Análise instrumental cromatografia líquida de alta resolução - Apostilas - Química Parte2, Notas de estudo de Química

Baixe Análise instrumental cromatografia líquida de alta resolução - Apostilas - Química Parte2 e outras Notas de estudo em PDF para Química, somente na Docsity! 15 Os momentos dipolares de alguns grupos funcionais estão mostrados na Tabela 9, abaixo: Tabela 9- Momento dipolar em unidade debyes Grupo unidade Grupo unidade amina 0,8 halogênios 1,6 éter 1,2 éster 1,8 sulfeto 1,4 tiol 1,4 carboxila -COOH 1,7 hidroxila 1,7 aldeído -CHO 2,3 cetona 2,7 nitro -NO2 3,2 nitrila -CN 3,5 d)Pontes de hidrogênio: Pontes de hidrogênio entre doadores e aceptores de hidrogênio são encontrados comumente na química. O par clorofórmio/trimetilamina é um bom exemplo de um doador de prótons (clorofórmio) e um aceptor (trimetilamina). Cl3H ↔ : N(CH3)3 A polaridade é então a habilidade que tem um solvente de atuar em combinação com os quatro tipos de interações citadas. A força do solvente aumenta com a polaridade na partição com fases normais e em adsorção enquanto que, em fase reversa, a força do solvente diminui com o aumento da polaridade. 6.4-MISCIBILIDADE A necessidade de se efetuar análises por gradiente ou empregando misturas de solventes, requer que eles sejam miscíveis entre si. Insolubilidade leva à formação de gotículas de solventes suspensas na saída da coluna, produzindo ruído nos detectores. A substituição de solventes requer que eles sejam miscíveis entre si, a fim de se poder lavar a bomba, a tubulação, a coluna e o detector. A Tabela 10 mostra um diagrama de solubilidade entre os solventes mais empregados em CLAE. Tabela 10- Diagrama de solubilidade entre os solventes mais empregados em CLAE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 hexano (1) • • • tetracloreto de carbono (2) • clorofórmio (3) • cloreto de metileno (4) • éter etílico (5) • acetato de etila (6) • acetona (7) acetonitrila (8) • isopropanol (9) metanol (10) • água (11) • • • • • • ácido acético (12) • indica imiscibilidade 16 6.5-DICAS E CUIDADOS COM AS FASES MÓVEIS A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta sensibilidade com detectores por fluorescência ou por absorbância no ultravioleta, onde as impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os componentes da amostra. Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase móvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto, satura-se a fase móvel com a fase estacionaria utilizando-se para isso uma pré-coluna contendo uma alta concentrado da mesma fase estacionaria. No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseificá-lo. Deixar o solvente no frasco dentro de banho ultra-som por, no mínimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a solução a ser preparada. No caso de solvente orgânico com água, esse tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de água e álcool, que é exotérmica, deve-se efetuar a mistura e depois desgaseificá-la. Em mistura de acetonitrila e água a desgaseificação deve ser feita em temperatura baixa devido à grande volatilidade da acetonotrila. Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada. O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode cristalizar sal na região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pistão. 7- EQUIPAMENTOS PARA CLAE As principais características que devem ser levadas em consideração na escolha de um equipamento para CLAE são: a) Versatilidade: o equipamento deve resolver amostras de diferentes tipos, servir a distintas técnicas cromatográficas e realizar o máximo de operações, tais como, gradiente de fase móvel, coleta das frações, reciclagem de frações, etc., necessárias às análises sofisticadas. b) Rapidez: Para se conseguir análises rápidas, deve-se obter as melhores condições de CLAE, isto é, fase móvel de baixa viscosidade, bomba de alta pressão e colunas com partículas de pequeno diâmetro (grande área de superfície, que ajuda os processos de separação). c) Reprodutibilidade e Estabilidade: características essenciais para obter do equipamento um bom funcionamento em longo prazo. O equipamento deve ter controle adequado sobre os parâmetros de operação, como vazão, temperatura, pressão e composição da fase móvel. d) Sensibilidade: Um bom equipamento, mesmo trabalhando com pequenas quantidades de amostra, deve gerar sinais de intensidade apreciável. 