Cultura de tecidos - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Cultura de tecidos - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da cultura de tecidos, Cultura de tecidos desorganizados, Cultura de estruturas organizadas, Cultura de órgãos.
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Apostila Biotecnologia

As biotecnologias em seu sentido mais amplo compreendem a manipula- ção de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obtenção de proces- sos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a apli- cação dos conhecimentos de fisiologia, bioquímica e genética, é considerada como técnica biotecnológica. Em seu senso mais restrito as biotecnologias es- tão associadas ao emprego das técnicas modernas de biologia molecular e ce- lular. Outros conceitos de biotecnologias: a) a utilização de sistemas celulares para a obtenção de produtos e desenvolvimento de processos (CNPq); b) a a- plicação dos princípios científicos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes biológicos proporcionando produtos ou serviços (FAO, 1989); c) o uso das técnicas de regeneração in vitro e do DNA recombinante (Fernandes, 1987).

Uma das principais características das biotecnologias modernas é sua a- brangência ampla e seu caráter multidisciplinar. Sua inserção em países com padrões desiguais de desenvolvimento deve ser baseada no conceito de biotec- nologias apropriadas ou pertinentes, proposto pela FAO. Assim, biotecnolgias apropriadas seriam aquelas que contribuem com o desenvolvimento sustentá- vel por: a) serem tecnicamente factíveis no atual contexto de desenvolvimento tecnico-científico do país; b) proporcionarem benefícios mensuráveis aos des- tinatários; c) serem ambientalmente seguras, socio-economicamente e cultural- mente aceitáveis no atual estágio de desenvolvimento do país.

Dentre as muitas aplicações destas técnicas, destacam-se aquelas relaciona- das com a transferência de genes de organismos diferentes para a incorporação de características como a resistência de pragas e patógenos e a estresses abióti- cos, no genoma de uma determinada planta. Outras aplicações visam o aumen- to da eficiência fotossintética ou a produção de metabólitos e constituintes im- portantes do ponto de vista nutricional e farmacêutico . Estas técnicas, quando associadas com procedimentos de cultura de tecidos, permitem a propagação rápida e massal de genótipos superiores estáveis e isentos de doenças.

Novas estratégias para a propagação clonal, para a fixação de ganhos gené- ticos e novas abordagens para gerar variação genética são requisitos funda- mentais para o melhoramento de plantas. Desta maneira, um dos maiores be- nefícios das técnicas de cultura de tecidos vegetais para o melhoramento de plantas perenes, refere-se à possibilidade de capturar e fixar os componentes aditivos e não aditivos da variância genética através da propagação clonal. Desta maneira estas técnicas, baseadas que são na totipotencialidade de ex- plantes, podem se tornar ferramentas poderosas para a propagação massal de genótipos superiores.

A possibilidade de manipulação de sistemas in vitro para a clonagem de genótipos superiores de espécies vegetais é dependente de uma série de fato- res. A compreensão e domínio de conceitos básicos em fisiologia do desen- volvimento é de fundamental importância para a aplicação deste conhecimen- to. Um dos objetivos do presente texto é a apresentação e a discussão sucinta dos principais tópicos pelos quais é possível extrair-se respostas morfogenéti- cas orientadas quando correlações morfológicas, fisiológicas, genéticas e bio- químicas, existentes em uma planta intacta são rompidas e sistemas de culturas de tecidos células e órgãos são utilizados para "orientar" novos padrões morfo- genéticos.

Introdução ao conceito de Biotecnologia

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1.1 Cultura de tecidos desorganizadosCalos – Cultivo e manutenção de massas celulares desorganizadas que se originam da proliferação

desordenada a partir de tecidos ou órgãos cultivados in vitro. Suspensões – Proliferação de células isoladas ou pequenos aglomerados dispersos em um meio líqui-

do, sob agitação. 1.2 Cultura de estruturas organizadasCultura de órgãos – Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro.

Inclui o isolamento asséptico de estruturas definidas como primórdios e segmentos foliares. Para os propósitos da micropropagação, os mais importantes tipos são:

a)Cultura de meristemas – Ápices meristemáticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou dois primórdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares.

b) Cultura de ápices caulinares – Iniciada a partir de ápices caulinares ou gemas laterais. Empregada para estabelecer culturas que originam multígemas, gemas, eixos ou brotações caulinares múlti- plos.

c)Culturas de segmentos nodais – Contém segmentos caulinares que carregam gemas simples ou múltiplas.

d) Cultura (ou resgate) de embriões – Embriões zigóticos são excisados e cultivados para dar origem à plântulas.

e) Cultura de raízes isoladas – Raízes cultivadas sem conexão com os eixos caulinares, originando novas raízes.

1.3 Quanto a rota morfogenética1. Organogênese direta – Gemas ou primórdios de gemas pré-existentes que são induzidas à prolife-

ração. 2.Organogênese indireta – Novas gemas e eixos caulinares são induzidos e formados a partir de teci-

dos não organizados (calos) originados de explantes de diferentes origens. 2. BASE CONCEITUALÁpice caulinar: segmento do ápice do caule, composto pelo meristema apical (0,05 a 1,0 mm) junta-

mente com os primórdios foliares e folhas em desenvolvimento. Porém, não deve ser confundido com o meristema, que é o conjunto de células indiferenciadas e de características embrionárias.

Ativação: processo que favorece a reentrada ao novo ciclo bioquímico oi fisiológico de órgão ou tecido. É muito comum referir-se a ativação de gemas. Para ocorrer a ativação é necessária a existência de órgão ou tecido pré formado ou formado.

Células indiferenciadas: refere-se ao estado caracterizado por células isodiamétricas, com pouco ou nenhum vacúolo e grande núcleo. Geralmente estão localizadas no meristema e mantém as ca- racterísticas embrionárias.

Ciclo celular: processo ou fases celulares de divi-

são padrão. Enquadra-se em dois grandes grupos: meiose e mitóse, que em um organis- mo diplóide pode originar respectivamente u- ma nova célula haplóide, quando ocorre a saí- da do ciclo celular no final de G2 (sem a dupli- cação dos cromossomos) ou diplóide, quando do completo processo de divisão celular (cdc).

Figura 01 – Diagrama representativo do ciclo de divisão celular (cdc) de uma célula diplóide.(Adaptado de George, 1993).

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Micropropagação Diferentes rotas morfogenéticas para a obtenção de plantas in vitro

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Clones: Independente da origem e sob o aspecto aplicado, as técnicas de cultura de tecidos vegetais permitem a propagação clonal massal de genótipos superiores. Segundo o Código Internacional de Nomenclatura de Plantas Cultivadas, clone é uma das categorias básicas da cultivar e designa um conjunto geneticamente uniforme de indivíduos, derivados originalmente de um individuo sim- ples por propagação assexuada (enxertia, estaquia, mergulhia, apomixia ou micropropagação). O conceito de propagação clonal implica na seleção de genótipos com graus variados de heterozigo- se e sua fixação nas gerações subseqüentes (Kester, 1983). Clones são empregados no melhora- mento de plantas para capturar os componentes aditivos e não-aditivos da variância genética. Os componentes aditivos da variância genética baseiam-se no efeito independente dos alelos, en- quanto que os efeitos não-aditivos, muitas vezes perdidos nos cruzamentos sexuais, baseiam-se na interação dos alelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Uma das maiores vantagens da pro- pagação clonal é a possibilidade de se explorar a variância genética total, ao invés dos componen- te aditivo apenas. Muitos dos programas de melhoramento genético de plantas perenes e estabe- lecidos no hemisfério norte, a partir da década de 50, foram baseados na seleção recorrente. Nes- tes programas a seleção é feita após cada geração de intercruzamentos de materiais selecionados para proporcionar a recombi- nação genética. Enquanto que o melhora- mento convencional permite a fixação dos ganhos genéticos nas gerações subse- qüentes, a micropropagação permite a ex- ploração da variação genética em uma ge- ração, através da clonagem de genótipos superiores (Figura 2). Apesar dos benefí- cios dos clones para a agricultura, a con- centração de uma produção em larga esca- la de apenas um genótipo ou de poucos genótipos de origem comum pode tornar todas as plantas igualmente vulneráveis à pragas e moléstias ou estresses abióticos e pode também diminuir o interesse na ma- nutenção de uma diversidade mais ampla nos bancos de germoplasma existentes, resultando no estreitamento da base gené- tica.

Crescimento desorganizado: Quando, tecidos formados in vitro, não apresentam estruturas claramen- te definidas e contém um número limitado de células especializadas e diferenciadas. Uma célula diferenciada é aquela que desenvolveu forma especializada (morfologia) ou função especializada (fisiologia). Um tecido organizado é a agregação de células diferenciadas (ex. xilema ou epiderme). Por outro lado estruturas indiferenciadas podem ocorrer na indução de calos que são agregados celulares desorganizados que se originam da proliferação desordenada a partir de tecidos ou ór- gãos cultivados in vitro e por meio de suspensões celulares que são a proliferação de células isola- das ou pequenos aglomerados de células dispersos em um meio líquido, sob agitação

Crescimento organizado – Tecido ou órgão de crescimento determinado em produzir um novo órgão (desenvolvimento) de forma a resultar novas estruturas vegetais. Crescimento pós meristemático.

