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Ottimizzazione delle interazione Cellule-Materiale Gianluca Ciardelli Meccanismi che regolano|;it?x?#} l'adesione cellulare Plasma {I Membrane à Endoplasmic 7 di Ò - Microtubule Reticulum i gli £ i lg 1 Pie Mitochandrion Ribosomes —_ti and Intermediate Filaments Meccanismi che regolano l’adesione cellulare •INTERAZIONI CELLULA/SUPERFICIE -La membrana cellulare ha una carica netta negativa Adesione modulata da (circa 100 tipi di) recettori della superficie cellulare che si legano a specifiche sequenze peptidiche o molecole; in assenza di ligandi, l’adesione è elettrostatica o regolata dalla bagnabilità -Fattori per controllare la forza delle interazioni: - tensione superficiale, - la carica superficiale aumenta l’adesione - rugosità superficiale: AS (area specifica) più alta promuove l’adesione - chimica superficiale: ligandi di adesione (fibronectina, collagene, rivestimenti idrofilici) o agenti bloccanti (BSA, eparina) -E’ possibile controllare anche vitalità e crescita cellulare - Esempio: cellule nervose su polimeri conduttori - Le cellule diffondono sulla superficie Adesione cellulare ad un substrato solido Y Adesione focale: adesione molto forte tramite recettori specifici per le proteine adesive. Il legame è di tipo ligando-recettore che induce un cambiamento conformazionale dei siti recettoriali di membrana (proteine transmembrana) ed innesca una precisa risposta biochimica vY Close contact. siti meno forti di adesione che in genere circondano l'adesione focale. Y Contatto con la ECM: legami elettrostatici tra membrana cellulare e il substrato della matrice Biomolecole della ECM Componente Struttura Unità base Locazione Fibronectina Glicoproteica AAe monosaccaridi Tessuti connettivi. Fattore di legame tra fibre collagene e fibroblasti Laminina Glicoproteica AAe Membrane basali. Fattore di disaccaridi legame tra collagene IV e cellule. Osteonectina Glicoproteica AAe Tessuto osseo. Media l’attacco monosaccaridi di Ca**, idrossiepatite- collagene |. Vitronectina Glicoproteica AAe monosaccaridi Fattore di legame tra cellula e ECM Condronectina Glicoproteica AAe monosaccaridi Cartilagine. Fattore di legame tra collagene IV e condrociti Adesione Cellulare Caderine: adesione cellula/cellula Superfamiglia Immunoglobuline (interagiscono con porzioni idrofobiche a foglietto beta) Selectina/proteina glicosilata: solo nei vertebrati lectina carboidrati Integrine:eterodimeri – legano proteine Della ECM, ma anche di interazioni Cellula/cellula ad es. nei leucociti Interazione con superfamiglia Ig Integrins Integrin-ECM interaction Reference a fa collagen type IV, VI and IX; laminins [19,56,132,135-139] dg fa collagen type L IL IV and IX; laminins [19,44,56,135-140] cy Pa collagen type IV, laminin-5, [19,42,56,132,136-138,141] -10 and -11 (-1 and -2), thrombos pondin, fibronectin, nidogen, da Pa fibronectin, thrombospondin [44,56] dg È fibronectin [136] as Pi fibronectin, thrombospondin [44,56,136,141] ds Pa laminin-5, -3,-1 and -4, thrombospondin [56,132,135-137,141] ts Ba (in hemidesmosomes) cn Pa cis Pa cis Pa co fi cu fi cy Pa cy Ba ty Bg cy Be ty Pa laminin-1, -3 and -5, perlecan laminin-1, -2, -4 and {-5) fibronectin, vitronectin, tenascin, osteopontin thrombin cleaved osteopontin, laminin, tenascin C collagen type I, IV, VI and IX collagen type IL IV and IX vitronectin, fibronectin tenascin C, thrombospondin, vitronectin, fibronectin, laminin, osteopontin, vitronectin fibronectin, tenascin, vitronectin vitronectin [42,132,135-136,138] [56,132,135-137] [56,136] [56,136] [135-137] [135-137] [56,135] [56,136,138] [138] [56,136,142] [135] Interazione tra CELLULA E ECM v le interazioni tra cellula e matrice extracellulare sono fondamentali per determinare precise risposte fisiologiche (o patologiche). “ Se si verifica il legame con una proteina collegata col citoscheletro (es: integrina), il segnale viene trasferito tramite il citoscheletro dalla membrana al nucleo e si attivano i processi di proliferazione e differenziazione Spreading Cellulare * Lo “spreading” cellulare è un processo che unisce l’attività adesiva e la rete contrattile intracellulare (citoscheletro). Inizialmente si formano Prisca! delle protrusioni ; citoplasmatiche e la formazione di filamenti tra cellula e substrato Plasmasol dra «7 Pseudopod Plasma membrane Adesione nei punti Focali * poi si formano adesioni focali all'apice di queste formazioni, fino ad arrivare allo stadio finale in cui le