19 excêntrico) e através de um sistema de válvulas que alternadamente se abrem e fecham, onde se enche e esvazia, de modo alternativo, uma pequena câmara. Estas bombas apresentam um volume interno de 100-200 µL (Figura 4). Figura 4- Desenho esquemático de bomba reciprocadora. O selo do pistão é um disco de teflon fixo no interior do corpo da bomba, feito de aço inoxidável quimicamente resistente. Os pistões são de safira, que confere resistência ao ataque da maioria dos solventes utilizados em CLAE. Uma válvula (check-valve) típica consiste em uma esfera de rubi aparada em base de safira, formando um selo. A pressão dentro do reservatório da bomba é a responsável pela abertura e o fechamento do selo. Estes movimentos dependem da localização da esfera (na entrada ou na saída da válvula). Existem dois tipos de válvula (check- valve). Na primeira a esfera funciona através da força da gravidade. E na segunda a válvula tem uma mola metálica (aço inoxidável apoiada sobre a esfera de rubi). A mola mantém a válvula fechada até que a pressão desenvolvida pela bomba force a contração da mola, possibilitando a passagem do solvente. Além disso, a mola impede que a válvula abra em baixas pressões. As principais vantagens deste tipo de bomba são uma vazão com volume constante, capacidade de alimentação contínua do sistema, facilidade na mudança da fase móvel e o trabalho com pequenos volumes. Uma das desvantagens deste tipo de bomba é que se obtém uma vazão pulsante e não uniforme e contínua. Isto pode causar perda de eficiência na coluna e instabilidade no detector. Sistemas de amortização hidro-pneumáticos, localizados entre a bomba e a coluna, têm sido utilizados para solucionar esse problema. A forma mais simples de amortecedor utilizada consiste de uma secção normalmente espiralada de espessura reduzida de aço inoxidável ou tubo de teflon (6 m x 1 mm). Este tubo capilar se deixa fluir livremente e assim absorve as pulsações produzidas pela bomba. A grande desvantagem desse tipo de amortecedor é seu grande volume morto, que pode provocar alargamento da banda cromatográfica, além de tornar o processo de mudança da fase móvel lento e dispendioso. 20 7.2.4- BOMBAS RECIPROCADORAS DE DUPLO-PISTÃO Neste tipo de bomba, dois pistões são acionados por um mesmo eixo excêntrico, de forma que, quando um pistão succiona a fase móvel, o outro expulsa o líquido para fora da bomba. A vazão de ambos os pistões, já quase livre de pulsação, é encaminhada à coluna por uma via comum. Assim o sistema de duplo pistão tem todas as vantagens da reciprocadora de pistão simples, além da vantagem adicional da grande diminuição do problema de pulsação. Figura 5- Desenho esquemático de bomba reciprocadora de duplo pistão. 7.3- VÁLVULAS PARA AMOSTRAGEM Anteriormente, a introdução da amostra era efetuada de forma similar à realizada na cromatografia gasosa, ou seja, mediante micro-seringa que injeta a amostra dentro de uma pequena câmara, de onde é eluída pela fase móvel. Os equipamentos modernos empregam válvulas para amostragem, como a ilustrada esquematicamente na Figura 6. A amostra, introduzida na válvula mediante seringa, deve encher o espaço interno da porção do tubo capilar de aço, a alça de amostragem (carga). Normalmente o volume contido na alça é de 1 a 100 µL. A amostra é injetada na coluna, ao girar a válvula para que a posição de entrada e saída mude (injeção na coluna). Desta forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de amostra, dependendo do tubo capilar (alça de amostragem) utilizado, com um alto grau de reprodutibilidade. As válvulas para amostragem são fabricadas somente de material inerte, como teflon e aço inoxidável, e seu desenho é tal que resistem a pressões muito elevadas. Figura 6: Válvula de amostragem para CLAE. Posição de carregar e posição de injeção. 