenolisi 11) Le attività della glicogeno sintasi e della glicogeno fosforilasi sono regolate

in modo speculare

1) I polisaccaridi. Sono polimeri di monosaccaridi o loro derivati. Da un punto di vista strutturale si possono dividere in:

omopolisaccaridi: formati da un solo tipo di monosaccaride; eteropolisaccaridi: formati da due o più tipi di monosaccaridi.

Dal punto di vista funzionale si possono distinguere:

polisaccaridi nutrizionali o di riserva (amido nei vegetali, glicogeno negli

animali); polisaccaridi strutturali o di sostegno (cellulosa nei vegetali,

mucopolisaccaridi o chitina negli animali).

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2) L’ amido E’ un polimero dell’alfa-glucosio e rappresenta il tipico polisaccaride di riserva dei vegetali dove è depositato nei semi, nei tuberi e nelle radici in forma di granuli. I granuli di amido contengono due omopolisaccaridi, entrambi polimeri dell’alfa- glucosio: l’amilosio (20-28%) e l’amilopectina (72-80%). L’amilosio consiste di catene lineari composte da unità di alfa-glucosio (da 200 a 300) unite fra di loro da legami alfa-1,4-glucosidici. L’amilopectina è invece costituita da catene ramificate (da 10.000 a 20.000 molecole di alfa-glucosio). (Si veda più avanti la spiegazione sulle basi strutturali delle ramificazioni nel paragrafo sul glicogeno). Prodotti di parziale idrolisi dell’amido sono le destrine, impiegate come additivi alimentari. 3) Il glicogeno E’ un polimero dell’alfa-glucosio e rappresenta il tipico polisaccaride di riserva degli animali. Ricordiamo la numerazione degli atomi di carbonio della molecola del glucosio: notare la posizione del carbonio 6 (fuori dalla struttura ciclica piranosica).

OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH OH

H

H 1

23

4

6

5

Esistono due forme stereoisomeriche del glucosio (forme alfa e beta dette anche anomeri) dovute alla posizione dei sostituenti del carbonio 1: nella forma alfa l’OH del C1 resta proiettato sotto il piano dell’anello, nella forma beta sopra.

OH

OHO H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

HOH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

alfa-glucosio beta-glucosio

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Nella molecola del glicogeno (e dell’amido) le molecole di glucosio sono legate fra di loro con legame alfa-1,4-glucosidico. Si può considerare il legame alfa-1,4-glucosidico come il risultato della reazione tra OH del C1 di una molecola di glucosio ed OH del carbonio 4 della molecola successiva, con rimozione di una molecola di acqua e formazione di un ponte ad ossigeno tra C1 e C4.

OH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H OH OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

OH2

estremità riducente

estremità non riducente

legame alfa-1,4-glucosidico

414 1

OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

HOOH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

414 1

Il disaccaride (unione di 2 glicidi) mostrato nella figura precedente si chiama maltosio.

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I polimeri formati da n molecole di beta-glucosio formano polisaccaridi non digeribili dal nostro organismo (la cellulosa), in quanto non vi sono enzimi digestivi in grado di idrolizzare il legame beta-1,4-glucosidico.

O OH

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

OHO H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

legame beta-1,4-glucosidico Il glicogeno sarà formato da numerose unità glicidiche di alfa-glucosio unite da legami alfa-1,4-glucosidici. Si ottiene una catena lineare con due estremità: l’estremità con l’OH libero in C1 (estremità riducente) e l’estremità con l’OH libero in C4 (estremità non riducente). Il glicogeno accresce le sue dimensioni aggiungendo molecole di alfa-glucosio dall’estremità non riducente. In realtà il glicogeno è un polimero ramificato, infatti in alcuni punti, detti di ramificazione, le catene lineari sono unite tra loro con legami alfa-1,6-glicosidici.

O

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H O

CH2

OH

O H

H

H

OH

OH

H

HO

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

H

O

O H

H

CH2OH

H

OH

OH

H

HO

414 1

legame alfa-1,6-glucosidico

414 1

punto di ramificazione

66

66

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La frequenza di legami alfa-1,6-glicosidici è di 1 ogni 10 legami alfa-1,4- glicosidici. Il glicogeno è più ramificato rispetto alla molecola dell’amilopectina dell’amido. Nel caso dell’amilopectina, infatti, il rapporto tra legami alfa-1,4-glicosidici e legami alfa-1,6-glicosidici è di 20:1. La molecola del glicogeno ha dunque l’aspetto di un cespuglio molecolare con una sola estremità riducente e numerose estremità non riducenti (vedi figura). Fino a 30.000 unità di glucosio possono partecipare alla formazione di un molecola di glicogeno (peso molecolare 5 X 106). E’ possibile osservare con la microscopia elettronica i depositi di glicogeno nei tessuti sotto forma di granuli di glicogeno. Qual’ è il vantaggio fornito dalla presenza delle ramificazioni? Come vedremo la sintesi del glicogeno (glicogenosintesi) e la sua degradazione (glicogenolisi) procedono a partire dall’estremità non riducente. La presenza di numerose estremità non riducenti per molecola di glicogeno accelera la velocità dei processi metabolici del glicogeno.