Competência celular: Capacidade das células reagirem a sinais (que podem ser reguladores de cresci- mento) específicos de desenvolvimento. Diz respeito à capacidade das células em expressar um potencial inerente. Esta habilidade da célula pode se dar por: a) Ativação que pode ser definida como a mudança na competência envolvendo a rediferenciação de determinadas células (modelos diretos); b) Indução: que pode ser definida como a iniciação de uma resposta particular de diferen- ciação a partir da desdiferenciação celular (modelos indiretos). A indução está associada à proces- sos de desdiferenciação, que pode ser definida como a (re)entrada no ciclo celular. Buvat (1944) demonstrou que a desdiferenciação celular consiste de dois estágios: regressão à capacidade de divisão e retorno à estrutura citológica de célula meristemática (embrionária)

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Figura 02 - Exploração da variação genética em uma geração, através da clonagem de genótipos superiores.

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Cultura de órgãos: Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. In- clui o isolamento asséptico de estruturas definidas como primórdios e segmentos foliares. Para os propósitos da micropropagação, os mais importantes tipos são:

f) Cultura de meristemas: Ápices meristemáticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um ou dois primórdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares.

g) Cultura de ápices caulinares – Iniciada a partir de ápices caulinares ou gemas laterais. Empregada para estabelecer culturas que originam multígemas, gemas, eixos ou brotações caulinares múltiplos.

h) Culturas de segmentos nodais – Contém segmentos caulinares que carregam gemas simples ou múltiplas.

i) Cultura (ou resgate) de embriões – Embriões zigóticos são excisados e cultivados para dar origem à plântulas.

j) Cultura de raízes isoladas – Raízes cultivadas sem conexão com os eixos caulinares, originando no- vas raízes.

Diferenciação: processo de diversificação das características bioquímicas, anatômicas, morfológicas e fisiológicas, ocorrida nas células, nos tecidos ou órgãos durante o desenvolvimento a partir do esta- do meristemático ou juvenil para o adulto. As células do embrião meristema apical são exemplos de estado indiferenciado, as quais ganham novas competências se tornando diferenciadas.

Desdiferenciação celular: retorno de células diferenciadas ao estado meristemático não diferenciado. Determinação celular: Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célula torna-se limita-

do a uma rota específica (Christianson,1985). A determinação celular diz respeito a uma canaliza- ção progressiva no desenvolvimento.

Epigênese: Ativação seletiva e diferencial de genes (reprogramação celular). Um exemplo comumente citado como representativo em uma planta intacta é a transição da fase juvenil para a fase adulta.

Epistasia: refere-se à inativação de um (trans)gene (o supressor) sobre um outro (trans)gene. Indução: é o desencadeamento de um processo morfogenético pela exposição do explante a um estímu-

lo físico, químico ou biológico. A indução envolve o controle da expressão gênica, embora não seja um fenômeno genético, pois não ocorre ganho ou perda genética (modificação alélica ou genotípi- ca). Refere-se somente a expressão dos genes pré existentes. Em cultura de tecidos, é a sinaliza- ção por um fitormônio a uma resposta específica a nível celular.

Haplóide: indivíduo que apresenta o número de cromossomoss igual ao do gametófito ou da haplofase (n). de maneira mais específica, plantas haplóides são aquelas com carga cromossômica não dupli- cada, monoplóides.

Hormônios vegetais: No presente contexto este têrmo define uma das classes de compostos que regu- lam processos de desenvolvimento (morfogênese) em plantas, sendo, provavelmente, os mais im- portantes mediadores na transdução de sinais. Os hormônios são moléculas regulatórias de ocor- rência natural que agem como sinais químicos para regular o crescimento e o desenvolvimento (morfogênese). Fitorreguladores ou reguladores de crescimento são substâncias sintéticas que mi- metizam os efeitos dos hormônios no metabolismo celular.

Meristema: tecido composto de células não diferenciadas, envolvido com síntese protoplasmática e for- mação de novas células por divisão mitótica. Sem especificação, o termo refere-se normalmente ao meristema apical do caule (região localizada numa depressão central que dá origem aos mais novos primórdios foliares de tamanho variável entre espécies vegetais, normalmente formado por uma por- ção de 60 a 100 células isodiamétricas indiferenciadas, que mantém permanentemente as caracte- rísticas embrionárias primárias.

Micropropagação: Propagação clonal massal de um genótipo selecionado por técnicas de cultura in vi- tro. Este têrmo, utilizado primeiramente por Hartman e Kester (1975), passou a ser empregado para definir os processos de propagação vegetativa na cultura de tecidos vegetais.

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Morfogênese: Integração entre crescimento (mudanças quantitativas) e diferenciação (alterações quali- tativas), mediada por divisão e especialização celular. A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, através da regulação e expressão de sistemas gêni- cos múltiplos. A morfogênese na planta intacta é mediada pela ação correlativa dos meristemas e de seus produtos. Na cultura de tecidos vegetais, ao se romper as correlações endógenas os teci- dos ficam sujeitos às condições exógenas, representadas no caso pelos fitorreguladores adiciona- dos ao meio de cultura. A morfogênese in vitro passa então a ser modulada pelo balanço de fitorre- guladores adicionados ao meio de cultura. Isto foi comprovado experimentalmente por Skoog e Mil- ler (1955) e cujos resultados são sumarizados na figura 03.

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Figura 03 - Morfogênese in vitro modulada pelo balanço de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura.

Totipotencialidade: Princípio biológico creditado ao fisiologista vegetal alemão Haberlandt, que em 1902, enunciou que cada célula vegetal possuía o potencial genético para reproduzir um organismo inteiro. Como corolário, este fisiologista elaborou previsões de que tecidos, células e órgãos poderiam ser mantidas indefinidamente em cultura. De certa forma o conceito de totipotencialidade já era inerente à teoria celular de Schleiden e Schwan (1838 apud Vasil et al., 1979) ao postularem que algumas células eram capazes de serem separadas do organismo e continuar a crescer

3. MECANISMOS REPRODUTIVOS E PADRÕES DE DESENVOLVIMENTO ENTRE ANIMAIS E PLANTAS Plantas e animais apresentam similaridades na natureza de seu material genético e nos mecanismos

pelos quais a informação genética é processada e utilizada. Nos outros níveis as diferenças são óbvias e consideráveis:

A) Plantas não estabelecem uma linhagem germinativa específica, não havendo distinção entre células que formam o organismo e as células reprodutivas. Em animais os gametas são produzidos apenas por células-filhas descendentes de uma linhagem germinativa. Todas a células vegetais nucleadas, possuem, em princípio, a capacidade de produzir um novo individuo (totipotencialidade) e a possibilidade de uma célula produzir gametas é apenas uma função de sua localização no organismo.

B) Plantas se reproduzem tanto sexuada como assexuadamente. C) O ciclo de vida de uma planta é mais elaborado e complexo do que em animais. Neste a reprodução

resulta da produção direta de gametas como resultado da meiose na linhagem de células germinativas. O ciclo de vida das plantas envolve duas gerações alternantes. A geração dominante é a esporofítica e inicia com a fertilização do ovo e culmina com o desenvolvimento e maturação. A geração gametofítica, através da microsporogênese e megasporogênese gera respectivamente pólen e saco embrionário. Um dos núcleos da célula espermática masculina fecunda o ovo para formar o zigôto, marcando o fim da geração gametofítica e o início da esporofítica. A embriogênese é acompanhada pela formação da semente. que é, em última análise, uma estrutura complexa para nutrir o embrião.

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O desenvolvimento animal pode ser confundido com desenvolvimento embriológico, uma vez que nesta fase são formados os órgãos componentes do seu organismo. Possivelmente isto confere maior determinação (canalização de desenvolvimento) às células vegetais e o retorno ao estado embrionário de uma célula animal adulta somente ocorre por meio da transferência nuclear que gerou a clonagem da ovelha Dolly (Fig. 4). Ao contrário, no desenvolvimento embrionário de plantas superiores a maior parte dos sistemas de tecidos e órgãos não estão presentes. Estes somente são formados depois da germinação e a longo da vida da planta através da diferenciação de uma linhagem de células embrionárias mantidas nos meristemas. Outro aspecto que diferencia a morfogênese animal da vegetal é que na primeira, as células, tornam-se direcionadas para um caminho particular e específico de desenvolvimento, enquanto que nas células vegetais este direcionamento pode ser reversível. Toda a célula nucleada, mesmo diferenciada, pode ser induzida à uma re-entrada no ciclo mitótico, desde que ativada com o sinal adequado. Em células animais, portanto, a totipotencialidade encontra-se restrita a uma fase específica e limitada do desenvolvimento embrionário. A migração celular é componente importante da morfogênese animal. Células animais possuem motilidade e migram em direções definidas de acordo com as informações recebidas de outras células. Por sua vez, a rota de desenvolvimento de uma célula vegetal é determinada pela sua posição na estrutura da planta. Não apresentando mobilidade, a posição das células vegetais é determinada pelos planos de divisão da célula-mãe. Mesmo considerando que as interações entre as células têm papel fundamental na morfogênese animal e vegetal, a natureza das informações trocadas é mais limitada em plantas do que em animais.

