Bacilo álcool - Apostilas - Biologia, Notas de estudo de Biologia. Centro Universitario Nove de Julho (UNINOVE)
Jose92
Jose9214 de Março de 2013

Bacilo álcool - Apostilas - Biologia, Notas de estudo de Biologia. Centro Universitario Nove de Julho (UNINOVE)

PDF (27.1 KB)
5 páginas
621Número de visitas
Descrição
Apostilas de Biologia sobre o estudo do Bacilo álcool, ácido resistente, BAAR, metodologias.
20pontos
Pontos de download necessários para baixar
este documento
baixar o documento
Pré-visualização3 páginas / 5
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Pré-visualização finalizada
Consulte e baixe o documento completo
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Pré-visualização finalizada
Consulte e baixe o documento completo

PESQUISA DE BACILO ÁLCOOL - ÁCIDO RESISTENTE – BAAR 1. FUNDAMENTO O diagnóstico das Micobactérias patogênicas (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae), por bacterioscopia direta é feito através dos métodos de coloração de Ziehl-Neelsen e de Kinyoun, os quais utilizam a característica destas bactérias de possuírem paredes celulares com alto teor de lipídeos (cerca de 60%, principalmente de Ácido micólico), que quando tratadas pelo corante Fucsina fenicada, coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subseqüente por uma solução de Álcool-ácido forte (diferenciador). É por isto que são conhecidas por Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). As outras bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, têm a sua coloração pela Fucsina descorada pela solução de Álcool-ácido e coram-se em azul pela coloração de fundo do Azul de metileno (contra-corante). 2. METODOLOGIAS DE COLORAÇÃO

2.1. MÉTODO DE COLORAÇÃO À QUENTE – MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN

2.1.1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;

2.1.2. Deixar secar à temperatura ambiente; 2.1.3. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; 2.1.4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada,

previamente filtrada ou filtrado sobre a lâmina no momento da coloração; 2.1.5. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodão

umedecido em álcool ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três emissões sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais corante, se preciso, dentro deste período para evitar que a lâmina seque porque o esfregaço precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento.). Este aquecimento deve ser intermitente, pois é importante manter a solução aquecida durante o tempo previsto;

2.1.6. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;

2.1.7. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;

2.1.8. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;

2.1.9. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;

2.1.10. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;

2.1.11. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura ambiente ou estufa a 35º C;

2.1.12. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).

2.2. MÉTODO DE COLORAÇÃO À FRIO – MÉTODO DE KINYOUN

2.2.1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;

2.2.2. Deixar secar à temperatura ambiente; 2.2.3. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen; 2.2.4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada

(Kinyoun), previamente filtrada ou filtrado sobre as lâminas no momento da coloração,

deixando agir por cerca de 5 minutos, adicionando mais corante se preciso dentro deste período, evitando que a lâmina seque;

2.2.5. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda;

2.2.6. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos;

2.2.7. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com cuidado para não desprender a película;

2.2.8. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto;

2.2.9. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como a parte inferior da lâmina;

2.2.10. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à temperatura ambiente ou estufa a 35º C;

2.2.11. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x).Observação:Na coloração do Mycobacterium leprae , segue-se o mesmo procedimento mas a descoloração deve ser feita com Ácido sulfúrico a 4% em água, pois esse microrganismo é sensível a descoloração alcoólica. Ao realizar uma coloração de esfregaço, em qualquer método, alguns procedimentos devem ser observados a fim de evitar cometer erros por utilizar: (a) substâncias corantes não certificadas; (b) substâncias corantes precipitadas; (c) corantes com concentração inadequada; (d) esfregaços demasiados espessos, concentrados ou delgados; (e) metodologia incorreta. 3. TABELA DE INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA BACTERIOSCOPIA PARA BAAR: A leitura deve ser feita no mínimo em cem campos microscópios, o que corresponde, aproximadamente, a leitura de uma linha reta que vai do extremo, onde está a numeração, até o extremo oposto, isso corresponde aproximadamente a mais ou menos 5 minutos de observação. Recomenda-se: um intervalo de 10 minutos de descanso para cada dez lâminas lidas e utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o número de bacilos encontrados em cada campo microscópio e o resultado deve ser informado em número de cruzes segundo as normas do Ministério da Saúde em vigor. Manual de Bacteriologia da Tuberculose – Ministério da Saúde / FNS / CENEPI / CNPS / Centro de Referência Prof. Hélio Fraga – 2ª Edição Revisada e Ampliada – 1994.