21 7.4- DETETORES USADOS EM CLAE Uma instrumentação melhor é requerida para a CLAE, em relação à sensibilidade dos detectores, para monitorização do efluente que sai da coluna. Infelizmente as propriedades físicas ou físico-químicas da amostra e fase móvel são, muitas vezes, similares. Algumas soluções para o problema de detecção tem sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: - Medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas: amostras e fase móvel - Medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel. - Detecção após a eliminação da fase móvel. Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em uma destas soluções. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes características: a) Alta sensibilidade e baixo limite de detecção b) Resposta rápida a todos os solutos c) Insensibilidade a mudanças nas temperatura e na vazão da fase móvel. d) Resposta independente da fase móvel e) Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector. f) Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto g) Não destruição do soluto. h) Segurança e conveniência de uso. i) Informação qualitativa do pico desejado. Infelizmente, não existe um detector que apresente todas estas propriedades, a não ser que ele seja desenvolvido. A Tabela 11 resume algumas das propriedades dos detectores. Tabela 11- Propriedades de alguns detectores usados em CLAE Item Detector espectrofotométrico (UV-VIS) Detector por índice de refração Detector por fluorescência Detector eletroquímico Princípio de operação absorbância de luz na faixa do UV-VIS mudanças no índice de refração da fase móvel emissão fluorescente após excitação com luz oxidação ou redução em potencial fixo Tipo seletivo universal altamente seletivo seletivo Quantidade mín. detectável (g/mL) Fixo: 10-10 Var: 10-9 10-7 de 10-9 até 10-12 10-12 Sensibilidade à temperatura baixa alta baixa média Sensível à vazão da fase móvel não não não sim Útil com gradientes sim não sim não Aplicações compostos que absorvem na região de trabalho compostos em geral compostos ou derivados que fluorescem Espécies que se oxidam ou se reduzam 24 os componentes da amostra. Para solutos que não absorvem no UV ou visível e, conseqüentemente, não são detectados por detectores fotométricos, a melhor escolha é o detector por índice de refração. A resposta deste detector é universal e sua sensibilidade é moderada, geralmente da ordem de micrograma (10-6 g). Este nível de concentração corresponde a uma diferença no índice de refração entre a amostra e a fase móvel de aproximadamente 10-7 unidades de índice de refração. Para observar esta diferença é necessário um controle de temperatura de aproximadamente 0,001 oC, o que normalmente é conseguido por circulação de água, de uma boa fonte termostatizada, através do refratômetro ou um bom controle da temperatura ambiente. Além deste problema com a temperatura, existem ainda outros: a sensibilidade às variações de vazão e mudanças na composição da fase móvel, que impedem o uso de gradiente por ser difícil encontrar um par de solventes com índices de refração idênticos. Qualquer mudança na composição da mistura mudará o índice de refração da fase móvel, então, o lado da referência terá que mudar, o que é quase impossível. A figura 10 apresenta o esquema de um tipo de detector por índice de refração. Figura 10- Esquema de um detector refratométrico por deflexão. 7.4.3- DETECTORES POR FLUORESCÊNCIA A espectroscopia de fluorescência é um método de detecção dos mais sensíveis da atualidade, específico para compostos que fluorescem. Em boas condições é possível detectar quantidades da ordem de picogramas (10-12 g), o que é comparável aos detectores por captura de elétrons em CG. Uma alta intensidade de fluorescência é esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que não podem produzir estruturas fortemente iônicas. A fase móvel empregada nos detectores de fluorescência deve ser cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emissão depende do meio em que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicações, tais como análise quantitativa e eluição