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Figura 04 – Processo de obtenção de clones animais

4 MEIOS DE CULTIVO4.1. INTRODUÇÃO Meios de cultivo são combinações de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento. Podem ser sólidos (adicionando-se ágar ou outro agente para geleificação) ou líquidos, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos utilizados para as culturas fornecem as substâncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão do desenvolvimento in vitro (Torres, 1998). A constituição do meio é baseada nas exigên- cias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender em necessida- des específicas. Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apre- senta baixo nível de nitrogênio e de potássio, restringindo o seu uso para muitas células; entretanto, esta formulação com baixa concentração em sais, é usada em muitas situações. O meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi uma das primeiras formulações melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos níveis de nitrato, potássio e amônio.

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4.2. COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios nutritivos são formados por múltiplos componentes, sendo bastante variáveis em função da es-

pécie vegetal e da origem do explante. É constituído de componentes essenciais e opcionais. Os es- senciais compreendem a água, os sais inorgânicos, a fonte de carbono e energia, vitaminas e subs- tâncias reguladoras de crescimento. Entre os componentes adicionais estão incluídos os aminoácidos e amidas, ácidos orgânicos e substâncias naturais complexas. Os principais componentes de uso mais freqüente nos meios de cultura são:

4.2.1 Água É o componente em maior quantidade do meio de cultura. A qualidade da água é muito importante em

cultura de tecidos vegetais. Pode ser uma fonte potencial de impurezas. Para melhor controle deve- se usar água destilada, bidestilada e deionizada. A utilização de água de torneira pode comprometer o desenvolvimento da cultura.

Em alguns explantes como calos de fumo a quantidade de água pode ser limitante para o desenvolvimen- to normal (Linsmaier & Skoog, 1965; Torres, 1998).

4.2.2 Nutrição mineral Os nutrientes empregados nos meios de cultura são os mesmo estabelecidos para a nutrição mineral bá-

sica das plantas no campo. São eles: a) Nitrogênio: pode ser acrescentado aos meios na forma orgânica (prontamente disponível as culturas)

ou na forma mineral. Na forma pode estar disponível como amônio (cátion) ou nitrato, nitrato (ânion), ou ainda na forma de compostos orgânicos, dependendo do material em cultura (George, 1993). É constituinte de aminoácidos, nucleotídeos e coenzimas, tendo importância na síntese protéica. A toxi- dez do amônio às células diminui ou desaparece quando ele é usado como única fonte de nitrogênio na forma de sal de um ácido orgânico, de preferência um ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs), como ácido cítrico ou ácido alfa-cetoglutarico (Torres, 1998). A glutamina (precursora de vários aminoáci- dos) é a mais utilizada como fonte de nitrogênio orgânico. Meios enriquecidos com nitrogênio são fun- damentais para a embriogênese somática, bem como diferenciação de parte aérea (Amirato, et. al. 1983).

b) Fósforo: é adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potássio monobásico (H2PO4-), pois é a forma que é absorvido(George, 1993). O fosfato monobásico no meio MS é utilizado na concen- tração de 1,25 mM. Algumas fontes orgânicas podem ser utilizadas quando existem restrições aos fosfatos minerais (Torres, 1998). Atua no metabolismo energético, na regulação de processos enzi- máticos e na ativação de enzimas (Santiago, 20010). Necessário para a síntese do ATP e na organo- gênese está envolvido na diferenciação da parte aérea, pois reverte o efeito das auxinas.

c) Potássio: é usado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de várias enzimas do metabolismo de carboidratos e proteínas. Uma das mais importantes é a quinase do piruvato, enzima envolvida nos processos de glicólise e respiração (Santiago, 2001). É necessário para a embriogênese somáti- ca (Ammirato, 1983). A deficiência de potássio pode conduzir a hiperhidricidade e decréscimo na taxa de absorção de fosfato.

d) Enxofre: utilizado na forma de sulfato ou na forma de aminoácidos (cistina, cisteína e metionina). En- volvido no metabolismo energértico na formação do fosfosulfato de adenosina, constituinte da tiami- na, biotina e coenzima A. Sua absorção é relacionada à assimilação do nitrogênio e, independente- mente, do pH (Santiago, 2001).

e) Cálcio: usado na forma de nitrato ou cloreto. Está envolvido na divisão celular, uma vez que um dos componentes da lamela média é o pectato de cálcio. Mantém a integridade da membrana celular e é importante para a germinação de grãos de pólen (George, 1993). É um agente quimiotrófico para o direcionamento do tubo polínico. Altas concentrações de cálcio (6 a 9 mM) são necessárias para con- trole da necrose do ápice caulinar.Pode ter limitações na translocação entre as células.

f) Magnésio: usado na forma de sulfato de magnésio. Ë um dos componentes da clorofila; co-fator impor- tante para várias reações enzimáticas que atuam sobre substratos fosforilados.

g) Carbono: é uma fonte importante de energia é a forma o esqueleto de todos os compostos orgânicos. A suplemenação gralmente é pela adição de açúcar na forma de sacarose, glicose, frutose e outras.

h) Ferro: está numa faixa intermediária entre os macros e micronutrientes. É adicionado ao meio na for- ma quelato Fe-EDTA. Envolvido nas reações de oxi-redução nos organismos vivos. Essencial para a síntese da clorofila, é integrante do grupo protéico (heme) das porfirinas.

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j) Molibidênio: é adicionado na forma de molibidato de sódio (Na2Mo04). Co-fator da redutase do nitrato. k) Cobre: é usado como sulfato de cobre. È um cátion que em dose acima do normal é fitotóxico às cultu-

ras. Constituinte da enzima plastocianina que é importante componente do transporte de elétrons. l) Cloro: é essencial para a fotossíntese, sendo requerido durante a reação de Hill. m) Zinco: sulfato de zinco. Importante nas reações de oxi-redução das plantas. Co-fator de enzimas ani-

drase carbônica. n) Manganês: sulfato de manganês. Essencial no metabolismo para a reação de Hill na fotossíntese,

quando a molécula de água é quebrada produzindo elétrons e oxigênio. o) Cobalto: é usado como cloreto de cobalto e está envolvido na expansão foliar. 4.2.3. Constituintes orgânicos Os compostos orgânicos importantes são os carboidratos, substâncias reguladoras de crescimento, vita-

minas, aminoácidos e amidas, certas purinas e pirimidinas, hexitóis e ácidos orgânicos. a) Carboidratos As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram condições adequadas de iluminação e

concentração de CO2 e, as vezes, não apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotos- síntese (Torres, 1998). Muitas vezes, açúcares que não são efetivos na manutenção do crescimento do calo, sustentam a iniciação de brotações adventícias e a embriogênese somática.

Os carboidratos mais usados nos meios de ciultura são a sacarose, a glicose e a frutose nos níveis de 2% a 5% (p/p) (George, 1993). A concentração de 3% é a mais usada. Concentrações de sacarose entre 6% a 12% podem ser usadas em cultura de embriões, frutos e anteras, enquanto que o nível de 1,5% é usado em cultura de protoplastos.

Pode ocorrer a caramelização do açúcar quando exceder o tempo de autoclavagem e a sua degradação pode ocorrer a formação de hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2-metilfurano, 2,5-dimetilfurano e maltol (Ammirato et. al. 1983). Estes compostos formam meladoidinas que são compostos de colo- ração amarronzada, de alto peso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O açúcar é purifica- do com acetato, para precipitar impurezas e pode conter alto nível de zinco que é tóxico para o teci- do.

Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio. b) Aminoácidos e amidas A suplementação pode ser realizada pela inclusão de uma proteína hidrolisada ao meio. Qualquer efeito

benéfico pode ser avaliado pela substituição desta proteína por uma mistura de aminoácidos e ami- das. Os aminoácidos e amidas têm importância na amplificação das respostas morfogenéticas, pro- porcionando maior crescimento e facilitando a diferenciação no sentido da regeneração. As formas "L" dos aminoácidos são de ocorrência natural. A tirosina apresenta influencia na iniciação de parte aérea em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obtenção de embriões haplóides mediante o cultivo de micrósporo. As amidas L-glutamina e L-aspagarina são benéficas na obtenção de embriões somáticos, e a cisteína é incluída, às vezes, como agente redutor.

c) Vitaminas Vitaminas são compostos orgânicos que, em baixas concentrações, desempenham funções reguladoras

catalíticas no metabolismo celular. A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos é a tia- mina (B1). A tiamina é solúvel em água. Outras vitaminas utilizadas incluem ácido nicotínico (B3) e piridoxina (B6). Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da autoclavagem, a esteriliza- ção a frio é recomendada.

• Vitamina A: não utilizada nos meio pois, ainda não foi ainda encontrada nas plantas. • Riboflavina (Vit. B2): componente da coenzima FMN (Flavina mononucleotídeo) e o FAD (Flavina-

adenina-dinucleotídeo) que atuam em oxidações biológicas. Na fotossíntese FMN participa do trans- porte de elétrons (George, 1996).

Tiamina (Vit. B1): atua no metabolismo celular devido à função como coenzima na descarboxilação dos cetoácidos. Ex: Piruvato e cetoglutarato (George, 1996).

