Cultura de tecidos - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Cultura de tecidos - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

PDF (431.6 KB)
20 páginas
799Número de visitas
Descrição
Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da Cultura de tecidos, Importância da dinâmica de crescimento, Sistemas de biorreatores, Inoculação dos explantes.
20pontos
Pontos de download necessários para baixar
este documento
baixar o documento
Pré-visualização3 páginas / 20
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Pré-visualização finalizada
Consulte e baixe o documento completo
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Pré-visualização finalizada
Consulte e baixe o documento completo
Apostila Biotecnologia

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

5.2.4.3. Importância da dinâmica de crescimento A curva de crescimento de calos é calculada com o objetivo de se obter a época de repicagem (subcultura), para determinar onde há a maior produção de metabólitos (quando o estudo objetiva o me- tabolismo secundário). Esta fase é de desaceleração, pois os metabólitos secundários não constituem prioridade no metabolismo celular.

5.2.5 .BIORREATORES Os biorreatores são equipamentos usados para micropropagação clonal e massal de plantas, cujo objeti- vo é a imersão temporária ou permanente de cultura de células ou tecidos vegetais ao meio de cultivo líquido. Tem propósito fundamental de facilitar o trabalho rotineiro e melhorar as condições ambientais e asépticas para as culturas, produzindo em larga escala.. Historicamente, os biorreatores foram mais conhecidos por fermentadores e estavam direcionado para o cultivo de células ou microrganismos, com vistas a produzir metabólicos secundários, alcalóides, antibióti- cos, entre outros (Barruetto, 2002). O nome fermentador está relacionado etimologicamente com fermen- tação que, na sua raiz latina, deriva de fermentare, cujo significado é ferver, isto é, produzir bolhas de ar, numa alusão ao fato de os fermentadores serem destinados a processos fermentativos como, por exem- plo, a produção de álcool, onde as leveduras regeneram NAD a partir de sua forma reduzida NADH, com produção de etanol e C02, na qual este último, pela aparição de bolhas, dá a idéia de fazer ferver o meio líquido nutritivo (Leveau & Bouix,1985). Inicialmente, e pelo fato de serem destinados a usos industriais, esses fermentadores foram de grande capacidade: de 20 a 4.000 mil litros de meio líquido nutritivo. Em decorrência disso, esses fermentadores devem ter acurados sistemas de oxigenação, agitação mecânica do meio líquido, monitoramento do pH, da temperatura e da formação de espuma, tudo o que os converte em verdadeiras obras da engenharia e da automatização, que asseguram à parte biótica (microrganismos) sobreviverem nesse ambiente abióti- co artificial, visando aumentar seus rendimentos (biomassa, metabólicos secundários, antibióticos, etc.), porém com altos custos de instalação. Paralelamente à biotecnologia da fermentação, a cultura de tecidos vegetais vinha desenvolvendo seu trabalho biotecnológico de manipulação de células, tecido e órgãos com vistas a propagar material clonal para uso comercial. Os primeiros biorreatores adaptados para plantas datam de, aproximadamente, 26 anos atrás (Levin et al., 1988) De lá para cá, muitos tipos têm sido propostos, isso porque um biorreator é concebido em fun- ção do tipo de processo que se deseja obter. Assim, para embriogênese somática, se requer um tipo de biorreator, mas, para micropropagar através de organogenêse, gemas, o desenho mais eficiente pode ser outro (Merchuk, 1990).

Página 22

Figura 13 - Dinâmica de crescimento de uma suspensão celular.(Adaptado de Geor- ge, 1993).

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

5.2.5.1. Sistemas de biorreatores Biorreatores de imersão temporária; Consiste geralmente de um conjunto de dois recipientes com capaci- dade de 1 a 5 litros. Um que contém o meio de cultivo líquido (menos de 20% da capacidade do frasco), outro que comporta os explantes. Em tempo pré-determinado ocorre a transferência do meio de cultivo para o frasco que contém os explantes por um breve período (de 1 a 3 minutos). Depois o meio é sugado para o depósito em mesmo nível ou escoado em depósito com nível inferior. Este ciclo é repetido a cada hora, ou então, conforme as exigências do explante. Sua utilização efetiva tem sido para sistemas morfo- gênicos, já que uma das dificuldades é a fixação de pequenos explantes (figura 14).

Biorreatores de imerssão permanente; Em geral são os biorreatores utilizados para a micropropagação massal de plantas, mais especificamente para a cultura de células isoladas, calos ou de protoplastos. Tem pequena capacidade (1 a 5 litros), e, no caso de serem desenhados para multiplicação de células ou embriões somáticos.

Devem possuir um sistema de oxigenação, um outro de agitação mecânica, por meio de pás giratórias ou um sistema vibratório para produzir a turbulência necessária à homogenização e homeostase no interior do biorreator, e ainda, sensores de pH, temperatura, 02 e espuma (Preil et al. 1988; Takayama & Akita, 1994). Também outra opção são balões volumétricos com depressões laterais, os quais são rotacionados em sentido orbital (figura 14).

Biorreatores de tipo air-lift; No tocante à propagação de plantas através de gemas, existem os biorrea- tores de imersão temporária (Alvard et al.,1993) e os de borbulhamento contínuo ou imersão permanente (BIPER) tipo air-lift (George, 1993-96) Nos de imersão temporária, as gemas a serem multiplicadas ficam expostas a ciclos de imersão, evitando a presença de dispositivos de agitação e arejamento e, portanto, simplificando o desenho do biorreator. Este biorreator, basicamente é um sistema de engenharia simples e barata. Consta de um recipiente de vidro com capacidade de 500 a 1000 ml, cuja tampa apresenta dois furos, um para a entrada do ar e outro para saída, sendo que, em ambos os casos, esses orifícios estão providos de dutos de aço inox com filtro Millipore (0,2 m de poro) a fim de evitar a contaminação interna.

O ar é provido através de um microcompressor (aproximadamente 3 litros/ minuto), e conduzido ao fundo do recipiente através de uma mangueira de silicone, de onde sai, através de um tubo poroso, formando bolhas que agitarão o meio líquido. Com exceção da borracha que liga o filtro de entrada ao compressor, todos os componentes do sistema são autoclaváveis (120ºC e 20 minutos) (figura 14).

Página 23

Figura 14 – Tipos de biorrteatores e sistemas de funcionamento

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

Página 24

Figura 15 - Culturas de bromélia cultivada em processos de biorreatores de imersão temporária e a seqüência de formação, determinação e regeneração dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

5.2.5.2. Inoculação dos explantes É feita a autoclavagem, o frasco, contendo o meio nutritivo. Depois em câmara de fluxo laminar é aberto para a inoculação de brotos, suspensões celulares ou calos. O meio líquido normalmente é constituído do meio SP (Barrueto Cid et al., 1999) complementado com diferentes concentrações de BAP (6- benzilamino purina) segundo se trate de orquídeas (Ionopsis ochlereuca), abacaxi (Ananas comosus L. cv. Perola) café (Coffea arabica), mamão (Carica papaya L. cv Tainug), álamo (Populus tremula x P. al- ba). As touceiras contendo um número variado de brotos são previamente obtidas em meio sólido e é u- ma precondição ter seu protocolo de multiplicação estabelecido, antes de iniciar os trabalhos com o bior- reator. Os explantes em geral podem ser de origem do próprio sistema dos biorreatores, dando a possibi- lidade de processar cultivos seqüências de explantes em escalas comercias, as biofábricas. 5.2.6. PROTOPLASTOS Protoplastos são a parte viva das células vegetais. Contém o núcleo, citoplasma, vacúolo e outros com- ponentes celulares circundados por uma membrana semi-permeável. A célula vegetal, em contraste com a célula animal, é circundada por uma parede celular constituída de celulose, hemicelulose e materiais pécticos. Protoplastos podem ser obtidos a partir de células em suspensão ou diretamente a partir de cé- lulas do mesófilo foliar. A obtenção de protoplastos foi possível a partir da descoberta de que a parede celular das células vege- tais poderia ser removida por enzimas que a digerem (Cocking, 1960). Preparações enzimáticas comerci- ais são baseadas em misturas de celulase e pectinase. A manutenção de uma pressão osmótica adeuqa- da é necessária para prevenir a ruptura da membrana celular e para contrabalançar a remoção da parede celular. A utilização de alguns corantes tais como carmin acético, azul de Evans e compostos de reação de fluorescência pode indicar a viabilidade ou não dos protoplastos obtidos. As aplicações das técnicas de isolamento e regeneração de protoplastos podem ser vistas sob dois ângu- los. Do ponto de vista do conhecimento básico é possível o estudo dos aspectos relacionados com a for- mação da parede celular e com a ontogênese de processos regenerativos a partir de células simples. Do ponto de vista aplicado torna-se possível a utilização de técnicas de transformação como a fusão de pro- toplastos de espécies não aparentadas, rompendo com isto os limites impostos pela propagação sexual. A fusão de protoplastos de genótipos distintos gerando a combinação de dois núcleos e citoplasmas é chamado de hibridização somática ou parasexual. Além disto, protoplastos são considerados como o ma- terial ideal para a utilização de técnicas de transformação direta através de metodologias envolvendo DNA recombinante. 5.2.7. CULTURA DE POLÉN E ANTERAS A cultura de anteras é uma técnica para a obtenção de plantas haplóides a partir de plantas normalmente diplóides. A descoberta que o grão de pólen poderia desenvolver embriões foi feita por acaso na década de 60. Atualmente, muitas plantas são produzidas a partir do grão de pólen imaturo ou calo que desenvol- ve a partir do micrósporo. A cultura de anteras tem grande potencial para o melhoramento de plantas e é usada para a obtenção de plantas haplóides. A palavra haplóide refere-se a plantas que possuem o número gametofítico de cromos- somos em seus esporófitos, ou seja, são originárias de um esporófito e contém metade do número de cromossomos da espécie. Plantas haplóides podem ser obtidas in vivo através de polinização com pólen irradiado, polinização com pólen abortivo (estéril), tratamento do pólen com choques térmicos, hibridação distante. In vitro pode ser obtido pelo desenvolvimento da oosfera não fertilizada, pela cultura de anteras e ou grãos de pólen (diretamente por embriogênese e indiretamente via formação de calos). As fontes de explantes usadas são anteras imaturas, que fornecem pólen uninucleado (por ocasião da primeira mitose) se constituindo no material mais promissor para indução de androgênese e botões florais fechados. 5.2.7.1. Obtenção de haplóides por cultura de anteras O protocolo para cultura de anteras pode ser descrito resumidamente: a) os botões florais fechados são desinfestados; b) faz-se uma incisão de um dos lados do botão floral e estames são delicadamente removidos. O fila- mento do estame é removido (com bastante cuidado para não danificar as anteras) e c) as anteras são inoculadas em meio de cultura.

