Ciclo do Ácido Cítrico - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)
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Lula_8514 de Março de 2013

Ciclo do Ácido Cítrico - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)

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Apostilas de Bioquímica sobre o estudo do Ciclo do Ácido Cítrico, Enzima Reguladora Citrato Sintetase, Enzima Reguladora Aconitase.
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Ciclo do Ácido Cítrico

O ciclo do ácido cítrico, também denominado Ciclo de Krebs ou ciclo do Ácido

Tricarboxílico (TCA) realiza a oxidação de combustíveis metabólicos. O ciclo do ácido

cítrico é uma rota central para a recuperação de energia a partir de vários combustíveis

metabólitos, incluindo carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos, que são convertidos a

acetil-CoA para a oxidação. O ciclo fornece uma série de reagentes para uma variedade

de rotas biossintéticas.

O ciclo é uma série de oito reações que oxida os grupos acetil do acetil-CoA,

formando duas moléculas de CO2, de maneira que a energia livre liberada é conservada

nos compostos reduzidos NADH e FADH2. Seu nome é devido ao produto da primeira

reação, o citrato. Uma volta completa produz três moléculas de NADH, uma de FADH2,

um composto de alta energia (GTP ou ATP) e duas moléculas de CO2.

Sob condições aeróbicas, o piruvato entra na mitocôndria juntamente com H + ,

através de uma proteína de transporte simporte (transporte de substâncias num mesmo

sentido), para ser adicionalmente oxidado. O piruvato é convertido a acetil-CoA pela

piruvato desidrogenase na presença de NAD + , a qual realiza uma descarboxilação

oxidativa. Os grupos acetil entram no ciclo como parte do composto de alta energia

acetil-CoA (tio ésteres que possuem alta energia livre de hidrólise).

A piruvato desidrogenase é um complexo multienzimático (são grupos de

enzimas associadas de modo não-covalente que catalisam duas ou mais reações

sequenciais em uma rota metabólica). Complexos multienzimáticos representam

aumento da velocidade de reações enzimáticas, canalização dos intermediários

metabólicos entre enzimas sucessivas, minimizando reações secundárias e as reações

são controladas coordenadamente.

O complexo piruvato desidrogenase catalisa cinco reações sequenciais com a

seguinte estequiometria:

Cinco coenzimas são necessárias: o pirofosfato de tiamina (TPP), a lipoamida, a

coenzima A, o FAD e o NAD + . O processo pode ser acompanhado na figura abaixo:

Figura 1: Processo de transformação do Piruvato ao Acetil-CoA através de um complexo multienzimático

Etapa 01:

Enzima Reguladora: Citrato Sintetase

A síntese de citrato a partir de oxaloacteto e Acetil-CoA é uma

condensação Aldol. Esta enzima (CS) pode formar uma ligação C-C

diretamente, na ausência de íons metálicos como cofatores.

Em procariontes, CS é composta de seis subunidades idênticas. Em

eucariontes, há duas isozimas (diferem na sequência de aminoácidos, mas que

catalisam a mesma reação química): uma encontrada na matriz mitocondrial, e a

segunda citoplasmática. Ambas parecem ser dímeros de cadeias idênticas.

Há um número de regiões similares na sequência da enzima em

procariontes e eucariontes. Uma das mais bem conservadas contém uma

histidina que é um dos três resíduos envolvidos no mecanismo catalítico da

enzima mitocondrial de vertebrados. Esta região é a utilizada como assinatura de

reconhecimento.

Produtos: Os íons citratos formam

sais denominados citratos com muitos

íons metálicos. O citrato de cálcio ou

"sal amargo", por exemplo, é um

importante citrato, que se utiliza

geralmente na preservação e

condimentação dos alimentos. Além

disso, os citratos podem quelar íons

metálicos, e utilizar como

conservantes e suavizadores de água.

O íon citrato é importante também na

biossíntese de Ácidos Graxos e do

Colesterol.

Figura 2: Íon Citrato

A ligação do oxaloacetato provoca uma

mudança conformacional que forma o

sítio de ligação da acetil-CoA,

fechando o sítio de ligação do

oxaloacetato de maneira que o solvente

não pode alcançar o substrato ligado.

A His274 e His320, em suas formas

neutras, e a Asp375 estão como

catalisadoras gerais ácido-base.