Ácido pantotênico: É um dos componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo de lipídios.

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Ácido nicotínico (Niacina ou Vitamina B3): É um componente das coenzimas NAD e NADP importan- tes na transferência de hidrogênio.

Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B6): Fazem parte de coenzima metabólicas de aminoácidos. Estas vitaminas têm papel importante nas reações de transaminação e descarboxilação (George, 1996).

Biotina: atua no metabolismo do ácido aspártico, e nas reações do ciclo de Krebs que levam à forma- ção deste ácido (Ammirato, 1983).

Ácido ascórbico (vitamina C): Catalisador de fosforilização fotossintética devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente (Santiago, 2001).

d) Outros suplementos orgânicos- Misturas complexas: São preparações obtidas de produtos naturais, de composição indefinida, que servem para enriquecer o

meio de cultivo. A composição destes produtos é de difícil determinação e de uso restrito a algumas culturas e de difícil repetição experimental, quando as tentativas de adequação não forem suficientes para promover determinado processo morfogenético. Em trabalhos de rotina, estas preparações po- dem ser usadas caso estimulem respostas desejadas.

Proteínas hidrolisadas: a mais comum é a caseína hidrolisada, por ser importante fonte de aminoáci- dos. Outras também são utilizadas: lacto-albumina hidrolisada, triptona, peptona, etc.

Suco de laranja, tomate e outros: contém ácido cítrico e outras substâncias de crescimento não identi- ficadas.

Leite de coco: É o endosperma de Cocus nucifera na fase líquida ou gelatinosa. É um suplemento bas- tante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio.

Extrato de leveduras: É fonte de aminoácidos e vitaminas. • Polpa de Banana: usada na suplementação do meio de cultura de orquídeas. - Hexitóis: Os hexitóis são compostos cíclicos com grupos –OH em todos os seis carbonos. O mais usado é o inosi-

tol, myo-inositol é a forma inativa e i-inositol é a ativa. O meso-inositol é uma mistura das formas d e l. O inositol é considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir como fonte de carboidrato. Desempenha papel importante na biossíntese do ciclitol, no armazenamento de com- postos polihídricos como reserva, na germinação de sementes, no transporte de açúcar, na nutrição mineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de membranas, formação de parede celular, homeostase de hormônios e no estresse fisiológico (Santiago et. al. 2001).

- Compostos fenólicos: São compostos derivados de fenólicos (mono-OH) e atuam em processos que promovem o desenvolvi-

mento aéreo enquanto que os derivados fenólicos (bi-OH) estão envolvidos com a iniciação de raízes (George, 1996). Estas substâncias atuam na degradação oxidativa do AIA. Por outro lado, compostos fenólicos (bi-OH) inibem a degradação oxidativa do AIA, tendo efeito benéfico no enraizamento (Santiago et. al. 2001).

- Ácidos orgânicos: A adição de ácidos de compostos intermediários do ciclo de Krebs, tais como malato ou citrato, é comum

em meio destinado à cultura de protoplastos (Santiago, 2001). Estes compostos parecem estar envol- vidos na minimização do efeito inibitor da amônia. Por serem soluções antioxidantes são preparadas usando uma mistura de 100 mg de ácido ascórbico e 150 mg de ácido cítrico, dissolvido em 1litro de água e sua esterilização é feita em filtro bacteriológico de 0,22 ou 0,45 micras (Ammirato, 1983; San- tiago, 2001). O ácido ascórbico e o ácido cítrico são usados para prevenir o escurecimento de tecidos excisados de plantas.

- Purinas e Pirimidinas: A concentração mais usada varia de 40 a 160 mg/L. As bases nitrogenadas citosina e guanina podem

também promover o crescimento de cultura de calo. A adenina ou o sulfato de adenina estimulam o crescimento de brotações in vitro.

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4.2.3. Reguladores do crescimento vegetal Para ocorrer o desenvolvimento ou a entrada de atividade de um determinado possesso é necessário a

sinalização específica por reguladores de crescimento em sítios regulador por kinases. O controle químico da diferenciação da parte aérea foi primeiramente observado em cultura de calo de

tabaco. Foi observada inibição na formação de gemas por auxinas, e reversão deste efeito estimulan- do brotações utilizando-se adenina bem como o fosfato inorgânico. Esta foi a constatação de que o processo de organogênese in vitro é controlado por substâncias hormonais sendo que o desenvolvi- mento de parte aérea, raiz ou calo é determinado pelo balanço entre auxinas e citocininas.

O balanço de auxinas/citocininas em alto/baixo favorecem o enraizamento e o balanço inverso promove a formação de parte aérea. Concentrações iguais promovem a produção de calos.

As auxinas nos meios variam de 0,01 a 10 mg/L. As auxinas mais usadas são AIA (ácido indol-3-acético), AIB (ácido indol-3-butirico), ANA, 2,4-D, 2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D é bastante usada para a indução de calos e tem o efeito de supressão da morfogênese. As auxinas 2,4-D e ANA são sintéticas e têm efeitos semelhantes às auxinas de ocorrências naturais, sendo mais estáveis à de- gradação. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiacético (2,4,5-T) e o picloran induzem a formação de calos em monocotiledôneas (Ammirato, 1983). As auxinas são termo-estáveis, não decompondo quando auto- clavadas. O AIA é a auxina natural e a menos estável, sendo destruído em pH baixo.

A não ser o 2,4 D e ANA, as soluções estoques não devem ser armazenadas por mais de uma semana. A dissolução das auxinas é feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base para dissolver 10 mg de auxina.

As citocininas são derivadas da adenina (aminopurina) e têm um papel fun- damental na diferenciação e regene- ração de plantas na maioria das es- pécies (Santiago, 2001). Induzem a divisão celular, proliferação e morfo- gênese da parte aérea. As citocini- nas mais usadas em cultura de teci- dos são a cinetina (CIN), benzilade- nina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ).

O ácido giberélico (GA3) é usado, algu- mas vezes, em cultura de meriste- mas, na recuperação de plantas li- vres de vírus. O GA3 deve ser dis- solvido em água com pH ajustado a 5,7 ou em base (NaOH 1N). As solu- ções de GA3 devem ser esteriliza- das em filtro bacteriológico uma vez que esta substância se decompõe por autoclavagem. As soluções es- toques devem ser preparadas na hora.

O ácido abscísico (ABA) está envolvido na dormência e abscisão de folhas e frutos. Na cultura de tecidos o papel deste composto aestá envolvido principalmente na maturação de em- briões obtidos na embriogênese so- mática. Este composto é termo- estável e fotossensível, recomenda-

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Figura 06 – Estrutura química dos principais regulado- res de crescimento vegetal.

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4.2.4. pH O pH dos meios nutritivos em culturas de células vegetais é normalmente ajustado com HCl ou Na- OH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente ácido, entre 5 e 6 (normalmente 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulações líquidas. Em meios gelificados com ágar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrólise de polissa- carídeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitação de sais (George, 1996). No ajuste do pH, lava-se primeiramente o eletrôdo e, em seguida, faz-se a leitura em tampão 4,0. Posterior- mente lava-se o eletrôdo e desta maneira o potenciômetro estará calibrado para uso. O pH varia du- rante o período de cultura.

4.2.5. Materiais de suportea) Ágar

Ágar é um polissacarídeo obtido pela purificação de algas marinhas. A concentração usada varia de 0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O ágar impuro é constituído de polissacarídeos, aminoácidos, sais, açú- car, etc., devendo ser lavado em água destilada antes de ser usado. O ágar é alcalino, líquido à temperatura de 80°C e se solidifica à 40°C. É necessário a aquisição de agar de boa qualidade, pois podem ser tóxicos em algumas condições de cultivo (Guerra, 2002). Outros produtos gelificantes são Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). São mais puros que o ágar e provenientes de fermentações bacterianas (George, 1996). Usados na concentração de 0,2% (2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar vitrificação em algumas espécies. Alguns laboratórios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes, porém apresentam restrições quanto a longevidade por degradar ao longo do cultivo.

b) pontes de papel Em muitas cultura não é possível utilizar agentes geleificantes ao meio e também não é possível o uso em imersão em meios líquidos, nestes casos então, usa-se pontes de papel com meios líquidos. Utilizado principalmente no resgate de embriões imaturos e no cultivo de ovários.

c) Outros produtos: poliacrilamida, sílica gel e papel de filtro. 4.2.6 – Carvão ativado

E um pó bastante fino e de cor escura, sendo utilizado para eliminar substancias tóxicas produzidas pelo explante. Concentrações em torno de 0,3% são usadas quando se deseja enraizamento in vi- tro, pois auxiliam na ação das auxinas e promovem a fixação dos compostos fenólicos produzidos pelo explante. Sugere-se, em alguns casos, aumento da concentração de auxina, quando na pre- sença de carvão ativado. A pureza deste produto é variável.