Página 25

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

5.2.7.2. Fatores que influenciam a androgênese1) Genótipo da planta doadora: tem sido observado que gêneros, espécies e cultivares apresentam di- ferentes respostas na cultura de anteras. 2) Condições fisiológicas e idade da planta: flores das plantas relativamente novas, no início da flora- ção são mais adequadas do que botões florais de plantas velhas e em final de seu período de crescimen- to. 3) Estádio de desenvolvimento do pólen: o micrósporo no estágio uninucleado é o mais adequado (antes ou logo após a primeira antese). Existe correlação entre o tamanho do botão floral e o estádio do desenvolvimento do pólen (importante ao se considerar a ploidia do embrião produzido). O estágio do de- senvolvimento do pólen na antera pode ser determinado pelo corante acetocarmicima ou reagente de S- chiff. 4) Pré-tratamento dos botões ou anteras:a) Tratamento térmico: deve ser feito em baixa temperatura (3 a 5° C). Assim se retém a viabilidade do pólen por mais tempo, retardando a senecência, sincronizando as células e prevendo o aborto do pólen. b) Tratamento químico: aplicações de químicos como o etrel (paclobutrazol), hidrazida maleica, carvão ativado, podem induzir as anteras a formar em embriões. c) Tratamento físico: radiações ionizantes, pressões atmosféricas reduzidas (uso de dissecador); centri- fugação. 5) Composição do meio de cultura: os meios mais utilizados são o MS, White, Nitsch. A sacarose é a fonte de carbono mais efetiva de carboidratos e sua concentração varia com as espécies. A necessidade de reguladores de crescimento, também é variável. Suplementos orgânicos como caseína hidrolizada, água de coco, extraio de leveduras, aminoácidos, ácido ascórbico tem sido utilizados com sucesso. 5.2.7.3. Identificação de haplóides A identificação de hapólides pode ser feita com genes marcadores, que produzem cor, cuja manifestação possa ser mostrada na semente ou plântulas. Marcadores morfológicos e por contagem de cromosso- mos, através de técnicas citológicas. 5.2.7.4. Problemas Alguns problemas relacionados à cultura de anteras podem ocorrer quando são usadas técnicas inade- quadas para se produzir plantas dipóides a partir de haplóides regenerados de cultura de anteras; uso de técnicas inadequadas de regeneração; ocorrência de elevada taxa de mutação (anormalidades); desdife- renciação de calo a partir de células dos tecidos somáticos da antera e; alta incidência de plantas albinas (principalmente em gramíneas) 5.2.7.5. Utilização de plantas hapólides A técnica da androgênese permite: a) Obtenção de homozigose. Em programas de melhoramento, onde é necessário a obtenção de linha- gens, a homozigose destas pelos processos tradicionais só ocorre após 6 a 8 gerações de autofecunda- ção ou retrocruzamento. Através da cultura de anteras, plantas haplóides são obtidas imediatamente, pois uma vez duplicado seu número de cromossomo, originam plantas diplóides que apresentam homozi- gose em 100% dos loci, reduzindo o tempo. b) Produção de supermachos. Tomando-se com exemplo o aspargo, que é dióica, as plantas masculi- nas são mais produtivas. Há interesse na determinação de um método que produza por sementes todas as plantas híbridas F, heteróticas masculinas. A partir de plantas femininas (XX - homogaméticas) e plan- tas masculinas (XY -heterogaméticas), por cultura de anteras, pode-se obter plantas haplóides tanto X como Y, pela duplicação: XX (plantas femininas) e YY (supermachos). Usando estes supermachos na produção de híbridos, toda a progênie de plantas será masculina (XY) e portanto, mais produtiva e menos fibrosa. A obtenção de haplóides in vitro pela cultura de anteras já é uma realidade em solanáceaes, gramíneas e crucíferas.

Página 26

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

5.3. CRIOPRESERVAÇÃO Desde o inicio da multiplicação clonal ou da micropropagação das plantas, uma das grandes dificuldades era a conservação de estoques de material vivo para os cultivos posteriores. A conservação por um logo período pode ser aplicada por técnicas de congelamento de explantes a baixas em nitrogênio líquido (- 196º C). a partir de então tornou-se possível não só a conservação do material por um período mais lon- go, como também a conservação de recursos genéticos vegetais de germoplasmas. Este procurou aten- der dois problemas básicos de estocagem em bancos de germoplasma; de materiais de propagação ve- getativa e de espécies com sementes recalcitrantes. 5.3.1. Métodos para a criopreservação Basicamente são dois os métodos; o congelamento gradual e o congelamento imediato. O resfriamento lento é composto de etapas de congelamento a -20º C em freezer, seguido de abaixa- mento de -70 a -100ºC e a criopreservação em - 196º C. No congelamento rápido existe a necessidade de evitar que as células produzam cristais a partir do con- teúdo celular. Através dessa técnica o conteúdo celular aquoso adquire a conformação vítrea, o que é desejável. Dois momento são críticos para a cultura a ser criopreservada quanto a possibilidade da formação de cristais; na entrada e na saída da criopresrvação. É a razão do sucesso e do fracasso desta técnica em muitos experimentos. Antes da cultura entrar para o sistema de criopreservação, é aplicado um redutor osmótico (manitol 4%) para diminuir o conteúdo celular e um crioprotetor (DMSO), cuja função é de modificar a permeabilidade da membrana, proteção de macromoléculas e inativação de radicais livres (Benson & withers, 1987). A criopreservação pode atender a conservação de suspensões celulares utilizando os seguintes passos (Torres, 1998): - Pré-condicionamento por a 5 dias em meio contendo 6% de manitol. - Crioproteção com 0,5 mol.l-1 DMSO + 0,5 mol.l-1 de glicerol + 1,0 mol.l-1 de sacarose no meio de cultu- ra. - Transferir as cálulas e solução crioprotetora para uma ampola e congelar a uma taxa de 1º C por minuto até -35º a -40ºC, manter a temperatura por 40 minutos, após transferir para o nitrogênio líquido. - Armazenar em nitrogênio líquido; - Descongelar em banho-maria a 40º C. - Extrair as culturas dos meios de crioproteção. Para culturas de parte aérea o procedimento é assim definido (Torres, 1998): - Pré-condicionamento por a 2 dias em meio contendo 5% de DMSO. - Crioproteção com 10% de DMSO no meio de cultura. - Transferir as cálulas e solução crioprotetora para uma ampola e congelar a uma taxa de 0,5º C por mi- nuto até -40ºC, manter a temperatura por 40 minutos, após transferir para o nitrogênio líquido. - Armazenar em nitrogênio líquido; - Descongelar em banho-maria a 40º C. - Extrair as culturas dos meios de crioproteção. 6. PROBLEMAS NA CULTURA IN VITRO O cultivo in vitro como qualquer outro processo é sensível a alguns problemas de ordem ambiental ou biolóigico que afetam diretamente o desenvolvimento das culturas. Dentre estes problemas pode-se citar a oxidação, o declínio no vigor e a hiperhidricidade. 6.1. DECLÍNIO DE VIGOR As plantas desenvolvem o metabolismo de acordo com os estímulos recebidos, e portanto, quando ocor- re problemas determinantes é refletido diretamente na fisiologia vegetal do explante. A baixa taxa de de- senvolvimento é chamada de dclínio do vigor e está associado com a produção de substâncias fenólicas ou a outros fatores como vitrescência, habituação ou maturidade dos explante. A perda de vigor pode ser também afetado por erros no balanço nutricional do meio de cultura, utilização de fitorreguladores inadequados ou falta de repicagem do material vegetal. a) Diminuição da taxa de proliferação algumas espécies apresentam curvas acentuadas na taxa de proliferação da cultura. Esta taxa é bastante variável de acordo com espécie e o tempo de cultivo ou subcultivos. O declínio na taxa de formação de brotos também ocorre frequentemente em culturas que não são repi- cadas.