por gradiente, nas quais deve-se selecionar os componentes da fase móvel para não atrapalhar a fluorescência. Os detectores para fluorescência também podem proporcionar espectros de emissão das amostras retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV é necessária em ambos os detectores, por absorbância no UV e por fluorescência, eles podem ser combinados em um só detector. Figura 11- Esquema de um detector por fluorescência 25 7.4.4- DETECTORES ELETROQUÍMICOS Métodos eletroquímicos de detecção oferecem a mais promissora solução para o problema de desenvolvimento de um detector para CLAE suficientemente sensível e não baseado em absorbância de luz. Eles oferecem vantagens de alta seletividade, alta sensibilidade e serem muito bons para as análises de traços. É importante destacar que, neste tipo de detecção, a amostra tem que ser constituída de íons ou compostos que sofram ou oxidação ou redução (detectores polarográficos). Este detector é seletivo, porque detecta somente as espécies que se oxidam (ou reduzem) em um potencial inferior ou igua1 ao fixado. Os detectores eletroquímicos são bons para as modalidades de cromatografia que usam fases móveis aquosas, tais como a cromatografia por troca iônica, por exclusão ou com fase reversa por pares de íons ou ate com fase reversa com compostos oxidáveis na fase água-álcool. 7.4.5- DETETORES POR ABSORBÂNCIA NO INFRAVERMELHO A absorbância no infravermelho pode ser usada como detector universal ou específico. A sensibilidade destes detectores, oferecidos no comércio, é muito pequena para as quantidade de amostra normalmente usadas, mas eles são usados com sistemas de CLAE por exclusão. Usando a técnica de parar a vazão com a amostra na cela e tirar o espectro de infravermelho, dará uma imagem analítica completa da amostra. Este tipo de detector é limitado pela fase móvel que deve ser transparente no comprimento de onda utilizado. 7.4.6- DETECTORES DE RADIOATIVIDADE Os detectores de radioatividade são projetados especificamente para detectar solutos radiomarcados conforme são eluídos da coluna. Quase todos detectores deste tipo não são encontrados comercialmente, com exceção dos que detectam as partículas β- do 32P e do 14C. Para o segundo, que funciona através de cintilação líquida, há necessidade da adição de um coquetel de cintilação. Detectores radioquímicos têm uma grande faixa de resposta, são insensíveis a troca de fases móveis, podendo ser usados com eluição por gradiente. Aplicações cromatográficas com emissores de γ e de β- forte (tais como 131I, 210Po e 125Sb), usando sistemas de cintilação ou mesmo contador Geiger, têm sido publicadas. 7.4.7- DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASSAS Os espectrômetros de massas são um tipo de detector para CLAE que pode combinar sensibilidade, versatilidade e universalidade e seu potencial de utilização é muito grande. A maior dificuldade na utilização destes detectores é o interfaceamento com o sistema de CLAE e o seu alto custo quando comparado aos outros detectores mais usados. 7.4.8- OUTROS DETECTORES Detectores baseados em outras propriedades do soluto (como, constante dielétrica, densidade, pressão de vapor, viscosidade etc.) têm sido apresentados para serem usados na CLAE. Vários destes detectores são baseados em propriedades que dependem da temperatura, fazendo sua resposta depender da variação térmica. 26 8- APLICAÇÕES Figura 12 - Os cromatogramas acima são uma mistura de seis esteróides: (1) predinisona, (2) cortisona, (3) hidrocortisona, (4) dexametasona, (5) corticosterona, (6) cortoexolona. A coluna é de 150 mm por 4 mm de diâmetro interno, recheada com fase reversa C8. Figura 13 - Aplicação de cromatografia de exclusão. (a) Separação de ácidos graxos. Coluna a base de poliestireno, 7,5 cm x 600 nm, com limite de exclusão de 103. Tetrahidrofurano como fase móvel, numa vazão de 1,2 mL/min. Detector de índice de refração. (b) Análise de resina epóxi comercial (n = nº de unidades monoméricas no polímero). Coluna de sílica porosa 6,2 x 250 mm. Fase móvel de tetrahidrofurano, numa vazão de 1,3 mL/min. Detector de UV.