1- A etapa limitante é a formação do

enol acetil-CoA, que é estabilizado por

uma ligação de hidrogênio ao ânion

His274 resultante. O enol acetil-CoA

ataca nucleofilicamente o carbono do

grupo carbonil do oxaloacetato.

2 e 3- O intermediário resultante, a

citril-CoA, é hidrolisado, produzindo

citrato e CoA.

Etapa 02a:

Enzima Reguladora: Aconitase (Aconitato hidratase)

A aconitase (também conhecida como Aconitato hidratase) é uma enzima

metaloprotéica que catalisa a estereoisomerização reversível do citrato para o

isocitrato via cis-aconitato no ciclo de Krebs. Em eucariontes duas isozimas são

atualmente conhecidas: uma encontrada na matriz mitocondrial e outra no

citoplasma.

A família aconitase possui outras proteínas. Como assinatura de

reconhecimento utilizam-se duas regiões conservadas que contém as três

cisteínas ligadoras aos íons.

Produtos: O único produto é o cis-aconitato que é o intermediário na reação de citrato

para a formação do isocitrato no ciclo de Krebs.

Figura 3: Cis-Aconitato

Etapa 02b:

Enzima reguladora: Aconitase (Aconitato hidratase)

Produtos: O isocitrato é um intermediário no Ciclo de Krebs.

Figura 4: Isocitrato

Etapa 03a:

Enzima reguladora: Isocitrato-desidrogenase

Esta enzima é importante no metabolismo de carboidratos, e cataliza a

descarboxilação oxidativa de isocitrato em a-cetoglutarato. É dependente de NAD + .

Em eucariontes há pelo menos 3 tipos desta enzima. Duas estão localizadas na

matriz mitocondrial (uma dependente de NAD + e outra dependente do NADP

+ )

enquanto a terceira é citoplasmática.

A região melhor conservada destas enzimas é uma sequência de resíduos rica em

glicina, localizada na porção C-terminal. Estão relacionadas estruturalmente a esta

enzima outras duas: A 3-isopropilmalato desidrogenase que cataliza o terceiro passo da

biossíntese de leucina em bactérias e fungos; e a tartrado desidrogenase que cataliza a

redução de tartrato a oxaloglicolato.

Produtos: O único produto formado é o Oxalosuccinato que é um intermediário no

ciclo de Krebs. Também tem envolvimento no metabolismo do glioxalato e

dicarboxilato ou em processo de fixação de carbono (Kyoto University).

Figura 5: Oxalosuccinato

Etapa 03b:

Enzima reguladora: Isocitrato-desidrogenase

Produtos: O -cetoglutarato é de fundamental importância em oxidação e biossínntese

de aminoácidos, como no metabolismo do butanoato, do ascorbato e aldarato, na

biossíntese da ubiquinona, degradação do triptofano e da lisina, entre outros.

Figura 6: a-cetoglutarato

Etapa 04:

Enzima reguladora:

Componente do complexo multienzimático 2-oxoglutarato-

desidrogenase, responsável pela catálise da conversão total de a-cetoglutarato a

succinil-CoA (um tioéster de alta energia) e CO2. Este complexo contém

múltiplas cópias de 3 componentes enzimáticos: E1 – a-cetoglutarato

desidrogenase; E2 – dihidrilipoamida succiltransferase; E3 – Lipoamida

desidrogenase. A regulação acontece por feedback dos catabólitos. Se localiza

na matriz mitocondrial.

Produtos: Além de ser fundamental no ciclo de Krebs, o Succinil-CoA é formado na

degradação de metionina, isoleucina, valina. Tem sua importância na biossíntese da

Porfirina e em processos envolvendo bases piramídicas, ácidos graxos de cadeia ímpar,

no metabolismo do propanoato e na fixação de gás carbônico, entre outros.

Figura 7: Succinil-CoA

Etapa 05:

GTP = Guanosina TriFosfato; GDP = Guanosina DiFosfato

Enzima reguladora: Succinil-CoA-Sintetase

Esta enzima acopla a clivagem da succinil-CoA de alta energia à sintese de um

nucleosídeo trifosfato de alta energia: o GTP. ATP e GTP são rapidamente

interconvertidos por meio da ação da nucleosídeo difosfatoquinase:

A reação ocorre em três etapas:

Figura 8: Ocorre a formação do Succinil-fosfato, um anidrido de alta energia.

Produtos: O Succinato se apresenta na síntese e degradação de corpos cetônicos, na

síntese do aspartato, metionina, lisina e treonina, no metabolismo do propanoato, do

butanoato e também na fixação de gás carbônico.