Página 27

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

b) Habituação Quando os explantes estão em meio de cultura, pode haver habituação para fitorreguladores como a cito- cinina, que por doses de concentração normais não respondem bem ao estímulo. 6.2. NECROSES Necrose pode ser descrita como sendo a morte de uma parte de um organismo vivo. Isto ocorre com ex- plantes colocados in vitro, podendo ter uma perda parcial ou a de toda a cultura (Santos, et. al., 2001). a) Necrose apical em brotações Causas: - Deficiência de cálcio – ocorre principalmente no ápice quando o explante é colocado em meios com bai- xa concentração para a espécie ou quando ocorrem barreiras de disponibilidade do nutriente para a plan- ta. Muito comum acontecer problemas relacionados com elevadas temperaturas que favorece a diferença entre crescimento e translocação do nutriente. Em cultivo in vitro, a alta umidade limita a transpiração e consequentemente a translocação no xilema de íons e compostos, assim como o cálcio pode não alcan- çar os tecidos da região apical. - Substâncias de crescimento - Alguns fitorreguladores podem induzir a necrose apical, principalmente em subculturas, ou ainda, meio inadequado para determinada fase. - Intervalo de subculturas – quando as subculturas não são repicadas e ficam velhas pode ser observado folhas amarelas e queda destas. O momento de fazer a subcultura deve se ajustado de acordo com cada espécie de cultivo. - Gases tóxicos – a chama do bico de bussen para a flambagem da boca dos frascos pode produzir inter- namente e a diminuição de oxigênio. Ocorre a produção de gases como o metano, butano, entano, pro- pano, etileno, metanol e etanol. Esses gases provocam a abscisão foliar, podendo causar a paralisação da cultura, ou ainda ocasionar a morte das brotações. O próprio estado de desenvolvimento fisiológico e crescimento da planta pode produzir altas taxas de CO2, que também é variável de acordo com o período do dia. b) Diminuindo a necrose Prover as culturas com nitrato de cálcio e procurar disponibilizá-lo na forma de fornecer ambiente ade- quado favorece a diminuição de necroses. Outro nutriente importante para algumas espécies é o boro, que também atua nas regiões de intensa divisão celular. A redução dos gases pode ser conseguida com chamas de cor azul para fazer a flambagem da boca dos frascos. Também as fontes podem ser substituídas como areia seca em altas temperaturas. Permitir as trocas gasosas em culturas que se deseja crescimento reduz a concentração de gases tóxicos e aumenta a disponibilidade de oxigênio. Porém, esta prática não deve ser adotada quando se deseja um crescimento mais lento da cultura. 6.3. OXIDAÇÃO A oxidação é a reação do oxigênio com íons metálicos (+) dos outros compostos do meio de cultivo. Os explantes ao serem inoculados no meio de cultura podem liberar exudatos que tornam o meio de cultivo escuro. Este tipo de escurecimento é conseqüência da liberação de fenóis dos ferimentos ocasionados no processo de extração dos explantes (Santos, 2001). As substâncias encontradas em meio de cultura no cultivo de algumas espécies lenhosas foram identifi- cadas como sendo taninos, flavonóides e fenóis (George, 1993). Ferimentos normalmente provocam oxi- dação, sendo que discos foliares apresentam maior oxidação do que segmentos nodais por sofrerem feri- mentos em maior área. O efeito inibitório no desenvolvimento dos explantes é atribuído à presença de taninos e fenóis, sendo a autotoxidade dos exudatos variável com as cultivares, espécies e gêneros. A ocorrência de oxidação pode ser geneticamente correlacionada, ou seja, em gêneros cujas plantas a- presentam maiores teores de tanino ou hidroxifenóis a oxidação ocorre de forma mais intensa como é o exemplo de Quercus, Rhododendron, Sorghum e das coníferas (Santos 2001). Compostos como a cisteína, o carvão ativado, PVP, ácido ascórbico e ácido cítrico têm sido adicionados ao meio de cultura com o objetivo de controlar o processo de oxidação. Carvão ativado adicionado ao meio de cultura em concentrações que variam de 0,3 a 2,0%, cuja ação é adsorver fenóis do meio de cultura, além de atuar induzindo os processos de morfogênese e rizogênese. A poliamina PVP possui também a capacidade de adsorver os compostos fenólicos evitando que estes oxidem e polimerizem. Esta substância é geralmente adicionada ao meio de cultura em concentrações que variam de 0,01- 4,0 %.

Página 28

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

Composição dos meios de cultura com variações na concentração do meio MS, sacarose, exclusão ou diminuição em concentração de ferro e cobre, uso de reguladores de crescimento (variações em tipo e concentrações) além da adição de antioxidantes também podem ser eficientes para controle da oxidação. O ácido cítrico atua como agente quelante de metais, mas não é muito eficiente em retirar ferro da solu- ção. Já o ácido ascórbico normalmente é acrescido ao meio de cultura, possuindo a propriedade de esti- mular a atividade metabólica dos tecidos. A efetividade destes ácidos só tem sido observada, quando adi- cionados ao meio em concentrações entre 10 e 140 mgL-1, podendo reduzir a oxidação em 50%. Explantes jovens são mais propensos a ocorrer a oxidação e geralmente no inicio da cultura de tecidos. A prevenção da ocorrência de oxidação pode ser feita minimizando os danos causados ao explante, re- movendo os compostos fenólicos produzidos ou através da alteração da composição do meio de cultura e a concentração ou tipo de reguladores de crescimento empregados. A remoção dos compostos pode ser feita ainda pela utilização de meios líquidos (facilitam a difusão dos compostos), de diferentes agentes de solidificação, além da adição ao meio de substâncias de adsorção. O agar usado para geleificação do meio pode conter compostos como açúcares, galactose, sulfatos reati- vos e até mesmo presença de cobre, podem apresentar elevada oxidação. 6.4. HIPERHIDRICIDADE A hiperhidricidade é definida como o estado fisiológico que a planta apresenta elevado teor de água no interior das células e tecidos com aspecto translúcido. As alterações na estrutura das plantas cultivadas in vitro são sintomas bastante prematuros de uma complexa síndrome de características anormais. O fenômeno pode ser revertido, desde que seja realizada a transferência de meio de cultivo e adequar o ambiente, dando atenção especial para a temperatura, irradiância, fotoperíodo e concentrações dos ele- mentos do meio de cultivo. A "síndrome do broto de vidro" como também é chamado pode ocorrer em vários níveis de severidade. Inicialmente, apenas uma parte do broto, ou uma ou duas folhas podem ser afetadas. As brotações de culturas que demonstram sintomas leves frequentemente crescem mais rapidamente do que o normal e pode mostrar altas taxas de brotações axilares. Esta vantagem é perdida em condições mais severas de hiperhidricidade (Santos, 2001). Em casos mais extremos, brotos vitrificados tem internódios curtos e o ápice aparece fasciculado. Os bro- tos afetados frequentemente apresentam-se inchados e com uma coloração verde claro e suas folhas são translúcidas, aquosa e com aparência de vidro; as folhas se apresentam também alongadas, túrgidas e frágeis, com uma coloração verde azulada. a) Ocorrência A hiperhidricidade pode ocorrer em culturas de brotos e nós, em regeneração de brotos a partir de calos, em todos as espécies. É mais freqüente em massa de calos de plantas lenho as, mas também ocorre em plantas herbáceas, pode ser conseqüência da difusão passiva da água dentro dos tecidos ou um fenôme- no ativo relacionado a um distúrbio no processo metabólico da planta. b) Fatores que influenciam a hiperhidricidade Culturas que desenvolvem-se rapidamente são menos propensas. Quando se busca melhores condições de cultivo para cada espécie, diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a hiperhidricidade. A hiperhidricidade tende a ser promovida por altas temperaturas, baixa irradiância luminosa ou em cultu- ras mantidas no escuro. Brotos que se desenvolvem em condições contínuas de alta umidade relativa apresentam maior suscepti- bilidade à hiperhidricidade, pois este é provavelmente o ambiente mais favorável para ocasioná-la. Cultu- ras mantidas em meio líquido, incluindo aquelas realizadas com suportes (ponte de papel) geralmente desenvolvem mais facilmente do que aquelas que são cultivadas em meio sólido. Em algumas plantas, brotações normais cultivadas em meio sólido ficam totalmente vitrificadas quando são transferidas para um meio de cultivo líquido. Os brotos apresentam sintomas mais freqüentes quando se utiliza concentrações de BAP acima de 2,0 mg.L-1, suplementado com sacarose e baixas concentrações de sorbitol. Culturas em meios com altas concentrações de BAP sofrem imensamente a indução de hiperidricidade. Isto pode ser evitado transfe- rindo a cultura para um meio que não possua BAP. As auxinas podem às vezes induzir a hiperhidricidade entretanto, a adição de auxinas no meio contendo citocininas, frequentemente aumenta a proporção de vitrificaçâo. O ácido giberélico pode ser utilizado no controle deste problema.