4.3 PREPARAÇÃO DOS MEIOS O preparo de soluções estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e preci- são na dosagem dos componentes. Normalmente se mantém os macronutrientes em soluções estoque em concentrações 10 vezes su- perior ao da concentração final (Torres, 1998). Para os micronutrientes as soluções estoques são de 1000 vezes superior. Para o quelato EDTA Fé a solução estoque é de 50 vezes. As porções são mantidas em geladeira e por um período não superior a uma semana para a maioria das soluções estoques, principalmente aquelas que apresentam precipitação. Soluções estoques de vitaminas devem ser mantidas em geladeira ou em congeladores. Recomenda-se montar estoques de sais minerais (conjuntos de macrtonutrientes e micronutrientes), Fe EDTA, misturas orgânicas e reguladores de crescimento. A sacarose e o mio-inositol são pesados e preparados no momento do preparo do meio.

4.4. QUANTIDADE DE MEIO Como regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser utilizado. Devem ser considerados principalmente as exigências de luminosidade, temperatura, trocas gasosas e acúmu- lo de produtos tóxicos no meio, que serão discutidas na morfogênese.

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4.5. DESINFETANTES E ESTERILIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA Os desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas estão apresentados na tabela 2.

Tabela 2: Desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas. (Extraído do Catálo- go da Sigma).

Tabela 3: Período mínimo recomendado para esterilização de meio para cultura de tecidos de plantas.

(Extraído do Catálogo da Sigma).

5. PADRÕES MORFOGENÉTICOS IN VITRO

A possibilidade de manipula- ção da morfogênese relaciona-se com a exata compreensão dos con- ceitos enunciados anteriormente. Desta forma, tecidos, órgãos ou cé- lulas com intensidades variadas de determinação podem adquirir novas competências através da ação de determinados sinais quimicos (reguladores de crescimento) que ativam seletivamente determinados genes (epigênese). A resposta final é a expressão morfogenética em dois níveis básicos: organogênese e em- briogênese somática.

Uma representação esquemá- tica das rotas e sistemas de regene- ração in vitro é apresentada na figura 7.

DesinfestanteConcentração(%)Exposição (min.) Hipoclorito de Cálcio 9-10 5-30

Hipoclorito de Sódio 0,5-5,0 5-30

Água Oxigenada 3-12 5- 15

Álcool etílico 70-95 5- 15

Nitrato de prata 1 5-30

Cloreto de mercúrio 0,1-1,0 2-10

Volume por recipiente (ml)Tempo de autoclavagem (min.)

25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63 121°C e 1,05kg/cm/cm2 = 105kPa

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Figura 07 – Principais métodos de micropropagação e as rotas de crescimento vegetal dos explantes. (Adaptado de George, 1996)

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5.1. ORGANOGENESE A organogênese relaciona-se com a obtenção de eixos caulinares monopolares originados de ge- mas pré-existentes ou neoformadas. Estes eixos caulinares são induzidos ao enraizamento in vitro ou ex vitro resultando em plântulas completas que podem ser então aclimatizadas. A organogênese pode ser direta ou indireta. No primeiro caso, a partir de um explante primário há a formação de um eixo caulinar a partir de gemas apicais, laterais ou axilares. No segundo caso ocorre a desdiferenci- ação do explante, resultando na formação de calos, que podem ser definidos como a proliferação de células não diferenciadas massas, originado meristemóides (Thorpe, 1980). Para finalidades de mi- cropropagação clonal a formação de calos é indesejável uma vez que a constituição cromossômica deste material é, em geral, instável, podendo originar variantes genéticos, por meio de um processo chamado variação somaclonal (Larkin & Scowcroft, 1981). Neste caso, o período de crescimento desorganizado deve ser o menor possível, ou preferencialmente eliminado (Street, 1975; Murashige, 1977). A possibilidade de manipulação da organogênese depende do tipo e concentração relativa dos regu- ladores de crescimento, como indicado pelo já clássico trabalho de Skoog e Miller (1957). Estes au- tores observaram que a relação entre a auxina e a citocinina no meio de cultura era responsável pe- la resposta organogenética em tecidos medulares de tabaco. Desta forma meios de cultura conten- do concentrações mais elevadas de citocininas promoviam a formação de brotações aéreas ou ei- xos caulinares; meios de cultura contendo níveis mais elevados de auxinas induziam a formação de raízes e em concentrações equimolares destes reguladores de crescimento verificava-se a forma- ção de calos. A seleção de uma planta matriz e de um explante adequado é condição fundamental para orientar os padrão de morfogênese (Thorpe, 1980). Murashige (1974) discutiu os vários fatores que devem ser considerados nesta seleção, tais como o órgão da planta a ser utilizado como fonte de explante, a idade fisiológica, a época do ano em que é feita a coleta e as condições gerais da planta doadora.

5.1.1. SISTEMAS ORGANOGENÉTICOS O termo cultura de órgãos é usado para todos os tipos de cultura nos quais uma forma organizada de crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o isolamento asséptico de estruturas defini- das como primórdio foliar, flores imaturas e frutos, e seu crescimento in vitro. Para a micropropaga- ção os mais importantes tipos de culturas de órgãos são:

a) Cultura de meristema Consiste no estabelecimento do domo meristemático apical sem os primórdios foliares. A brotação apical tipicamente cresce, originando um único broto.

b) Cultura de ápices caulinares È o estabelecimento in vitro a partir de brotações apicais maiores do que aquelas utilizadas para ini- ciar a cultura de meristema, tendo alguns primórdios foliares. Essas brotações apicais podem produ- zir múltiplas brotações.

c) Cultura de segmentos nodais Os segmentos nodais são constituídos de gemas laterais isoladas, segmentos de caule com uma ou múltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma única brotação.

d) Cultura de embriões É iniciada a partir de embriões zigóticos extraídos de sementes. Os embriões germinam originando brotos. A cultura de meristema e a cultura de embriões são descritos com mais detalhes a seguir.

5.1.1. Cultura de meristemas apicais Esta técnica compreende o isolamento e a inoculação do domo apical e alguns primórdios foliares, ou do meristema (figura 5) isoladamente (0,10 a 0,20 mm de comprimento). Usualmente, a cultura de meristema refere-se ao crescimento do domo apical da brotação, excluindo as folhas primordiais. O meristema não apresenta folíolos, sendo constituído por duas regiões diferentes, túnica e corpus. A túnica é constituída de uma a três camadas de células, a mais interna forma a epiderme e as ou- tras duas restantes dão origem a folha ou somente a epiderme foliar.

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O corpus é a camada mais interna, responsável pela formação do restante da planta. O plano de divisão da túnica é anticlinal e do corpus é periclinal. O objetivo neste caso é a produção de uma microplanta enraizada que deve ser livre de virus, fungos e bactérias. Quanto menor for o explante mais efetiva será a eliminação de patógenos. Esta técnica tem obtido sucesso com mui- tas plantas herbáceas exploradas economicamente, como cravo, crisântemo, batatinha, batata-doce, mandi- oca, banana. No caso do morango a simples utilização de mudas obtidas por cultura de meristemas propiciou um aumento na produtividade de 3 para 12 t/ha em la- vouras do RS (Peters, 1986). Atualmente com a intro- dução de tecnologias adicionais na cadeia produtiva do morango, já são obtidas produtividades de até 80 t/ha, em cultivos no RS, SC e SP. Para plantas lenhosas a cultura de meristemas apresenta algumas dificuldades havendo a necessidade de utilização de técnicas auxili- ares como a microenxertia (Hartmann et al., 1990). A história da erradicação na cultura de tecidos de virus iniciou em 1934 quando White observou que sub- cultivos de segmentos de raízes de plantas infectadas por virus, levavam à sua eliminação. Observou-se pos- teriormente que a gema apical de crescimento também se encontrava livre de vírus. Morel e Martin Lo, na dé- cada de 40, cultivaram meristemas caulinares de plan- tas infectadas, obtendo sucesso. Hoje esta técnica é universalmente utilizada e apresenta grande impacto na produção agrícola vegetal. Em uma planta infectada, a concentração de virus não é uniforme e é maior em tecidos maduros e menor em tecidos meristemáticos. Na primavera quando o cresci- mento é intenso, os meristemas alongam-se rapida- mente e a concentração de virus é menor.

Estudos demonstram que plantas obtidas por cultura de tecidos estão livres de vírus. A hipótese mais a- ceita para a ausência de vírus nestes tecidos diz que a interrupção temporal da organização normal do tecidos meristemáticos, ocasiona uma inibição da multiplicação do vírus devido a não disponibilidade de enzimas chaves. Esta hipótese do efeito da desorganização celular foi reforçada pela presença de baixas concentrações de vírus em calos friáveis de tabaco, quando comparados com calos compactos e com maiores níveis de organização. Além disto, a ausência de tecido vascular na região do meristema apical, a presença de conexões plasmodesmáticas em dimensões diminutas nestas células e o ritmo ativo de divisões celulares nesta região, também são fatores que podem explicar a baixa concentração ou a au- sência de vírus nesta células. O processo ativo de divisão celular poderia utilizar a maior parte da energia para a formação de macromoléculas e componentes celulares estruturais, deixando os vírus em condi- ções pouco competitivas para a própria multiplicação. Comprovou-se também que a concentração de ví- rus aumenta na região sub-apical dos meristemas de plantas tratadas com substâncias inibidoras de crescimento, as quais reduzem as taxas de divisão celular.