Figura 12: Succinato

Até a quinta etapa, o equivalente a um acetil foi completamente oxidado em

duas moléculas de CO2, dois NADH e um GTP foram gerados. Para completar o ciclo,

o succinato deverá ser reconvertido a oxaloacetato. Esta conversão é alcançada pelas

três reações restantes.

Figura 9: Formação do fosforil-His, um intermediário de alta energia, e o succinato.

Figura 11: Transferência do grupo fosforil para o GDP, formando GTP. 0

Etapa 06:

Enzima reguladora: Succinato desidrogenase

É centrada numa flavoproteína (FAD) contendo ferro-enxofre. Em bactérias,

dois distintos complexos enzimáticos ligados à membrana são responsáveis pela

interconversão de fumarato com succinato e redução do FAD a FADH2. Fumarato

redutase é utilizada durante o crescimento anaeróbico. Ambos consistem de dois

componentes principais: um componente extrínseco à membrana composto de uma

flavoproteína que liga-se ao FAD e uma proteína ferro-sulfúrica; e um componente

hidrofóbico composto de uma proteína ancorada à membrana e/ou um citocromo B.

Em eucariontes a succinato desigrongenase mitocondrial é uma enzima

composta de duas subunidades: uma FAD-flovaproteína e uma proteína ferro-sulfúrica.

A subunidade flavoproteína é uma proteína de 60 a 70KDa. O FAD está covalentemente

ligado a um resíduo de histidina localizado na porção N-terminal da proteína. A

sequência ao redor desta histidina é bem conservada de bactérias a espécies

eucarióticas, e pode ser utilizada para reconhecimento.

Obs: 1KDa = 1000u.m.a

Produto: O Fumarato tem participação no ciclo da uréia, no ciclo do ácido cítrico, na

síntese de ribonucleotídeos de bases púricas, na degradação de fenilalanina, tirosina e

leucina, de benzoato via hidroxilação, entre outros processos.

Figura 13: Fumarato

Figura 14: Reação do Succinato

Em geral, o FAD oxida alcanos e alcenos, ao passo que o NAD + participa em

oxidações mais exotérmicas de álcoois e aldeídos ou cetonas.

Etapa 07:

Enzima reguladora: Fumarase (Fumarato hidratase)

As fumarato liases mostram uma curta sequência conservada ao redor de

uma metionina provavelmente envolvida na atividade catalítica deste tipo de

enzimas.

Especialmente a fumarase é uma enzima envolvida no ciclo de Krebs,

que cataliza a hidratação de fumarato em L-Malato.

Produtos: O L-Malato se faz presente nos processos de neoglicogênese, no ciclo do

Ácido cítrico, na fixação de carbono e de gás carbônico como também no metabolismo

do glioxalato e dicarboxilato.

Figura 16: L-Malato

Figura 15: A succinato desidrogenase contém um FAD como grupo prostético covalente ligado a enzima por um resíduo de histidina.

A reação procede por meio de um estado transitório do carbânion. A adição do

OH - ocorre antes da adição do H

+ para a formação do malato.

Etapa 08:

Enzima reguladora: Malato-desidrogenase

A malato-desidrogenase é uma enzima do ciclo de Krebs que cataliza a

converão do malato em oxaloacetato (usando NAD + ) via reação reversível.

Esta enzima também está envolvida na gliconeogênese, a síntese de

glicose a partir de moléculas de menores dimensões. O piruvato na mitocôndria

sofre a ação da piruvato carboxilase para formar oxaloacetato, um intermediário

do Ciclo de Krebs. De modo a que o oxaloacetato seja colocado fora da

mitocôndria, a malato-desidrogenase reduz o oxaloacetato em malato, que

depois atravessa a membrana mitocondrial. No citosol, o malato é oxidado em

oxaloacetato pela malato-desidrogenase citosólica.

Produtos: O oxaloacetato é um -cetoácido presente no ciclo da uréia, do ácido cítrico

na degradação de aspartato e asparagina, na gliconeogênese, na síntese de lisina e

metionina entre outros processos relacionados.

Figura 18: Oxaloacetato

Figura 17: Reação do Fumarato

Por fim, temos uma visão geral do processo denominado Ciclo do Ácido Cítrico,

mais comumente chamado de Ciclo de Krebs:

Figura 19: Reação do Malato

Considerações

1- Dois átomos de carbono deixam o ciclo na forma de CO2. Estes dois átomos que

deixam o ciclo são diferentes dos que entraram na mesma volta (ou seja, não

vieram do Acetil-CoA).