Página 29

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

c) Diminuindo a hiperhidricidade Existem vários fatores que podem auxiliar na prevenção da vitrificação, dentre estes pode-se destacar: 1) Utilização da técnica de duas fases (meio líquido e sólido) no meio de cultura. 2) Aumento da concentração de ágar no meio semi-sólido. 3) Controle da concentração de sacarose. 4) Redução da umidade relativa no ambiente in vitro. 5) Em meio líquido, utilizar suportes porosos para sustentação dos explantes (ponte de papel). 6) Adição ao meio de cultivo um ou mais ácidos orgânicos como o citrato, succinato ou malato para auxili- ar a assimilação do NH4+. 7) Redução da concentração de íons de amônio no meio de cultivo. 8) Utilização de alta de luminosidade. 9) Em meio líquido pode adotar a técnica de submersão temporária. 10) Utilização de um balanço mais adequado entre auxina / citocinina para a espécie estudada. 11) Redução da concentração de micronutriente no meio de cultivo. 12) Transferência da cultura para um meio de cultivo ausente de fitorreguladores. 13) Diminuição do uso de citocininas ou restrição do uso do BAP. Pode-se também aumentar o número de subcultivos. 14) Substituição da sacarose por frutose ou galactose. 15) Ajuste correio do pH do meio de cultivo. 7. ACLIMATIZAÇÃO DAS PLANTAS Aclimatização e aclimatação são termos que apresentam conotações diferentes. O primeiro trata dos pro- cessos para a passagem da planta que está in vitro para o ambiente e é definido como a adaptação cli- mática de um organismo, especialmente uma planta, que é transferida para um novo ambiente, sendo todo esse processo realizado artificialmente. O termo aclimatação tem um significado similar, mas é um processo no qual as plantas ou outros organismos se tomam ajustados a um novo clima ou situação, co- mo resultado de um processo essencialmente natural. Na figura 8 são apresentadas as etapas do desen- volvimento vegetal observando as fases da aclimatização e enraizamento de Feijoa sellowiana. Pesquisas foram realizadas para verificar quais os possíveis problemas referem-se à aclimatização. Um grande número de planta micropropagada não sobrevive quando são transferidas das condições in vitro para o ambiente externo. 7.1. PROBLEMAS DA ACLIMATIZAÇÃOa) Baixa capacidade fotossintética A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas são, inicialmente, muito diferentes daque- las cultivadas em condições de campo. Esta variação na anatomia ou ultra-estrutura pode afetar o pro- cesso de fotossíntese. As organelas que apresentam capacidade autotróficas não estão bem desenvolvi- das, e consequentemente, existe uma dificuldade em aclimatização. No estágio de aclimatização as plântulas sofrem uma mudança drástica quando são removidas dos fras- cos onde a luz e as trocas gasosas são limitadas e existe grande disponibilidade de açúcar. Essa passa- gem faz com que mudem de heterotróficas para autotróficas, com grande gasto de energia. b) Desidratação A desidratação é causada pela elevada perda de água pelas plantas, principalmente nas folhas, ou ab- sorção inadequada de água pelas raízes e, em geral, é o maior problema no processo de transplante e aclimatização. In vitro, as plântulas se desenvolvem com baixa luminosidade e elevada umidade relativa com conseqüente redução do fluxo respiratório. Ao serem expostas a um ambiente com alta luminosida- de e baixa umidade relativa, a taxa de transpiração aumenta, surgindo um déficit hídrico na planta. As plantas que são levadas às casas de vegetação são desprovidas de cutícula na folha e possuem mui- tos estômatos não funcionais. Quando expostas ao ambiente ocorre elevada perda de água e um agrava- mento osmótico intracelular. A morfologia e a densidade dos estômatos podem ser alteradas mudando-se as condições ambientes. Em plântulas de rosa, por exemplo, um aumento na luminosidade e uma diminuição na umidade relativa de 100 para 75%, resultou em estômatos semelhantes às plantas cultivadas em estufa.

Página 30

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

c) Absorção de nutrientes Plantas in vitro quase sempre produzem raízes não funcionais, ou seja, não apresentam capacidade de absorção de água e nutrientes quando colocadas em contato com o solo. As plântulas in vitro ao serem aclimatizadas, passam de um meio onde têm à disposição alta concentração de nutrientes para um subs- trato no qual são forçadas a iniciar o processo de absorção de sais para seu desenvolvimento. A emissão de novas raízes é muito importante, pois as formadas in vitro têm pouca capacidade de absorção e não respondem imediatamente ao momento do transplante, além de serem pouco funcionais, delicadas e pro- pensas ao ataque de microorganismos.

d) Doenças Problemas de doenças podem facilmente aparecer nas culturas que são levadas às casas de vegetação, pois a falta de pressão de inoculo e a dependência do meio não estimulou as plantas a desenvolver o sis- tema de defesa contra microrganismos. A fragilidade da plântula in vitro aliada à alta umidade relativa, na qual é aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactérias. É essencial, portanto, que se faça u- ma prevenção de doenças para o sucesso do transplante, durante e após a aclimatização.

Página 31

Figura 15 - Culturas de bromélia cultivada em processos de biorreatores de imersão temporária e a seqüência de formação, determinação e regeneração dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

7.2. FATORES QUE AFETAM A ACLIMATIZAÇÃO 1) As plantas micropropagadas devem ser sadias e apresentarem baixo inoculo de patógenos. 2) A manutenção da alta umidade relativa, por alguns dias após o transplante, é considerada ponto crítico para a sobrevivência das plântulas. Um número significante de laboratórios comerciais tem evitado o uso de um sistema automático de irrigação para este propósito, por tornar o meio excessivamente úmido, fa- vorecendo o crescimento de fungos e algas. O sistema preferencial é o "fogging" ou nebulização são os mais indicados. 3) Inicialmente é necessário fornecer baixas quantidades de luminosidade e irradiância para as plântulas. Quando submetidas ao aumento de luz sofrem um processo de destruição das moléculas de clorofila, tor- nando-se cloróticas e queimadas. Para evitar esses problemas, as plântulas podem ser removi- das.gradualmente, para uma intensidade de luz sob a qual manterá seu crescimento; 4) A temperatura da aclimatização deve ser tão próximo a que estava no ambiente, podendo ser gradual- mente ajustada com o decorrer do tempo. 5) O pH do solo deve ser apropriado para cada espécie. Fertilidade e porosidade para promover drena- gem adequada e aeração; 6) Fornecer volume adequado da área de enraizamento, conforme cada espécie. 7) Para a fertilização muitos laboratórios adicionam, periodicamente, macro e/ou micronutrientes no subs- trato em que as plântulas são transplantadas; 8) Normalmente, antes do transplante, as plântulas são lavadas, de preferência, com água morna para retirada total do meio de cultura e plantadas em substrato esterilizado. Alguns autores recomendam a la- vagem das plântulas com solução fungicida, enquanto outros, não aconselham seu uso durante as pri- meiras duas semanas depois do transplante, pois podem ser fitotóxicos nesta fase. 8. ENRAIZAMENTO O enraizamento é uma etapa que define o resultado final da microropagação, é a etapa onde ocorre a formação de raízes adventícias nas partes aéreas. Pode ser dividido em indução, iniciação e alongamen- to das raízes (Torres, 1998). Pode ser realizada in vitro como no ambiente externo, porém resultados mais satisfatórios para a maioria das espécies, tem sido obtidos no enraizamento ex vitro. A opção por um dos sistemas depende da qualidade da estaca, da espécie de trabalho, das condições do laboratório e dos recursos disponíveis. Pode-se também criar um terceiro sistema, onde as estacas são mantidas in vitro até a indução da rizogênese e, posteriormente, são transplantadas em um substrato ex vitro para desenvolvimento das raízes. É necessário que se tenham formados estacas da espécie de trabalho, com folhas e outros tecidos dife- renciados, para a indução e formação das raízes. O enraizamento é variável de espécie para espécies e de acordo com o tratamento hormonal aplicado. O uso de auxinas favorece a indução e a iniciação radi- cular e inibe o alongamento, porém concentrações elevadas podem levar à formação de calos. Para a indução de enraizamento o método mais utilizado é o uso de pulsos de auxina (normalmente, AIB na con- centração de 500 a 1000 ppm em 1 a 5 min-1 para estacas lenhosas) na base da estaca. Espécies her- báceas e regiões jovens das plantas geralmente enraízam mais facilmente que espécies lenhosas e regi- ões mais maduras. 8.1. ENRAIZAMENTO IN VITRO A vantagem deste tipo de enraizamento é o melhor controle das condições em que se trabalha e, com isso, a obtenção de um alto percentual de enraizamento. Por outro lado, a desvantagem do método é que as raízes formadas in vitro nem sempre são eficientes na absorção de água e de nutrientes, no momento da passagem das mudas para o substrato. Raízes produzidas in vitro podem possuir poucos pêlos radiculares e conexões vasculares, e só começarem a desenvolver o câmbio secundário quando são removidas do frasco de cultura. O enraizamento in vitro pode ocorrer de duas formas: quando as raízes são formadas a partir de brota- ções sendo chamado de processo direto, e quando são formadas a partir de calo, denomina-se de pro- cesso indireto. Em ambos os casos, se não houver uma ligação vascular eficiente entre a parte aérea e a parte subterrânea, a aclimatização da muda é dificultada, podendo comprometer sua sobrevivência. A rizogênese está associada à ação de reguladores de crescimento (internos e externos), principalmente nas fases iniciais da indução da formação das raízes. Algumas espécies, contudo, já possuem um nível endógeno de fitormônios suficiente e só enraízam na ausência de qualquer tipo de regulador, podendo ou não necessitar apenas de uma pequena lesão na base da estaca.