Em resumo, a inexistência de vírus nos meristemas apicais pode ser atribuída aos seguintes aspectos:

a) O domo apical mantém certa distância das terminações vasculares e, nestas condições os virus neces- sitariam passar de célula a célula até o domo apical;

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Figura 09 - Secção longitudinal do meristema apical do caule de Coleus sp. Seta grossa = gema axilar; seta fina = protoderme; cabeça de seta = procâmbio; MF = meristema fundamental; PM = promeristema. Barra = 500 mm. (Apezzato, 2003).

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b) Quando as células meristemáticas do domo apical estão em divisão ativa, o RNA do virus não conse- gue introduzir-se no genoma destas células;

c) Células meristemáticas podem ter sistemas químicos de inativação, que podem ser potencializados em meristemas isolados;

d) Altas concentrações de auxinas presentes nos meristemas caulinares seriam responsáveis pela au- sência de virus.

A propagação massal das plantas isentas de viroses poderá ser feita através de outras técnicas como as que são descritas posteriormente.

5.5.1.1. Aplicações da cultura de meristema A cultura de meristemas é utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores na iniciação foliar e no es- tudo do florescimento, na propagação vegetativa para obtenção de plantas livres de patogénos e, na mul- tiplicação clonal rápida. Os meristemas são amplamente utilizados na limpeza pois estes materiais são livres de vírus. Isto é explicado pêlos seguintes fatos: a) Crescimento contínuo do tecido. A divisão celular é intensa, o que aumenta a competição por metabóli- tos e desta forma o vírus não tem energia suficiente para sua multiplicação. b) Ausência do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. É muito difícil a passagem do vírus célula a célula (o DNA do vírus é maior que o plasmodesmata). Vários fatores são determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre estes, pode-se destacar: • Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num maior sucesso na limpeza, mais a sobrevivência é menor; • Localização do explante: explantes retirados da ponta do broto estão em um estádio mais jovem de de- senvolvimento do que explantes da base; • Época de coleta: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo. 5.1.1.2. Proliferação de gemas axilares (segmentos nodais) Esta técnica é fundamentada pela indução das gemas laterais existentes. Inclui o isolamento e a inocula- ção de segmentos nodais contendo gemas vegetativas axilares, propiciando a multiplicação direta (ausência de calo) de brotações que podem ser separadas em microestacas para enraizamento in vitro ou in vivo. Este procedimento pode originar respostas de propagação massal em progressão geométrica. Por ser um sistema direto, apresenta menores possibilidades de gerar variantes somaclonais. Um dos exemplos de utilização desta técnica é a propagação clonal do abacaxi através da liberação das gemas axilares. Atualmente é um sistema utilizado em laboratórios junto a viveiros comerciais de espécies le- nhosas, pois é fácil de fácil manipulação e de alta taxa de regeneração de explante. Além disso, o materi- al vegetal mantém as características genéticas com quase ausência absoluta de variações epigenéticas. 5.1.2. INDUÇÃO E PROLIFERAÇÃO DE GEMAS ADVENTICIAS Consiste na indução e formação direta ou indireta de meristemóides a partir de discos foliares, ápices caulinares ou radiculares, segmentos caulinares nodais e internodais, cotilédones, hipocótilos e outras estruturas de plântulas, segmentos de flores e inflorescências imaturas (monocotiledôneas: Gladiolus, Hemerocallis, Iris, Freesia; Dicotiledôneas: Gerbera, Chrysanthemum), escamas de bulbos (tecidos me- ristemáticos na placa basal). Neste modelo, a escolha do explante e o tipo e concentração do regulador de crescimento determinam o sucesso da iniciação das brotações adventícias. No caso de iniciação dire- ta, algumas células parenquimáticas epidérmicas ou sub-epidérmicas tornam-se meristemáticas e grupos celulares (meristemóides) com forte reação a corantes específicos se desenvolvem. No modelo indireto ocorre a desdiferenciação das células parenquimáticas e a organização dos meristemóides e as brota- ções adventícias surgem a partir da periferia dos calos. Este modelo organogenético resulta nas maiores taxas de multiplicação, sendo de uso mais geral e co- mum em plantas hortícolas. Por outro lado ele pode originar a produção de variantes ou quimeras por es- tar baseado na formação de calos. Outro uso freqüente deste modelo é o co-cultivo com Agrobacterium em técnicas de transformação de plantas. 5.1.2. ESTÁGIOS E MODULAÇÃO DA ORGANOGÊNESE A microproagação de plantas através da cultura de tecidos pode ser operacionalizada em uma seqüência laboratorial de três estágios, cada qual apresentando objetivos, pressuposições e necessidades específi- cas em termos de composição dos meios de cultura, tipo e balanço dos reguladores de crescimento e condições físicas como luz, temperatura, foto período.

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Em condições laboratoriais cada estágio deve ser identificado e as condições ótimas devem ser estabele- cidas (Murashige 1974). Debergh e Read (1991) propuseram a inclusão do estágio 0 nesta seqüência de operações e, desta maneira, a indução e a expressão de respostas organogenéticas in vitro deve obede- cer aos passos listados a seguir: Estágio 0 - Consiste em selecionar e cultivar a planta matriz doadora de explantes em condições ade- quadas e, eventualmente, controladas. Isto significa que pode ser necessário modificar as condições de fotoperíodo e temperatura, ou aplicar a essa planta fitorreguladores do grupo das giberelinas e auxinas, alterando com isto a sua condição fisiológica. Estágio I - Consiste no estabelecimento da cultura asséptica. O objetivo deste estágio é a definição do tipo de explantes a ser utilizado, o estabelecimento de culturas isentas de microorganismos contaminan- tes, a obtenção de altos índices de sobrevivência e de rápido crescimento dos explantes. Neste estágio torna-se necessário monitorar e controlar as reações de oxidação que ocorrem: a) pela oxidação de com- postos fenólicos presentes no explante, como resposta ao ferimento provocado pela excisão de um órgão ou tecido e; b) pela síntese de compostos mono e poliméricos por parte do explante. A incubação destas culturas na ausência da luz por alguns dias pode inibir os processos oxidativos. Estágio II - Multiplicação: este estágio é fundamentado na divisão e diferenciação celular, objetivando a obtenção de uma plântula, de acordo com as diferentes rotas morfogenéticas possíveis. De maneira geral procura-se promover a liberação de gemas axilares pré-formadas ou a indução de gemas adventícias. Em muitos casos estágios intermediários de calo estão envolvidos, contudo, quando o objetivo é a manu- tenção da conformidade clonal, a passagem por estágios de calo deve ser evitada, tendo em vista a pos- sibilidade de ocorrência de variações somaclonais. Neste estágio deve-se determinar o número e interva- lo de sub-cultivos, bem como determinar e otimizar a taxa de multiplicação, ou seja, o número de gemas ou de eixos caulinares que podem ser obtidos a partir de cada inóculo nos sub-cultivos. Para bananeira e abacaxizeiro, partindo-se de gemas apicais e laterais respectivamente, a taxa média de multiplicação é de 10 eixos caulinares a cada sub-cultivo realizado a cada 20 dias. A experiência adquirida com esses dois sistemas indica que podem ser efetuados cinco sub-cultivos com certa garantia de manutenção de fidelidade clonal. A partir deste sub-cultivo podem aparecer mutantes ou variantes somaclonais. No Labo- ratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal do Depto. de Fitotecnia do CCA/UFSC, não foram observadas alterações morfológicas na organogênese do abacaxizeiro até o quinto sub-cultivo, a partir do qual se identificaram mutantes, na freqüência de 1 para 700. As condições ambientais neste estágio relacionam-se com a temperatura, cuja faixa ótima está entre 22 e 27oC para plantas de clima temperado e tropical, respectivamente. O período de luz deve permanecer em torno de 16 a 18 horas em intensidades luminosas médias de 5 W.m-2. Estágio III - Nesta fase busca-se o elongamento, a indução e iniciação radicular e a preparação para a aclimatização. O objetivo deste estágio é a preparação para a conversão das condições heterotróficas para autotróficas. As estratégias deste estágio incluem eventuais inclusões no meio de cultura de: a) GA3 para induzir o elongamento de eixos caulinares; b) AIB para induzir a iniciação radicular e; c) carvão ati- vado para favorecer a iniciação radicular. Reduções nas concentrações dos sais e das fontes de carboi- dratos do meio de cultura podem trazer benefícios à iniciação radicular, bem como facilitar o processo de aclimatização. Tendo em vista que este estágio da cultura in vitro pode representar 30 a 60% do custo de uma planta micropropagada, muitos laboratórios preferem promover o enraizamento ex-vitro e esta estratégia deve ser considerada sempre que possível. O emprego da técnica da dupla-camada que consiste em adicionar uma pequena quantidade de AIB sobre a superfície do meio sólido, para que ocorra a indução radicular dos eixos caulinares tem gerado execelentes resultados em muitos sistemas. Estágio IV - Aclimatizacão: Neste estágio ocorre a transição da condição heterotrófica para autotrófica. O principal objetivo neste estágio é diminuir ao máximo as perdas que ocorrem principalmente pela desidra- tação dos tecidos da microplanta. O emprego de estufas, túneis plásticos, sistemas de nebulização e de antitranspirantes deve ser considerado para cada situação, tendo em vista que as plantas neste estágio normalmente não apresentam estômatos funcionais e suas folhas tem reduzida capacidade de formação cutículas cerosas protetoras. Composições adequadas de substratos também são importantes e na maior parte dos casos o emprego de areia, terra, vermiculita, casca de arroz carbonizada isoladamente ou em misturas proporcionais, re- sulta em elevados índices de sobrevivência.