protrusioni si appiattiscono e si allargano fino a far assumere alla cellula una forma completamente appiattita Quando una cellula incontra la membrana di un’altra cellula, il contatto inibisce il processo bloccandolo (valido per le cellule ancoraggio-dipendenti) Adesione nei punti Focali Quantificazione dell’adesione nei punti focali • Metodi meccanici: – Misura della forza che serve a piegare una micropipetta attaccata ad una cellula per suzione (1944) – Metodo AFM • Metodi non meccanici – Quantificazione con marcatura fluorescente della vinculina. Misura dell’area dell’adesione focale/misura dell’area totale occupata da cellule - La marcatura delle proteine di adesione con tetrossido d’osmio permette la visualizzazione delle aree di adesione focale mediante Microscopia elettronica a scansione • Metodi immunocitochimici – Riconoscimento di antigeni (proteine di adesione) mediante anticorpi marcati fluorescenti (con fluorofori, particelle d’oro) – In genere viene marcata la vinculina per la sua presenza in tutte le adesioni focali ed in forma monomerica: sono inoltre disponibili anticorpi monoclonali POLIURETANI BIODEGRADABILI : ADESIONE CELLULARE Punta AFM rivestita con lecitina di soia); raggio punta AFM ~ 40-70 nm; soluzione acquosa (pH=7) ƒ~ 5 nN ƒ~ 3 nN Polimero 1 Polimero 2 Per fibroblasti NIH 3T3, un tipico valore della forza è 10 nN (U. S. Schwarz, N. Q. Balaban, D. Riveline, L. Addadi Mater Sci Eng 2003,23,387). + semplicemente... Se il legame avviene con una proteina (fattore di crescita) non collegata al — citoscheletro l'espressione ECM-molecole genica per i meccanismi di GF crescita e differenziazione ii — enim cellulare avviene tramite / | attivazione diuna cascata ..scata prollfaradivi proliferativa L (produzione di segnali biochimici e Espressione Proliferazione messaggi metabolici per le varie genica Differenziazione risposte fisiologiche) Segnali dalle altre cellule Collaborazione tra Molecole e cellule nella regolazione del comportamento di una cellula In mancanza di adatti segnali una cellula può anche “suicidarsi” (apoptosi) Risposta funzionale Riassumendo.. Segnali dall’ECM Regolazione dell’espressione genica Differenziamento di cellule staminali adulte Differenziamento In tessuti Sopravvivenza/apoptosi Cellule Staminali Stem cells are defined as unspecialized cells that are capable of long term self-renewal and differentiation into specialized cell types. These unique properties make them an attractive cell source for regenerative medicine applications. Although the functions of various stem cells have been extensively studied in the development of organisms and in diseases, the specific factors and conditions that control stem cell fate, specifically the conditions that allow them to remain unspecialized, are not well studied. It has been suggested that adult stem cell survival and maintenance, as well as proliferation and differentiation, are controlled by the three-dimensional (3D) microenvironment, the so-called Soluble Factors niche. Major functional niche components include SUP- sismCell- cel * dia. porting niche cells, growth-modulating soluble factors Interactions. stored within the niches, and the extracellular matrix (ECM). In this article, we review work highlighting the growing complexity of stem cell-ECM interactions and their impact on the fields of biomaterials research and x regenerative medicine. interaciione Progettare e Caratterizzare “Materiali Biomimetici” IM P LA N T Materiali biomimetici • Metodi di funzionalizzazione classica, chimica e biologica (li vedranno alcuni di voi a Biomateriali II) • Funzionalizzazione mediante nanotecnologie: – Impronta Molecolare (già visto) – Self Assembled Monolayers (li vedremo) – Film Langmuir-Blodgett (li vedremo) – ECM sintetica (la vedremo) Interazioni tra biomateriale e tessuti 1. Uno strato proteico ricopre il biomateriale 2. neutrofili e macrofagi “interrogano” il biomateriale 3. Le cellule emettono proteine segnale (citochine) Adsorbimento di Proteine 1 Surface + water Different bonding orientations and bonding strengths dA ES 2 Surface + water + proteins Native or denatured confirmation 2 Surface + water + proteins + cells Adsorbed protoin layor Surface Inyer —T ofwater © A iomaterialyz Adsorbimento di una proteina Conformation: ini valico Sacile simana time» Orientation: E i ni npilia Adsorbimento di Proteine: effetto Vroman Il Plasma contiene oltre 100 proteine L’effetto Vroman descrive l’adsorbimento di proteine diverse nel tempo