Página 32

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

Auxinas como o AIB (ácido indolbutírico), AIA (ácido indolacético) e ANA (ácido naftalenoacético) são os principais reguladores envolvidos no processo de enraizamento in vitro. Em alguns casos, a concentração de auxina que promove bom enraizamento não é a mesma que promo- ve uma alta sobrevivência ex vitro. As concentrações mais utilizadas para induzir rizogênese normalmen- te estão entre 1,0 - 10,0 mg.L-1 para AIA, 0,05 - 1,0 mg.L-1 para ANA e 0,5 - 3,0 mg.L-1 para AIB (Soares et. al., 2001). A análise do método de enraizamento deve levar em consideração o relutado final, ou seja, o número de mudas produzidas e a qualidade fisiológica das plântulas, que na maioria das vezes é dependente do método de indução e fitorregulador usado. A auxina deve ser aplicada no meio de cultu- ra ou anteriormente à inoculação do explante (no caso de enraizamento ex vitro), levando-se em conta que a sua concentração é inversamente proporcional ao tempo de permanência com o regulador. Associadas às auxinas, outras substâncias também interferem de forma direta ou indireta no enraizamen- to dos explantes. Poliaminas, ácido sulfúrico, cloreto de magnésio e compostos fenólicos, como o floro- glucin, atuam, por exemplo, estimulando a síntese de AIA ou liberando a auxina existente no explante. Já as citocininas, geralmente utilizada para estimular a formação de brotações, costumam inibir o enraiza- mento. Existem poucos casos em que uma citocinina não interfere ou estimula a formação das raízes. As giberelinas funcionam como as citocininas, inibindo, na maioria das vezes, a rizogênese. Fatores ambientais, tais como tamanho dos recipientes de inoculação, meio de cultura, gases, substratos, luz, temperatura e o próprio explante, também afetam a formação de raízes. O tamanho dos frascos onde os explantes são colocados ajuda ou dificulta a formação e o crescimento das raízes, no momento em que se tornam uma barreira física (Soares et. al, 2001). Em frascos maiores se torna mais fácil conseguir o enraizamento. A concentração de sais no meio de cultura pode ser regulada de acordo com cada espé- cie, de forma que a redução da concentração iônica dos meios (50% ou 75% da força total do meio) pode favorecer esta etapa do processo de micropropagação. 8.2. ENRAIZAMENTO EX VITRO A técnica de enraizamento ex vitro consiste em destacar brotações e plantá-las no substrato desejado, que pode ser: turfa, areia, vermiculita, perlita, bandejas de espuma fenólica e ou substratos comerciais, ainda solo esterelizado. As estacas não podem ser nem muito grandes, nem muito pequenas, pois esses extremos são de difícil manuseio, dificultam o enraizamento e demandam mais tempo para formar mu- das. Estacas de tamanho entre 2 e 5 centímetros são as ideais. Se possível, o plantio deve ser em gru- pos, ao invés de isoladas, o que favorece o enraizamento, que, geralmente, ocorre em 2 a 5 semanas. A principal vantagem do enraizamento ex vitro é o menor custo financeiro que esta técnica proporciona. As estacas brotadas, ao invés de serem inoculadas em meios de cultura com reguladores propícios ao enraizamento, são enraizadas fora das condições assépticas dos frascos de cultura, já fazendo parte da etapa seguinte, a aclimatização. Calcula-se que os recursos economizados por esta técnica, cheguem a 75% dos gastos totais, o que cor- responde justamente aos gastos com mão-de-obra e materiais apenas para esta etapa da micropropaga- ção. Como um dos grandes problemas da cultura de tecidos de plantas são os gastos com a produção, esta alternativa é muito importante para obter uma produção com baixos custos. O enraizamento ex vitro reduz o tempo de cultivo e de comercialização da muda, pois elimina uma etapa do processo de micropropagação, misturando as etapas de enraizamento e aclimatização. No entanto, o enraizamento ex vitro não possui apenas vantagens. Em algumas espécies, a taxa de enra- izamento ex vitro é tão baixa, que a utilização deste processo é inviável. Em outras, a estaca, antes do enraizamento, necessita de passar por uma etapa chamada de "endurecimento", para conseguir sobrevi- ver ao ambiente adverso da fase de aclimatização. A alta sensibilidade das estacas requer cuidados es- peciais para enraizar. As condições de aclimatação que favoreçam o endurecimento sempre são positivas para o número final percentual de enraizamento. Devido ao substrato ser mais poroso e melhor arejado, as raízes formadas são mais funcionais e eficien- tes na absorção de água e nutrientes. Isso aumenta o número de sobreviventes na aclimatização e tam- bém diminui o tempo de formação da muda. Se necessário e de acordo com a espécie micropropagada, pode-se enriquecer o substrato com sais, do meio de cultura nutritiva ou reguladores de crescimento co- mo auxinas, que aumentam a intensidade e a velocidade do enraizamento. Estes reguladores podem ser aplicados diretamente no substrato ou na passagem das estacas do tubo de cultura para o substrato.

Página 33

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

8.3. FATORES DEPENDENTES DA PLANTAa) Genótipo – em muitas espécies é um fator controlada genéticamente. Na prática, este fator pode ser manipulado ou diminuído, mediante uma série de mediadas aplicadas, visando a manifestação de ativida- des bioquímicas e fisiológicas do explante, provocando variações ambientais para as condições de enrai- zamento. b) Estresse hídrico – provoca o aumento do conteúdo de ABA e etileno nas folhas, compostos inibidores de enraizamento. Também afeta o níveis endógenos de citocinina, uma vez que o interesse é nas raízes. Um fator para diminuir o estresse hídrico é diminuir gradativamente a umidade relativa do ar nos frascos in vitro. c) Carboidratos – a maior influência dos carboidratos está ligada a relação C/N. valores entremos desta relação são desaconselháveis (Torres, 1998). Assim, a redução da disponibilidade de nitrogênio na maio- ria dos casos aumenta consideravelmente o taxa de enraizamento. Também em algumas espécies lenho- sas um pré tratamento com elevadas doses de açúcar também favorecem. d) Nutrição mineral – o estado nutricional da planta influencia diretamente a taxa de enraizamento. Res- trição em potássio, fósforo, magnésio e cálcio tendem a afetar os processos de rizogênese. O cálcio é um ativador de peroxidases, uma enzima que parece ser essencial para os processos de enraizamento (Hassig, 1986; Torres, 1998). Normalmente, plantas deficientes em nitrogênio tendem a enraizar melhor. e) Condições de crescimento da planta – fatores de estiolamento fazem a indução de sinalização de auxinas. O estiolamento é conseqüência de cultivos em ambientes com baixa luminosidade. Apesar de que o local de enraizamento deva ser escuro, é necessário que a parte aérea tenha um bom padrão de luminosidade para a produção de auxinas promotoras de enraizamento. f) Idade fisiológica – explantes juvenis apresentam maior facilidade de enraizamento, uma vez que, os tecidos novos são mais responsivos. 8.4. FATORES RELACIONADOS AO EXPLANTEa) Estação do ano – certas espécies apresentam propensão ao enraizamento o ano todo, porém, princi- palmente plantas que apresentam estágios hibernais o processo é facilitado nos períodos que acontece a quebra de dormência seguido de pouco espaço de tempo após. b) Presença e número de folhas – algumas espécies são dependentes da presença de folhas, funcio- nam como reserva de compostos nitrogenados, sacarose e auxinas. O número de folhas influencia a ve- locidade de enraizamento. c) Posição do explante na planta matriz – o teor endógeno de hormônios, promotores ou inibidores, varia com a idade fisiológica e cronológica dos tecidos. Deste modo tecidos de um mesma planta pode apresentar respostas morfogenéticas diferentes. d) Meio nutritivo na fase de multiplicação – efeito de GA3 e BAP do meio de cultivo, podem provocar baixas taxas de enraizamento, por outro lado pré tratamentos com auxinas podem reverter este fator. e) Inibidores endógenos – substância fenólicas produzidas pela resposta aos ferimentos e liberadas nestas regiões podem diminuir sensivelmente a taxa de enraizamento. 8.5. FATORES LIGADOS AO MEIO DE ENRAIZAMENTOa) Reguladores de crescimento – auxinas sintéticas e naturais podem sozinhas promover o enraiza- mento. Contudo, a concentração a ser aplicada é variável de espécie para espécie, em algumas não há necessidade. Os reguladores de crescimento mais utilizados são: AIB e ANA, em menor grau de uso, 2,4 D e 2,4,5 T. b) Outras substâncias – compostos fenólicos apresentam relação sinérgicas com a as auxinas (Torres, 1998). Os carboidratos fornecem energia, existindo a disponibilidade no meio, há a necessidade de for- mação de raízes para a receptação destes. O fornecimento de sais minerais é sempre necessária, princi- palmente P, K, Ca e Mg. O boro tem sido considerado muitas vezes, um dos mais importante fator de crescimento para muitas espécies. Espécies lenhosas são beneficiadas com o usos de carvão ativado quando do enraizamento in vitro. c) Estado físico da cultura – a passagem de um gradiente líquido para sólido-poroso é dramático para a cultura, um balaço mais adequado do estado físico dos meios favorece o processo. d) pH – o mais adequado para as maioria das culturas é que seja próximo de 6,5 a 7,0, porém é sempre necessário estar próximo daquele que se encontrava na fase anterior,caso a cultura estiver desenvolven- do bem. e) Condições de incubação – a luz influência na regulação da morfogênese e atua com fonte de energia para a realização da fotossíntese (Hartmann & Kester, 1983; Torres, 1998). Na rizogênese a irradiância e o fotoperíodo são determinantes, vale aplicar este balanço de acordo com cada espécie. A luz favorece o desenvolvimento de partes aéreas e o escuro a rizosfera.