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De maneira geral este estágio inicia com a retirada das plântulas dos frascos e a cuidadosa remoção por lavagem de resíduos de meio de cultura solidificado junto ao sistema radicular. Um segundo passo con- siste em repicar estas plântulas para bandejas de isopor contendo o substrato autoclavado, cuja composi- ção foi previamente determinada. O terceiro passo consiste em manter estas bandejas, por períodos de até 15 dias, em sala de cultura cuja temperatura e duração e intensidade luminosa possam ser controla- das. A manutenção de uma câmara úmida sobre as bandejas pode ser feita pela utilização de filmes plás- ticos em cobertura. Posteriormente, transfere-se esta bandeja para uma estufa com sistema de nebuliza- ção intermitente por períodos médios de 15 a 30 dias, podendo-se após, repicar estas plântulas para sa- cos plásticos contendo uma mistura convencional não autoclavada de solo argiloso, arenoso e matéria orgânica e mantê-las em condição de ripado ou cobertura com sombrite que deixem passar em torno de 50% da luminosidade. Por fim procede-se uma retirada gradual da cobertura para que as mudas sejam submetidas às condições normais que se verificam após o transplante para o local definitivo. É importante salientar que determinada seqüências destas operações podem ser eliminadas em algumas espécies. Para abacaxizeiro, por exemplo, o segundo passo anteriormente descrito pode ser eliminado e não há a necessidade de ser feita a repicagem para sacos plásticos, podendo as mudas ser comercializadas ou enviadas ao campo nas bandejas de isopor. Torna-se necessário, portanto, estabelecer procedimentos específicos para cada espécie a ser trabalhada em um laboratório de micropropagação. 5.1.3. CULTURA DE EMBRIÕES A cultura de embriões pode ser definida como o isolamento estéril e crescimento de um embrião imaturo ou maturo in vitro, com o objetivo de se obter uma planta viável. Embriões zigóticos ou de sementes são frequentemente usados vantajosamente como explantes em cul- tura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Em cultura de embriões, entretanto, os embri- ões são retirados das sementes e são individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendo uma planta por explante. A cultura de embriões isolados pode ajudar na produção rápida de plântulas de sementes que apresentam dormência embrionária ou embrião imaturo. 5.1.3.1.Tipos de cultura de embriões:a) Cultura de embrião imaturo Originado de sementes imaturas, é usado para evitar o abortamento natural. É mais difícil, devido a exci- são e meio de cultura mais complexo. b) Cultura de embriões maduros Originado de sementes maturas, é usado para evitar a inibição de germinação de semente. 5.1.3.2. Estádios de desenvolvimento do embrião Quanto mais imaturo for o embrião maior será o requerimento nutricional. No estádio globular há requeri- mento de meios mais complexo (fitormônios, altas concentrações de açúcares, água de coco, etc.). Antes do formato de coração, os embriões são bastante heterogêneos, não sintetizando fitormônio ou mobili- zando compostos de carbono. No estádios heterotróficos, os embriões requerem sais, açúcares, vitaminas, nitrogênio, citocininas, auxi- nas, água de coco (algumas substâncias podem ser opcionais). Quando aumentam de tamanho, tornam- se autotróficos e neste estádio requerem um meio mais simples. Os embriões geralmente requerem alta taxa de açúcar (fonte de carbono e agente osmótico), pois têm um potencial hídrico muito negativo (conteúdo alto de sólidos). Uma alternativa para resolver a dificuldade imposta pelo potencial hídrico do embrião é fixar a sacarose e elevar o teor de manitol (agente osmótico). 5.1.3.3 Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrião1) Genótipo: em algumas espécies o embrião cresce facilmente enquanto que em outras é muito difícil (há também diferenças entre cultivares de uma espécie). 2) Estádio de desenvolvimento do embrião no isolamento: é muito difícil desenvolver embrião muito pequeno in vitro. 3) Condição de crescimento da planta-mãe. crescer a planta-mãe em condições controladas resulta em um melhor desenvolvimento do endosperma, portanto melhora o crescimento do embrião isolado. 4) Composição do meio: embriões imaturos requerem uma composição mais crítica do que embriões maturos. Em ambos (maduro e imaturo) os macro e microelementos são importantes.

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Os meios usados são sólidos: MS, White e 85, em uma faixa de pH entre 5 a 6. Carboidratos (sacarose, usada na concentração de 2-3% e 8-12% para embriões maturos e imaturos, respectivamen- te) são fontes de energia e também agem abaixando o potencial osmótico, especialmente em embrião jovens. O ágar é usado em concentrações entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam em inibição de crescimen- to). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininas geralmente não são usados. As vezes se utiliza giberelina. Substâncias de contribuição complexa como a água de coco são bastante utilizadas, especial- mente para embriões imaturos. 5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantém-se o embrião isolado no escuro por 7 a 14 dias. 6) Temperatura: a temperatura ótima é dependente da espécie, variando, geralmente entre 22 e 28°C). 5.1.3.4. Aplicações práticas da cultura de embriões a) Eliminação da inibição (dormência) da germinação de semente Em algumas espécies é absolutamente impossível obter a germinação in vivo devido a características genéticas ou fisiológicas. b) Recuperação de híbridos de cruzamentos incompatíveis No melhoramento, cruzamentos interespecíficos e intergenéricos para transferir genes de interesse da espécie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidade genética) podem produzir embriões abortivos devido a incompatibilidade. Isto ocorre também em cruzamentos onde existam barreiras pré ou pós-zigóticas (sementes murchas e embriões abortivos). Os embriões híbridos são salvos e removidos antes que ocorra o aborto e, posterior- mente cultivados in vitro. c) Superação da dormência das sementes Em algumas sementes ocorrem inibidores químicos endógenos ou há requerimentos específicos de luz e temperatura ou ainda a resistência física presente nas estruturas que recobrem o embrião. A cultura de embriões é uma alternativa para superar estes problemas. d) Superação da esterilidade das sementes. As causas de ocorrência de sementes estéreis em algumas espécies podem ser o desenvolvimento in- completo do embrião, mutações das estruturas que cobrem o embrião ou algum tipo de dormência recal- citrante para a qual nenhum método tem sido desenvolvido. e) Germinação de sementes de parasitas obrigatórios. Sem o hospedeiro, é impossível a ocorrência in vivo. Assim também a retirada dos embriões e cultivo in vitro pode suprir esta necessidade, permitindo o desenvolvimento de plantas. f) Prevenção do embrião abortivo que ocorre com o amadurecimento precoce de frutos carnosos Em cruzamento dos frutos (pêssego, ameixa, cereja) o transporte de água e nutrientes para o embrião imaturo é algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o aborto. g) Propagação vegetativa Devido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embriões são excelentes explantes para propagação clonal in vitro. Especialmente para coníferas e gramíneas. 5.1.4. MICROENXERTIA Esta técnica (figura 10) consiste em excisar de uma planta matriz uma gema apical ou o meristema pro- priamente dito que é enxertado sobre uma plântula porta-enxerto que foi obtida em condições assépticas. Sua principal aplicação é a eliminação de viroses e de outros microorganismos de natureza sistêmica que tendem a se acumular em plantas propagadas vegetativamente, quando da impossibilidade de se usar a técnica de cultura de meristemas Na citricultura esta técnica tem sido empregada rotineiramente nos laboratórios de micropropagação por- que no sistema tradicional baseado na propagação de clones nucelares de espécies poliembriônicas, o tempo necessário para a superação da juvenilidade é muito longo. Além disto, em espécies monoembriô- nicas ocorre variabilidade genética uma vez que o embrião pode ser resultante de um processo de fecun- dação cruzada. A termoterapia também pode ser empregada para a limpeza de virus em plantas de propagação vegetati- va, contudo nem todas as plantas apresentam-se isentas dos vírus após serem submetidas a este pro- cesso.