legami alfa-1,6-glucosidici

estremità non riducenti

estremità riducente

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4) I depositi di glucosio in forma di glicogeno e la pressione osmotica intracellulare. Abbiamo detto che il glicogeno è un polimero del glucosio e, dal punto di vista funzionale, rappresenta solo una forma di deposito di tale monosaccaride. Ma perché spendere ATP per sintetizzare glicogeno? Non sarebbe preferibile conservare il glucosio in forma libera all’interno delle cellule fino alla sua utilizzazione? Un quantità di glucosio libero pari a quella contenuta nel glicogeno porterebbe la concentrazione di glucosio all’interno della cellula epatica ad un valore di 400 mM. La pressione osmotica dipende dalla concentrazione delle molecole (concentrazione espressa in molarità). Una concentrazione intracellulare di glucosio pari a 400 mM causerebbe l’ingresso di acqua nella cellula ed il suo rigonfiamento fino alla rottura della membrana plasmatica (lisi osmotica). 400 mM di glucosio possono essere invece conservati con una concentrazione intracellulare di glicogeno di circa 0,01 mM. Possiamo quindi conservare un gran numero di molecole di glucosio all’interno delle cellule senza provocare drastici incrementi della pressione osmotica. Inoltre la concentrazione intracellulare di glucosio varia rapidamente con l’attività funzionale della cellula (il muscolo in attività consuma rapidamente il glucosio). Se il glucosio fosse conservato in forma libera le variazioni di concentrazione si accompagnerebbero a rapide e notevoli variazioni della pressione osmotica intracellulare, variazioni incompatili con le funzioni cellulari. L’esistenza di un polimero del glucosio, come il glicogeno, permette grandi e rapide variazioni dei depositi di glucosio senza variazioni della pressione osmotica intracellulare. La pressione osmotica dipende, infatti, dal numero delle molecole di glicogeno e non dalla loro dimensione. Concetti da ricordare:

La pressione osmotica dipende dal numero delle molecole nell’unità di volume della soluzione;

durante il metabolismo cambiano le dimensioni delle molecole del glicogeno (cioè il numero di molecole di glucosio per molecola di glicogeno) ma non il loro numero.

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5) Distribuzione tissutale del glicogeno e significato funzionale. I tessuti con le concentrazioni più elevate di glicogeno sono:

a) il tessuto epatico b) il tessuto muscolare

Il fegato ha una straordinaria capacità di immagazzinare glicogeno. In un uomo ben nutrito il contenuto di glicogeno epatico può ammontare a più del 10% del peso totale dell’organo. Il muscolo ha una concentrazione di glicogeno inferiore (al massimo1-2%). Tuttavia, poiché la massa complessiva del tessuto muscolare (35 kg) è nettamente superiore a quella del fegato (1,8 Kg), in totale il glicogeno muscolare è circa il doppio di quello epatico. gr glicogeno

per 100gr tessuto peso in Kg del

tessuto contenuto totale

in glicogeno

Fegato 10% 1,8 Kg circa 180 gr

Muscolo 1-2% 35 Kg circa 350 gr

I depositi di glicogeno muscolare ed epatico hanno ruoli funzionali differenti. Il glicogeno muscolare serve come deposito di glucosio per la fibrocellula muscolare in cui è contenuto. Il glicogeno epatico è invece una riserva di glucosio per il mantenimento dei livelli glicemici e, quindi, a disposizione degli altri tessuti dell’organismo. La differenza biochimica fondamentale è la presenza dell’enzima glucosio-6- fosfato fosfatasi nel fegato. Questo enzima converte il glucosio-6-fosfato (incluso quello che proviene dal processo della glicogenolisi) in glucosio libero mediante una reazione di idrolisi del legame fosfoestereo. Il glucosio libero, a differenza del glucosio 6-fosfato, è in grado di attraversare la membrana plasmatica e di passare nel circolo sanguigno. Il fegato, grazie a questo enzima, è in grado di rilasciare glucosio nel sangue e di contribuire al mantenimento dei livelli glicemici in condizioni di digiuno. Ciò è di particolare importanza per il sistema nervoso che, in condizioni fisiologiche, utilizza prevalentemente il glucosio quale substrato energetico. Il muscolo potrà invece utilizzare il glucosio 6-fosfato nel processo glicolitico per la produzione di ATP. La resa energetica della glicolisi anaerobia a partire da una molecola di glucosio contenuta nel glicogeno sarà di 3 ATP, anziché di 2 ATP. Si risparmia infatti la molecola di ATP utilizzata nella 1° reazione (esochinasica), dato che dalla glicogenolisi si ottiene già glucosio fosforilato (glucosio 1 fosfato che si converte in glucosio 6 fosfato).

commenti (1)
sei grande ho capito finalmente tutto!!! Grazie
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