Página 34

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

9. APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS PARA O MELHORAMEN- TO As principais aplicações das técnicas de cultura de tecidos vegetais podem ser sumarizadas nas seguin- tes: a) Cultura de meristemas Técnica mais antiga para a propagação clonal massal e para a obtenção de plantas livres de virus, princi- palmente quando combinada com a técnica de termoterapia. Esta técnica é relativamente simples e apli- cável a um grande número de espécies. Também considerando o fato de que as células do meristema apical caulinar são menos diferenciadas que as demais, a cultura de meristemas permite a obtenção de uma progênie clonal geneticamente idêntica à planta matriz, permitindo a captura e fixação de ganhos genéticos. Além disto, considerando os atributos destes meristemas eles tornam-se alvos ideais para a conservação in vitro de germoplasma e o intercâmbio internacional de germoplasma. b) Avaliação rápida de suscetibilidade A cultura de células, tecidos e órgãos pode ser empregada para a avaliação de suscetibilidade/tolerância à várias moléstias ou estresses abióticos. Esta avaliação somente será útil quando tecidos e órgão res- ponderem de forma similar às respostas da planta inteira. c) Indução de florescimento precoce Esta técnica é empregada para reduzir o longo período de juvenilidade que ocorre principalmente nas plantas perenes, permitindo uma redução substancial de tempo nos programas de melhoramento genéti- co. d) Reversão de fases de desenvolvimento Em plantas arbóreas, florestais e frutíferas, a seleção de plantas elite é baseada nos espécimes mais ve- lhos e comprovadamente sadios e produtivos. A propagação vegetativa convencional destas plantas tor- na-se dificultada. O cultivo in vitro continuado pode restaurar a juvenilidade nestes genótipos facilitando a propagação clonal massal. e) Embriogênese somática Células vegetais são consideradas totipotentes uma vez que possuem o potencial de regenerar uma planta completa. O padrão ideal de produção de plantas a partir de células simples é por meio da embrio- gênese somática, onde, as células são objeto de mudanças de estrutura e organização, similares aquelas que ocorrem durante a embriogênese zigótica. Embriões somáticos são produzidos em um grande núme- ro de espécies, mas ainda não há segurança quanto à estabilidade genética e uniformidade fenotípica das plantas regeneradas por esta técnica. A embriogênese somática têm sido a técnica empregada como sistema regenerativo preferencial para a transformação genética (figura 17).

Página 35

Figura 17 - Integração de embriogênese somática em um programa conservação e ou melhoramento genético

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

f) Haplodiploidização A descoberta de Guha e Maheshwari (1964) de que anteras de Datura inoxia cultivadas in vitro podiam regenerar plantas haplóides trouxe grande impacto para a aplicação de técnicas biotecnológicas ao me- lhoramento de plantas. Esta técnica baseia-se na rediferenciação de células gametofíticas gerando em- briões ou calos. Embora preferindo-se a formação de embriões somáticos como rota regenerativa para a obtenção de haplóides geneticamente estáveis, a formação de calos também pode ocorrer, particular- mente em cereais. Após a obtenção dos haplóides a di-haploidização pode ocorrer espontaneamente ou como resultado do tratamento com colchicina. A principal vantagem é a obtenção de linhas homozigotas homogêneas rapidamente.

g) Variação somaclonal O ambiente da cultura in vitro pode induzir variabilidade nas culturas e este fenômeno, primeiramente ob- servado por Larkin & Scowcroft (1981), foi denominado de variação somaclonal. A variabilidade gerada desta maneira pode ser importante para o melhoramento genético.

h) Cruzamento amplos A ampliação da base genética para o melhoramento de plantas pode envolver cruzamentos interespecífi- cos e intergenéricos.

Por exemplo, Atylosia, um gênero taxonomicamente próximo à Cajanus, apresenta espécies com carac- terísticas desejáveis, como resistência a moléstias e insetos e tolerância à salinidade e seca. Alguma es- pécies de Atylosia hibridizam com Cajanus, enquanto que outras não. Mesmo após cruzamentos bem sucedidos, ocorrem barreiras de pós-fertilização, como o não desenvolvimento do endosperma e a sub- seqüente degeneração do embrião híbrido. Nestes casos, o resgate e a cultura de embriões pode facilitar a obtenção de híbridos viáveis.

Além de permitir uma nova fonte de variabilidade genética, a hibridização ampla tem se mostrado como técnica promissora para a produção de plantas haplóides via eliminação seletiva de cromossomos, sendo conhecida como ‘técnica bulbosum’. Assim, quando Hordeum vulgare é empregada como mãe em cruza- mentos com H. bulbosum, após a polinização e fertilização, o embrião resultante pode ser haplóide uma vez que o conjunto cromossômico de H. bulbosum pode ser seletivamente eliminado.

i) Hibiridização somática/fusão de protoplastos Esta técnica, descrita inicialmente por Carlson et al. (1972), pode ser considerada uma forma de enge- nharia genética. Nela, protoplastos são isolados e fundidos, envolvendo interações nucleares e citoplas- máticas. A hibridização somática produz híbridos nucleares ou híbridos citoplasmáticos (cíbridos) e sua eficiência depende do controle dos vários estágios da técnica: isolamento e fusão, identificação e seleção dos heterocariontes e células híbridas e a regeneração de plantas. A fusão de protoplastos de diferentes origens pode ser quimicamente induzida com o a auxílio de um agente indutor, como o polietileno glycol (PEG) ou eletricamente induzida (eletrofusão).

A fusão somática também pode permitir aos melhoristas a manipulação de características extra- cromossômicas, como a macho-esterilidade. O procedimento resulta na união do citoplasma dos genito- res, enquanto que nos cruzamentos sexuais apenas a mãe contribui com o citoplasma. Assim, a fusão de proptoplastos pode permitir a obtenção híbridos contendo diferentes tipos de citoplasma, o que não pode ser obtido pelos métodos convencionais.

A hibridização somática também pode ser empregada para superar algumas das limitações inerentes aos cruzamentos amplos que ocorrem entre espécies ou gêneros divergentes. A maior restrição desta técnica refere-se, contudo, ao desbalanceamento genômico, perda de cromossomos não pareados ou falta de fusão nuclear. Mesmo quando a fusão ocorre, pode ocorrer a perda seletiva de cromossomos e o desba- lanceamento nuclear resultante pode reduzir a viabilidade e o potencial regenerativo. Esta tem sido a principal limitação para a aplicação desta técnica para o melhoramento genético de plantas.