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5.2. EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA Uma das mais claras demonstrações da totipotencialidade em células de plantas superiores é a obtenção de estruturas embrionárias bipolares em sistemas in vitro. De maneira geral este modelo morfogenético inicia com a seleção e ativação de células embriogenéticas competentes (modelo direto) ou com a indu- ção destas células (modelo indireto) e progride através de seqüências idênticas aquelas observadas para a embriogênese zigótica. Na definição de Haccius (1978) embriogênese somática ou adventícia é o pro- cesso pelo qual novos indivíduos se originam a partir de células simples, que não são produto da fusão de gametas e que não apresentam conexões vasculares com os tecidos maternos. A iniciação e o desenvolvimento de embriões somáticos em sistemas in vitro foi obtida quase simultanea- mente por Steward et al. (1958) e por Reinert (1959) em Daucus carota. No final dos anos 70, a ocorrên- cia deste padrão morfogenético já era relatada para 32 famílias, 81 gêneros e 132 espécies vegetais. Existem claras evidências de que a ocorrência da ES in vitro é favorecida por uma adequada manipula- ção de uma auxina forte no meio de cultura. O 2,4-D parece ser esta auxina na maior parte dos sistemas experimentais. Segundo Vasil (1982), a competência embriogenética é aparentemente adquirida durante o período inicial em cultura na presença de altos níveis desta auxina. Contudo a expressão da embriogê- nese somática somente ocorre na presença de baixos níveis deste regulador de crescimento. 5.2.1. EMBRIOGENESE SOMÁTICA ADVENTICIA Ocorre a partir de células ou calos originados em aparatos reprodutivos. As células que iniciam o proces- so (células-mães) são proembriogeneticamente determinadas (PEDC). Exemplos ilustrativos deste siste- ma incluem a regeneração a partir do tecido nucelar em citros (Button & Kochba, 1977), de óvulos imatu- ros de mamão (Litz, 1987) e de videira (Mullins, 1987). Embriões adventícios podem ter origem direta a partir de células simples localizadas na epiderme dos embriões zigóticos, via alteração nos planos de di- visão, como é o caso do palmiteiro (Guerra e Handro, 1988), ou indireta a partir de calos de embriões zi- góticos de cacau (Pence et al., 1979). 5.2.2. POLIEMBRIOGÊNESE SOMÁTICA É uma forma de multiplicação que captura o processo natural de reconstituição do embrião zigótico. Inicia com o transplante para culturas in vitro de massas suspensor-embrionárias, que são massas celulares derivadas dos primeiros estágios da embriogênese zigótica. A correta manipulação deste sistema permite a clonação em larga escala destas células em um ciclo repetitivo. A alteração das condições de cultura permite a progressão destes pró-embriões para estágios subseqüentes (ciclo de maturação) e a obtenção de um grande número de embriões somáticos que podem ser encapsulados em cápsulas de hidrogel pa- ra armazenamento ou semeadura (sementes artificiais ou sintéticas). Este processo é distinto daquele verificado para a embriogênese somática adventícia porque os estágios de desenvolvimento ocorrem sem a necessidade de se excisar um tecido, induzir a desdiferenciação e a posterior rediferenciação celu- lar, o que implica dizer que na poliembriogênese somática não há formação de calos.

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Figura 10 – Microenxertia da cultivar de maçã Gala sobre porta enxerto Marubakaido. LFDGV. Fitotecnia. UFSC/CCA, 2002.

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Além disto, algumas das células transplantadas podem dividir-se sem a necessidade da adição de regula- dores de crescimento ao meio de cultura. Este fenômeno é atribuído a superioridade genética e aos altos níveis endógenos de fitorreguladores nestas células. A poliembriogênese somática é de ocorrência ampla nas gimnospermas, mas pode ocorrer também em angiospermas. Revisões completas sobre o assunto são encontradas nos artigos de Gupta e Durzan (1986) e Durzan e Gupta (1988) e no livro "Plant Morphogenesis" de Sinnot (1960). 5.2.3. EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA INDUZIDA Este modelo resulta de calos e suspensões celulares depois que o tecido matriz (explante) é submetido a tratamentos que induzem competência embriogenética (detalhes na figura 12). Isto significa que é neces- sário que ocorra a desdiferenciação e posterior rediferenciação celular através de uma reprogramação genética (epigênese) cujos determinantes básicos são o estágio fisiológico do explante e o tipo e concen- tração do regulador de crescimento que atuará como sinal químico para a ativação gênica diferencial. De maneira geral, a perspectiva de sucesso em extrair resposta embriogenética neste modelo depende da utilização de explantes juvenis ou embrionários e da manipulação adequada de uma auxina forte, como o 2,4-D. Esta auxina atua como indutora do processo (efeito "pulse"), contudo sua presença no meio de cultura depois da indução pode causar anormalidades ontogenéticas. Portanto, neste modelo em particu- lar e na embriogênese somática em geral, a ativação ou indução é desencadeada pelo uma auxina forte como o 2,4-D mas a expressão desta rota morfogenética somente ocorrerá em meios de cultura isentos ou com baixas concentrações deste regulador de crescimento. Exemplos ilustrativos deste modelo foram obtidos e/ou citados para o cafeeiro por Sondahl et al. (1981), para palmeiras por Tisserat et al. (1979), para gramíneas por Vasil (1982), para soja por Christianson (1985) e para cenoura por Litz et al. (1985), cujos artigos ampliam e aprofundam detalhes sobre este mo- delo.

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Figura 12 - Ciclos da embriogênese somática e a seqüência de eventos celulares da desdifenciação e diferenciação (Adaptado de Durzan, 1988)

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5.2.4. SUSPENSÕES CELULARES Suspensões celulares consistem de células e agregados celulares dispersos em meios líquidos em agita- ção. O crescimento celular baseia-se nas mudanças das taxas de divisão em fases definidas. No início as células dividem-se lentamente (lag fase), posteriormente ocorrem fases de rápido crescimento (exponencial e linear) e por fim, as células tendem a taxas menores de divisão por efeito de competição (fase estacionária). Neste momento, através da subcultura de uma amostra destas células, é possível rei- niciar a cultura e este procedimento pode ser mantido indefinidamente (Street, 1977). Suspensões celulares podem ser iniciadas pela inoculação de calos friáveis ou outros tecidos que pos- sam originar linhagens celulares organogenéticas ou embriogenéticas. Uma suspensão celular de primei- ra passagem contem uma mistura de células vivas, mortas e resíduos. Filtragem seletiva, uso de pipetas ou seringas auxiliam na obtenção de culturas puras e homogêneas. A possibilidade da manipulação e do cultivo de células em escala comercial pode exigir o uso de biorrea- tores. Estes equipamentos foram desenvolvidos originalmente para o cultivo de microorganismos e outras células vivas para propósitos de fermentação e/ou para a produção de produtos secundários para uso industrial. Para suspensões celulares vegetais, os meios de cultura são praticamente idênticos aqueles exigidos para a obtenção de calos e incluem os macro e micronutrientes, sacarose, vitaminas e um ade- quado balanço de reguladores de crescimento. De maneira geral a maior utilidade dos biorreatores relaciona-se com a obtenção de um grande número de células ("scale-up") em ciclos repetitivos de divisão celular e para a obtenção de metabólitos secundá- rios. Para efeitos de micropropagação, as células obtidas são plaqueadas e manipuladas para a ativação de processos regenerativos nas rotas de organogênese ou embriogênese somática. A indução/ativação de linhagens celulares embriogenéticas através de suspensões em meios líquidos pode propiciar a obten- ção de uma relação direta (1 célula pró-embrionária/ 1 plântula) e parece ser o melhor sistema pelo qual tecnologias de encapsulamento em hidrogel possam gerar sementes sintéticas. Além disto, o estabeleci- mento de linhagens celulares embriogenéticas é a maneira mais elegante de se manipular e modular a embriogênese somática para a propagação massal de genétipos superiores. Suspensões celulares são também as melhores fontes para a obtenção de protoplastos para propósitos de fusão, transformação e introdução de organelas. 5.2.4.1. Aplicações da suspensão celular: É usada para obtenção de sementes sintéticas (embriogênese somática isolamento de protoplastos, iso- lamento de mutantes, obtenção de resistentes certos elementos (Alumínio, toxinas, herbicidas, sal), pro- dução de metabólito secundários e nos processos de transformação de plantas. 5.2.4.2. Métodos mais utilizados para medir o crescimento celular: Para quantificar o crescimento de células em suspensão, são utilizado: principalmente os métodos baseados no número de células, peso de matéria seca peso de matéria fres- ca, volume de células e proteína total da célula. Um calos típico iniciado de um explante passa por três estágios de desenvolvimento, que compreende a indução da divisão celular, um período de divisão celular ativa durante o qual as células diferenciadas perdem a; características especializadas para tornarem-se desdiferenciada e um período no qual a divi- são celular é reduzida ou mesmo cessa, iniciando então a especialização celular. Esses estádios podem ser acompanhados numa curva de crescimento caracterizadas por seis fases (figura 13). • Fase lag: é caracterizada por não ter ganho em número de células, pelo inicio da mobilização de meta- bólitos sem ocorrer qualquer divisão celular, pela síntese de proteínas e síntese de metabólitos específi- cos. A atenção deve ser dada à densidade do inócuo que afeta o comprimento da fase lag. Quanto menor o peso do calos utilizado, maior é a fase lag. • Fase exponencial: é caracterizada por divisão celular intensa, aumento no número de células, porém células de tamanho pequeno com formação de agregados de células. • Fase linear, a fase exponecial é seguida pela fase linear. O crescimento celular é ativo e as células ad- quirem competência para proceder a repicagem. • Fase de desaceleraçâo: ocorre uma redução na divisão celular. É no final dessa fase que se deve inici- ar o processo de repicagem. • Fase estacionária: a repicagem deve ser terminada ainda no inicio dessa fase quando não há divisão celular. As culturas não podem ser mantidas nessa fase por um período longo. • Fase de declínio: as células começam a morrer, culminando com a lise celular.

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