2- Cinco átomos de hidrogênio deixam o ciclo por volta, 3 como NADH e 2 como

FADH2.

3- Duas moléculas de água são consumidas, uma na síntese do citrato e outra na

hidratação do fumarato.

4- Quatro dos oito passos do processo são oxidações e a energia nelas liberada é

conservada, com alta eficiência, na formação dos cofatores reduzidos (NADH e

FADH2).

5- O NADH e o FADH2 produzidos no ciclo são oxidados pela cadeia

transportadora de elétrons na membrana mitocondrial interna. Para cada NADH

oxidado formam-se aproximadamente 3 ATPs e para cada FADH2 formam-se 2

ATPs. Portanto, quando os 3 NADH e o FADH2 são oxidados na cadeia

transportadora de elétrons, formam-se 11 ATPs, mais um GTP formado

diretamente. Ou seja, 12 ligações fosfato de alta energia são formadas para cada

acetil-CoA.

6- O oxigênio não participa diretamente do ciclo do ácido cítrico, porém o ciclo só

funciona em aerobiose, porque o NAD+ e FAD só podem ser regenerados na

mitocôndria pela transferência de elétrons ao oxigênio. Portanto, o ciclo do

ácido cítrico é estritamente aeróbico.

Regulação do Ciclo do Ácido Cítrico

Os três mecanismos de controle do ciclo: (1) disponibilidade de substratos, (2)

inibição pelo produto, (3) inibição competitiva da retroalimentação pelos intermediários

ao longo do ciclo.

A necessidade de intermediários do ciclo do ácido cítrico como percussores

biossintéticos e a demanda de ATP influenciam em sua operação. Os reguladores mais

importantes são o Acetil-CoA, Oxaloacetato e o NADH.

O fluxo metabólico pela citrato sintetase varia com as concentrações dos

substratos e é controlado pela disponibilidade destes substratos. A concentração do

Oxaloacetato está em equilíbrio com o malato e varia com a proporção

[NADH]/[NAD + ], de acordo com a expressão:

[ ] [ ]

[ ] [ ]

A descarboxilação do piruvato pelo complexo da piruvato desidrogenase é

irreversível e como não há outras vias para a síntese de Acetil-CoA a partir do piruvato

em mamíferos, a reação deve ser controlada de modo preciso.

Há uma inibição deste processo pelos produtos NADH e Acetil-CoA que

competem com o NAD + e com a CoA pelos sítios de ligação nas respectivas enzimas.

Há regulação do ciclo também pela modificação covalente pela

fosforilação/desfosforilação da enzima piruvato desidrogenase – a fosforilação inativa o

complexo desta enzima.

Se a carga de trabalho aumenta, a concentração de NADH mitocondrial

diminuirá e consequentemente, aumenta a concentração de oxaloacetato, estimulando a

reação da citrato sintetase.

A taxa de consumo do citrato depende da atividade da isocitrato desidrogenase

NAD + -dependente, a qual é fortemente inibida pelo produto NAD

+ . Outro exemplo de

inibição pelo produto é a inibição da citrato sintetase pelo citrato, que compete com o

oxaloacetato. A succinil-CoA também compete com a acetil-CoA na reação da citrato

sintetase, exemplo de inibição competitiva por retroalimentação.

Reações relacionadas ao Ciclo do Ácido Cítrico

Existem reações anfibólicas no

ciclo do ácido cítrico e com seus

produtos intermediários. Reações

anfibólicas são reações de catabólicas e

anabólicas. Várias vias biossintéticas

utilizam os intermediários do ciclo como

reagentes para reações anabólicas.

Intermediários do ciclo que foram

desviados podem ser reabastecidos por

reações anapleróticas (reações de

preenchimento). A mais importante é

catalisada pela piruvato carboxilase, que

produz oxaloacetato a partir do piruvato.

Qualquer diminuição da

velocidade do ciclo causada pela

insuficiência de oxaloacetato ou outros

intermediários leva a um aumento da

concentração de acetil-CoA. Tal aumento

ativa a piruvato carboxilase que

reabastece o oxaloacetato.

Percebe-se, portanto, que uma série de reações intramitocondriais e

extramitocondriais são necessárias para que se obtenha sucesso no ciclo.

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