Página 36

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

10. PERSPECTIVAS PARA A APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAISa) CURTO PRAZO: Propagação massal de genótipos superiores a partir de: - Pequena quantidade de sementes - Genótipos-elite - Material limitado de plantas raras ou ameaçadas de extinção - Híbridos obtidos em cruzamentos Conservação de germoplasma in vitro b) MÉDIO E LONGO PRAZO: - Aumento do ganho genético por capturar ou explorar a variância total em comparação ao componente aditivo dos programas convencionais de melhoramento (baseados principalmente em seleção recorren- te). - Melhoria dos protocolos para a embriogênese somática visando o "scale-up", a obtenção de sementes sintéticas e a diminuição do custo em comparação ao seedling obtido por métodos convencionais. - Propagação massal de plantas a partir de:hibridação somática, variantes somaclonais e por técnicas de DNA recombinante. 11. ESPÉCIES E TECNOLOGIAS EMPREGADAS A seguir são listados alguns exemplos de espécies vegetais e respectivas tecnologias cujo emprego já é corrente: - Dendezeiro: primeiro projeto no qual plântulas originadas a partir de embriogênese somática foram cul- tivadas a campo, (Unilever, Malasia, 1975). - Coniferas: primeiro projeto no qual tecnologias de poliembriogênese somática desenvolvidas e patente- adas pela Universidade da Cailfornia-Davis foram transferidas para empresas de reflorestamento (Weyerhaeuser, Washington, USA), para a clonificação de genótipos superiores resultantes de progra- mas convencionais de melhoramento genético. - Eucaliptos: organogênese, embriogênese somática (USA, Europa). Microestacas (Brasil): aumento de 135% na produtividade de polpa a partir de clones selecionados em comparação a população base. - Pyrus, Malus, Prunus: Limpeza viral e micropropagação (cultura de meristemas e de segmentos no- dais) para a propagação massal de porta-enxertos e para o estabelecimento de variedades-copa matrizes sadias. - Videira: embriogênese somática e organogênese para a propagação massal de porta-enxertos e varie- dades-copa isentas de moléstias. - Bananeira: regeneração em larga escala de mudas isentas de pragas moléstias. Obtenção de variantes somaclonais e de mutagênese in vitro para resistência ao mal do Panamá e Sigatoka-negra. Atualmente a maior parte dos bananais da América Central e do Caribe são instalados com mudas micropropagadas produzidas em Biofábricas desenvolvidas para este fim, principalmente em Cuba. - Moranguinho, abacaxizeiro, alho, cebola, batatinha, mandioca: Obtenção de plantas matrizes isen- tas de viroses, pela aplicação da técnica de cultura de meristemas e subsequente micropropagação mas- sal. Indução e obtenção de variantes somaclonais e mutagênese in vitro para ampliação da base genética e melhoramento genético. -Tomateiro: variantes somaclonais e transformação genética para coloração e conservação. DNAP e Calgene (USA). Primeira autorização de liberação para cultivo comercial de produto transgênico dada pe- lo FDA americano, em 1994. - Citros, mamoeiro e mangueira: modelos embriogenéticos. Melhoramento e plantas isentas de molés- tias. - Brassica sp: resgate de embriões resultantes de cruzamentos incompatíveis, ativação de embriogêne- se somática e encapsulamento para a obtenção de sementes sintéticas. Sakata Seed Co., Japão. - Cacau e café: embriogênese somática para a propagação massal de variedades melhoradas e resis- tentes a moléstias (EUA e Costa Rica). 12. VANTAGENS DA MICROPROPAGAÇÃO EM PLANTAS PERENES Técnicas de cultura de tecidos vegetais, podem se transformar em ferramentas auxiliares eficazes para o melhoramento de plantas perenes. Algumas vantagens são listadas a seguir: a) Como a multiplicação massal de um genótipo superior é possível em qualquer estágio de um programa de melhoramento, a micropropagação tem o potencial de promover o aumento de ganhos genéticos em apenas uma geração; b) A propagação massal pela clonificação de genótipos superiores captura os componentes aditivos e não aditivos da variância genética;

Página 37

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

c) Genes desejáveis de clones selecionados podem ser mantidos em um banco genético na forma de po- mares clonais, onde podem ser recombinados através de cruzamentos dirigidos; d) Interações genótipo-ambiente podem ser melhor estudadas em populações clonais; e) A seleção clonal in vitro e a micropropagação podem ser utilizadas para a produção de genótipos su- periores e o tempo necessário para produzir grandes quantidades de plantas é menor no programa clonal do que em um programa baseado nos pomares clonais; f)Técnicas de micropropagação possibilitam a produção de um grande número de progenitores genética- mente uniformes para a produção de sementes híbridas. 13. LIMITAÇÕES Mesmo considerando-se as diversas aplicações, ainda existem limitações para a aplicação mais ampla destas técnicas no melhoramento de plantas: a) Em muitos sistemas de cultura de tecidos a variação introduzida é epigenética e, portanto, limitante para o melhoramento de plantas. b) Variações deletéreas como redução na fertilidade e fixação de frutos e sementes e outras variações morfológicas ocorrem em variantes somaclonais, com várias implicações no melhoramento de plantas, principalmente quando a uniformidade genética é o objetivo. c) O sucesso de um sistema regenerativo in vitro é substancialmente dependente da adequação de um meio de cultura apropriado para cada espécie. d) O desenvolvimento de eixos caulinares, gemas e embriões somáticos não é, em geral, sincronizado, dificultando a aplicação de sistemas-biofábricas. 14. CONSIDERAÇÕES FINAIS A possibilidade de uma adequada manipulação da morfogênese in vitro para a obtenção de processos regenerativos via organogênese ou embriogênese somática parece ser dependente de condições deter- minativas e permissivas. Nas primeiras salientam-se a "condição fisiológica do explante" e o tipo e con- centração do regulador de crescimento a ser utilizado como sinal químico para a indução/ativação da morfogênese. De maneira geral, quanto mais juvenil for o tecido doador de explantes e quanto mais me- ristemática for sua condição, maiores serão as possibilidades de se orientar a morfogênese in vitro. Para a embriogênese somática, restam poucas dúvidas de que tecidos embrionários são os mais adequados para a extração de respostas nesta rota, apesar de que nem sempre estes tecidos são os mais interes- santes para os propósitos a serem obtidos. Com respeito aos reguladores de crescimento, a sua ação para a obtenção de respostas organogenéticas relaciona-se aos padrões apontados por Skoog e Miller (1957), isto é, balanços favoráveis as citocininas tendem a induzir organogênese aérea enquanto que ba- lanços favoráveis as auxinas favorecem a rizogênese. Para a ativação/indução da embriogênese somáti- ca a adição de auxinas fortes ao meio de cultura primário parece ser uma condição essencial para o de- sencadeamento de reações metabólicas associadas com esta rota, apesar de que o balanço entre fontes nitrogenadas orgânicas e inorgânicas, oxidadadas e reduzidas parece exercer considerável influência. As chamadas condições permissivas incluem a composição geral dos meios de cultura e as condições físi- cas, tais como temperatura e fotoperíodo. A utilização de técnicas de cultura de tecidos para a regeneração e propagação massal de genótipos su- periores via organogênese e embriogênese somática é prática rotineira em muitos laboratórios. Algumas limitações dizem respeito a necessidade de melhoria geral dos protocolos utilizados e a definição e esta- belecimento de protocolos para as chamadas espécies "recalcitrantes". Ênfase especial deve ser dada a possibilidade de estabelecimento de suspensões celulares morfogenéticas. Um maior detalhamento das técnicas de biologia celular e molecular vem permitindo um maior refinamento das técnicas de cultura de tecidos vegetais e a conseqüente aplicação para tecnologias de protoplastos e transformação genética.