Número Total de Campos Observados

Número de bacilo álcool-ácido resistente observados por

campo

Resultado

100 Não foram encontrados Negativo 100 Menos de 1 BAAR por campo Positivo (+) 50 De 1 a 10 BAAR por campo Positivo (++) 20 Mais de 10 BAAR por campo Positivo (+++)

Observação:Nos casos de diagnóstico, ao encontrar de 1 a 4 bacilos em 100 campos observados, deve-se ampliar a leitura para mais 100 campos. Se a quantidade de bacilos encontrados depois de observar os 200 campos se mantiver entre 1 a 4 bacilos, informar o resultado como “NEGATIVO“ e solicitar

nova amostra. Se nos materiais subseqüentes deste paciente persistir a negatividade, proceder a cultura. 4. PREPARAÇÃO DOS CORANTES

4.1. Corantes de Ziehl – Neelsen

4.1.1. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Fucsina básica 0.3g Álcool etílico 95º % 10ml Fenol fundido 5,75ml Água destilada ou deionizada q.s. 100ml Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro. Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima. Observação:Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tomar-se-ão 5,75 ml ao invés de 5 ml.

4.1.2. Álcool-Ácido: Ácido clorídrico, densidade 1.19 3ml Álcool etílico 95º % 97ml Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente. Observação: Alguns autores recomendam Álcool-Ácido à 1%.

4.1.3. Azul de metileno: Azul de metileno 0.3g Álcool etílico 95º % 3ml Água destilada ou deionizada q.s. 100ml Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar Água destilada ou deionizada até completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro.

4.2. Corantes do método de Kinyoun:

4.2.1. Fucsina fenicada de Kinyoun: Fucsina básica 4g Álcool etílico 95º % 20ml Fenol fundido 9,75ml Água destilada ou deionizada q.s. 100ml Na preparação dos corantes de Fucsina fenicada (Ziehl – Neelsen e Kinyoun), dissolver em um gral o corante (Fucsina) no Álcool etílico 95º, juntar aos poucos o Fenol fundido. Misturar sempre de modo a obter uma solução bem homogênea. Juntar a água, pouco a pouco, lavando o gral. Filtrar após 24 horas de repouso. Estocar em frasco escuro.

Segundo Langeron, a prática seguida por outros autores de misturar a solução alcoólica saturada do corante com água fenolada não dá soluções tão estáveis e dotadas de poder corante tão intenso como esta técnica descrita acima. Observação: Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em fenol) , na fórmula acima, tornar-se-ão 9,75 ml ao invés de 9 ml.

4.2.2. Álcool-Ácido: Ácido clorídrico, densidade 1.19 3ml Álcool etílico 95º % 97ml Com uma pipeta deixar escorrer o Ácido clorídrico pelas paredes do frasco contendo o Álcool e agitar suavemente.

4.2.3. Azul de metileno: Azul de metileno 0.3g Álcool etílico 95º % 3ml Água destilada ou deionizada q.s. 100ml Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar Água destilada ou deionizada quente até completar 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro. Observação: Para a coloração de fundo, outras soluções de Azul de metileno podem ser usadas, tais como a de Azul de metileno segundo Löeffler (Azul alcalino de Löeffler) e Azul de metileno segundo Kühne (Azul fenicado de Kühne).

4.3. Azul de metileno segundo Löeffler (Azul alcalino de Löeffler): Solução A: Azul de metileno 0.3g Álcool etílico 95º % 30ml Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação. Solução B: Hidróxido de sódio 0,01 N 0,3ml Água destilada ou deionizada q.s. 100ml Dissolver o Hidróxido de sódio com Água destilada ou deionizada. Solução C - para uso: Misturar soluções A e B em partes iguais. Observação: Para o método de Ziehl-Neelsen, diluir na proporção de 1/10 com água destilada ou deionizada antes de usar.