Página 38

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

15. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ammirato, P. G. V. 1993. Embryogenesis, in: Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Ammirato, P. G. V.; Yamada, Y. Handbook of plant cell culture. New York: MacMilam Publischer Company, v.1, 123p. Button, J. & Kochba, J. 1977. Tissue culture in the citrus industry. In: Plant cell, tissue and organ culture. Reinert, J. & Bajaj, Y.P.S. (eds.). pp. 70-92. Springer-Verlag. Berlin. Cocking, E.C. 1960. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature, 187:962-963. Christianson, M.L. 1985. An embryogenic culture of soybean: towards a general theory of somatic embryogenesis. In: Tissue Culture in Forestry and Agriculture. Henke, R.R.; Hughes, K.W.; Constantin, M.J.; Hollaender, A. (eds). pp. 83-103. Plenum Press. New York. Debergh, P.C. & Read, P.E. 1991. Micropropagation. In: Micropropagation Technology and Application. Debergh, P.C. & Zimmermann, R.H. (eds.). pp. 3-13. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Durzan, D. & Gupta, P.K. 1988. Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in conifers. In: Biotechnology in Agriculture. Mizrahl, A. (ed.). pp. 53-81. Allan Liss. New York. George, E. F. 1996. The derivation, preparation, and use of culture media, In: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. X, p. 344-419. George, E. F. 1996. Embryogenesis: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. VII, p. 612- 623. George, E. F. 1996. Plant grow regulators: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. XI, p. 420-479. George, E. F. 1996. Plant propagation and micropropagation: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. II, p. 37-66. George, E. F. 1996. Plant tissue culture techeniques: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. I, p. 3-36. Guerra, M.P. and Handro, W. 1988. Somatic embryogenesis and plant regeneration in embryo cultures of Euterpe edulis mart. (palmae). Plant Cell Reports, 7:550-552. Guerra, M.P.; Torres, A.C.; Teixeira, J.B. 1999. Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas. In: Tor- res, A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. (eds.). Culturas de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Bra- sília, Embrapa-CBAB. pp. 533-568. V.2. Gupta, P.K. & Durzan, D.J. 1986. Somatic polyembryogenesis from callus of mature sugar pine embryos. Biotechnology, 4:643-45. Haccius, B. 1978. Question of unicellular origin of non-zigotic embryos in callus cultures. Phytomorphology, 28:74-81. Harmann, H.T. & Kester, D. 1975. Plant propagation:principles and practices. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N.J. Hartmann, T.H.; Kester, D.E.; Davies, F.T. 1990. Plant Propagation, Principles and practices. Prentice Hall. New Jersey. 647 p. Krikobian A. D., 1993. Prpagacion clonal in vitro. In Roca W., Mroginski L. A. (eds) Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT – Cali, Colombia. Cap 11, p. 95-117. Litz, C. 1987. Application of tissue culture to tropical fruits. In: Plant Tissue and Cell Culture. Green, C.C.; Somers, D.A.; Hackett, W.P.; Biesboer, D.D. (eds.). pp.407-18. Allan R. Liss. New York. Lutz, J.D.; Wong, J.R.; Rowe, J. 1985. Somatic embryogenesis for mass cloning of crop plants. In: Tissue culture in forestry and agriculture. Henke, R.R.; Hughes, K.W.; Constantin, M.J.; Hollaender, A. (eds). pp.105-16. Plenum Press. New York. Miller, C.O.; Skoog, F.; Okumura, F.S.; Von Saltza, M.; Strong, F.M. 1955. Structure and synthesis of Kinetin. J. Am. Chem. Soc. 77:2662-63 Mullins, M.G. 1987. Propagation and genetic improvement of temperate fruits, the role of tissue culture. In: Plant Tissue and Cell Culture. Green, C.C.; Somers, D.A.; Hackett, W.P.; Biesboer, D.D. (eds.). pp.395- 406. Allan R. Liss. New York. Murashige, T. 1974. Plant propagation through tissue cultures. Ann. Rev. Plant Phys., 25:135-66. Murashige, T. 1977. Clonal crops through tissue culture. In: Tissue Culture and its bio-technological application. Barz, W.; Reinhard, D.E.; Zenk, M.H. (eds). pp. 392-403. Springer-Verlag. Berlin. Neumann, K. H. 2000. Some study on somatic embryogenesis, a tool in plant biotechnology. 87 th. Indian Science Congress. http://bibd.uni.grtessen.de/gdoc//2000/uni/poooo4.pdf. Acessado 10 ago. 2004. Pence, V.C.; Hasegawa, P.M.; Janick, J. 1979. Asexual embryogenesis in Theobroma cacao L. Jour. Amer. Soc. Hort. Sci., 104(2):145-48. Peters, J. A. 1986. Utilização de biotecnologia no melhoramento de fruteiras. Revista Brasileira de Fruti- cultura, 8(3):19-22.

Página 39

A P O S TIL A DE BI O TE C NO L OGI A— CC A / UF SC — MP G UE R R A & RO N O DA RI ; E DIÇ Ã O DA S TEI NMA C H E R (2 0 0 6)

Reinert, J. 1959. Uber die Kontrolle die Morphogenese und die Induktion von Advetiveembryonem an gewebekulturen aus karotten. Planta, 53:318-33. Roca W., Nuñez V. Morman K. 1993. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. Roca W., Mroginski L. A. (eds) Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT – Cali, Colombia. Cap 11, p. 271-279. Roca W., Nuñez V. Morman K. 1993. Estabelecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro. Roca W., Mroginski L. A. (eds) Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT – Cali, Co- lombia. Cap 11, p. 19-36. Santiago, E. J. A.; Paiva, R.; Paiva, P. D. O.; Santana, J. R. F.; Gomes, G. A. C. 2001; Aclimatização: Cultura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, M.G. 7:64-67. Santiago, E. J. A.; Paiva, R.; Paiva, P. D. O.; Santana, J. R. F.; Gomes, G. A. C. 2001; Meios de cultura: Cultura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, M.G. 3:22-35. Santiago, E. J. A.; Paiva, R.; Paiva, P. D. O.; Santana, J. R. F.; Gomes, G. A. C. 2001; Multiplicação: Cul- tura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, M.G. 5:50-57. Santos, R. B.; Paiva, R.; Paiva, P. D. O.; Santana, J. R. F., 2001; Problemas no cultivo in vitro: Cultura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, M.G. 9:73-79. Sinnot, E.W. 1960. Plant Morphogenesis. McGraw-Hill, New York. Skoog, F. & Miller, C.O. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. for Exp. Biol., 11:118-31. Soares, A. S.; Paiva, R.; Paiva, P. D. O.; Santana, J. R. F.; Paiva, L V. 2001; Enraizamento, In: Cultura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, M.G. 6:58-63. Sondahl, M.R. & Monaco, L.C. 1981. In vitro methods applied to coffee: Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture. Thorpe, T.A. (ed.). pp. 325-47. Academic Press. New York. Steward, F.C.; Mapes, M.O.; Mears, K. 1958. Growth and organized development of cultured carrots. II. Organization in cultures from freely suspended cells. Amer. Jour. Bot., 454:705-8. Street, H.E. 1977. Cell (Suspension) Cultures - Techniques. In: Plant Tissue and Cell Culture. Street, H.E. (ed.). pp. 61-102. University of California Press. Berkeley and Los Angeles. Tisserat, B. 1979. Tissue culture of the date palm. J. Hered., 70:221-222. Thrope T. A..; Vilalobos V. M., 1993. Micropropagacion: conceptos, metodología y resultados. In Roca W., Mroginski L. A. (eds) Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT – Cali, Colombia. Cap 11, p. 127-138. Thorpe, T.A. 1980. Organogenesis in vitro: structural, physiological, and biochemical aspects. In: Perspectives in Plant Cell and Tissue Culture. Vasil, I.K. (ed.). pp. 71-111. Academic Press. New York. Vasil, I.K.; Ahuja, M.R.; Vasil, V. 1979. Plant tissue culture in genetics and plant breeding. Adv. Gen., 20:127-215. Vasil, I.K. 1982. Somatic embryogenesis and plant regeneration in cereals and grasses. In: Plant Tissue Culture 1982. Fujiwara, A. (ed.). pp. 101-103. Maruzen. Tokyo.

Página 40

Sobre nossas áreas de atuação:

As áreas de atuação do LFDGV abrangem a Biotecnologia Vegetal, a Fisiologia do Desenvolvimento Vegetal e a Genética Vegetal. As princi- pais linhas de pesquisa em andamento vinculam-se à indução e controle da morfogênese in vitro, a cultura de tecidos e micropropagação de plan- tas, a conservação in vitro de germoplasma, a caracterização da variabi- lidade genética por meio de marcadores moleculares, a seleção assistida por marcadores, a genômica e proteômica, o sequenciamento genético, a genética de populações e à dinâmica da movimentação de alelos. Vários projetos de pesquisa se encontram em andamento destacando-se aqueles relacionados com espécies nativas, tais como Euterpe edulis, Acca sello- wiana, Araucaria angustifolia, Bactris gasipaes, Bromélias, Lipia Alba e Dicksonia sellowiana. Espécies exóticas frutíferas também têm sido alvo de estudos e entre essas se destacam os projetos com Malus domestica, Prunus domestica e Vitis sp. As fontes financiadoras incluem agencias federais e internacionais de fomento a C&T, bem como a agencia estadu- al de SC (FAPESC) e empresas privadas, destacando-se o Projeto Geno- Malus conduzido em parceria com a Associação Brasileira de Produtores de Maçã (ABPM).

Entre em contato: Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Ciências Agrárias Rodovia Admar Gonzaga, 1623

Itacorubi, Florianópolis, SC

LAB. FISIOLOGI A DO DESENVOLVIMENTO E GENÉTICA VEGETAL

Tel: (48) 3331-5336 Fax: (48) 3331-5335

Email: lfdgv1@gmail.com

Estamos na Web!

www.cca.ufsc.br/lfdgv

comentários (0)
Até o momento nenhum comentário
Seja o primeiro a comentar!
Esta é apenas uma pré-visualização
Consulte e baixe o documento completo
Docsity is not optimized for the browser you're using. In order to have a better experience we suggest you to use Internet Explorer 9+, Chrome, Firefox or Safari! Download Google Chrome