4.4. Azul de metileno segundo Kühne (Azul fenicado de Kühne): Azul de metileno 1.5g Álcool etílico 95º % 10ml Fenol fundido 5,75ml Água destilada ou deionizada q.s. 100ml

Dissolver o Azul de metileno com Álcool por agitação e juntar o Fenol e Água destilada ou deionizada quente até completar o volume de 100 ml. Deixar repousar por 24 horas. Filtrar e estocar em frasco escuro. Observações: 1- Para manter o fenol fundido, adicionar-lhe 15% de água destilada. De tal solução (de água em

fenol) , na fórmula acima, tomar-se-ão 5,75 ml ao invés de 5 ml. 2- Para o método de Ziehl-Neelsen, diluir na proporção de 1/10 com água destilada ou deionizada

antes de usar. 5. CONTROLE DE QUALIDADE DOS CORANTES:

5.1. Todos os corantes, preparados ou comprados prontos, utilizados no Laboratório Clínico, devem ser submetidos a um controle da qualidade, para a verificação do seu desempenho.

5.2. Preparar uma suspensão de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 cultivando em tubo com meio de cultura 7H9. Fazer um esfregaço em uma lâmina com a suspensão e deixe secar ao ar. Deve-se preparar várias lâminas em câmaras de fluxo laminar e deixar estocadas em temperatura ambiente numa caixa fechada. Fixar e corar da mesma maneira que uma lâmina com amostra desconhecida. Examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100x). A micobactéria irá corar-se de vermelho, as demais bactérias e artefatos em azul.

5.3. As lâminas estocadas e não coradas servirão como controle do desempenho para cada nova bateria de corantes e a cada semana de intervalo.

5.4. Na falta de bactérias padronizadas, podem ser utilizadas as dos esfregaços enviados pelo Programa Nacional de Controle de Qualidade – PNCQ, ou solicitar nos Postos de Saúde dos Estado ou Municípios, os frascos utilizados para estocagem das Vacinas BCG, e, com as gotas restantes fazer o esfregaço para testar a qualidade do corante.

6. CAUSAS DE ERROS NO EXAME MICROSCÓPIO DIRETO DE ESCARRO:

6.1. Amostra insuficiente em quantidade e qualidade; 6.2. Identificação inadequada no pote/frasco. Não deve colocar a identificação na tampa, e sim

no corpo do pote/frasco; 6.3. Área de trabalho inadequada ou mal iluminada; 6.4. Troca das lâminas por falta de procedimento no trabalho; 6.5. Processamento de uma série muito grande de amostras simultaneamente; 6.6. Esquecer de misturar os escarros se as eliminações são poucas e se estão separadas

dentro do pote/frasco; 6.7. Esfregaços muito espessos ou muito delgados; 6.8. Uso de lâminas arranhadas ou que tenham sido utilizadas anteriormente – podem simular

bacilos pela deposição de corantes nas ranhuras; 6.9. Fucsina seca e cristalizada no fundo do frasco. Deve-se usar Fucsina recentemente filtrada

e colocada em frasco bem lavado; 6.10. Descuido no aquecimento da Fucsina (método de Ziehl-Neelsen), permitindo que seque e

cristalize no esfregaço; 6.11. Descoramento insuficiente das lâminas pode deixar corados em vermelho outros bacilos,

que assim confundem com o BAAR; 6.12. Tempo de descoramento muito prolongado pode levar ao descoramento do BAAR; 6.13. Não revisar a numeração das lâminas ou não identificar se apagar o número durante a

coloração; 6.14. Não limpar a lente de imersão depois de cada exame positivo; 6.15. Existência de bacilos no óleo de imersão devido ao mau costume de tocar o esfregaço com

o conta-gotas do frasco; 6.16. Anotação errada do resultado na folha de trabalho diário; 6.17. Transcrição errada da planilha de trabalho diário para o impresso a ser fornecido ao setor

de laudo.

comentários (0)
Até o momento nenhum comentário
Seja o primeiro a comentar!
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Docsity is not optimized for the browser you're using. In order to have a better experience we suggest you to use Internet Explorer 9+, Chrome, Firefox or Safari! Download Google Chrome