Disserta, Teses de Agroflorestal. Centro Federal de Educação Tecnológica Celso Suckow da Fonseca (CEFET/RJ)
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marciel_rodrigues25 de Julho de 2015

Disserta, Teses de Agroflorestal. Centro Federal de Educação Tecnológica Celso Suckow da Fonseca (CEFET/RJ)

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Inflorecencias parasitas
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO – UFOP

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS – ICEB

DEPARTAMENTO BIODIVERSIDADE, EVOLUÇÃO E MEIO AMBIENTE – DEBIO

LUANA DA SILVA FREITAS

INFLORESCÊNCIAS DA HOLOPARASITA DE RAÍZES LANGSDORFFIA

HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO CHAVE PARA UMA

FAUNA GENERALISTA NA ESTAÇÃO SECA

OURO PRETO – MINAS GERAIS

2012

Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

F866i Freitas, Luana da Silva.

Inflorescências da holoparasita de raízes Langsdorffia Hypogaea (Balanophoraceae) como recurso chave para uma fauna generalista na estação seca[manuscrito] / Luana da Silva Freitas - 2012.

68f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas. Orientador: Prof. Dr. Sérvio Pontes Ribeiro. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Departamento de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente. Programa de Pós-Graduação em Ecologia de

Biomas Tropicais. Área de concentração: Evolução e Funcionamento de Ecossistemas.

1. Ecossistemas montanos- Teses. 2. Estratégias reprodutivas - Teses. 3. Morfologia vegetal - Teses. 4. Predação (Biologia) - Teses. 5. Formiga - Brachymyrmex sp - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 574.4:581.4

LUANA DA SILVA FREITAS

INFLORESCÊNCIAS DA HOLOPARASITA DE RAÍZES LANGSDORFFIA

HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO CHAVE PARA UMA

FAUNA GENERALISTA ASSOCIADA À ESTAÇÃO SECA.

Dissertação apresentada ao Colegiado do Programa de Pós Graduação em Ecologia

de Biomas Tropicais da Universidade Federal de Ouro Preto como parte dos

requisitos para obtenção do título de Mestre em Ecologia de Biomas Tropicais

Banca Examinadora:

Orientador: Prof. Dr. Sérvio Pontes Ribeiro Departamento de Evolução e Biodiversidade, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.

Profa. Dra. Ana Paula Fortuna Perez Departamento de Evolução e Biodiversidade, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.

Profa. Dra. Rosy Mary dos Santos Isaias Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica.

AGRADECIMENTOS

Muitas pessoas foram importantes colaboradoras e incentivadoras desse trabalho,

agradeço a todas elas e especialmente:

Ao meu pai, José de Freitas por facilitar meus campos com suas “engenhocas

científicas” e minha mãe Lourdes por manter a comida sempre fresquinha e

quentinha e compreender minha ausência à mesa.

Aos meus irmãos e em especial minha irmã por me ensinar tanto com seu amplo

conhecimento.

Aos meus bichos, Nina e Barriga por me aliviarem a tensão. Ao meu noivo e melhor amigo pela companhia na vida e no campo, sem se importar

com os hematófagos e as madrugadas “congelantes” de julho.

Ao meu orientador Prof. Dr. Sérvio Pontes Ribeiro pelos preciosos ensinamentos, na

ciência e na vida e por ter acreditado em mim. Obrigada pelos atendimentos aos

domingos de manhã e dia das mães (mesmo que relutante).

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Hildeberto Caldas de Sousa pelo apoio, incentivo e

pela amizade. Minha eterna gratidão e respeito.

Ao colaborador Prof. Dr. Leandro Márcio Moreira por participar desse trabalho

mesmo que diante de tantas dificuldades. Obrigada por não desistir e pelos

valiosíssimos ensinamentos aos quais pretendo dar continuidade.

Ao Prof.Dr. Diego Demarco pela receptividade e conhecimentos imensuráveis. Ao Eng. Florestal, amigo e mestre Alberto Vieira de Mello Matos (IEF/MG), por ser o

grande responsável por tudo isso e ter me mostrado “ o caminho das flores da terra”,

me acompanhando e incentivando desde o início.

Ao pesquisador Leandro Cardoso, pelos esclarecimentos sobre essa planta

fantástica e misteriosa.

Às minhas ajudantes de campo Érica Felestrino, Eliane Rangel, Thaís Rosada e à

Carolina Morais pelas “missões impossíveis”.

Aos professores e pesquisadores Dr. Leonardo Galetto (Universidad Nacional de

Córdoba), Dr. Gianfranco Curletti (Museo Civico di Storia Naturale, Italy), Dr. Paolo

Audísio (Sapienza Universitá di Roma, Italy), Dra. Renata Guerra (LBBM/UFOP), Dr.

Gregório Ceccantini, (USP), Dr. Udson Santos (UFOP), Dr. Rubem Ávila

(Unipampa), Msc. Leandro Scoss, Msc Flávio Siqueira, Ivan Fiorini, Msc. Roberth

Fagundes pela Identificação dos insetos, disponibilização de materiais e ricas

discussões.

A todos do Laboratório de Ecologia Evolutiva de Insetos de Dossel (onde fiz grandes

amizades) e Sucessão Natural e do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular

pelo apoio e descontração, em especial Karina Barbosa, Roberta Versiani, Isabel

Braga, Cíntia Monteiro, Walmir Silva e Vítor Fernandes amei conviver com vocês.

Ao secretário Rubens, o melhor de todos, obrigada pela ajuda e compreensão.

Aos meus queridos amigos “bambas”, por me tornarem uma pessoa mais feliz.

À Fapemig pela concessão de bolsa de mestrado.

Ao Programa de Pós Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais da Universidade

Federal de Ouro Preto.

LISTA DE FIGURAS

Fig.1. Mapa de distribuição da família Balanophoraceae no mundo ............................. 10

Fig.2. Morfologia externa de um indivíduo de Langsdorffia hypogaea

MART.......................................... 20

Fig.3.Distribuição espacial dos agrupamentos de L. hypogaea em sua área de

ocorrência no Parque Estadual do Itacolomi ................................................................. 22

Fig.4. Aspecto de um agrupamento de inflorescências femininas de L.hypogaea.... 23

Fig.5. Aspecto das estruturas reprodutivas de L.hypogaea ........................................... 28

Fig.6. Microscopia eletrônica de varredura das flores de L.hypogaea ........................... 29

Fig.7. Época de pluviosidade nos anos de estudo e sua correlação positiva com a

fenofase botão de L. hypogaea nos anos de 2010 e 2011. Época de ocorrência do

período reprodutivo da planta e da fenofase botão em 2010 e 2011 ... 30

Fig. 8. Número de indivíduos nas fenofases floração de L.hypogaea, frutos imaturos

e frutos maduros em 2010 e 2011, com seus respectivos picos de atividade e

época de duração .......................................................................................................... 32

Fig.9. Região vegetativa subterrânea de L.hypogaea, senescente no período de

pós-reprodução em 2010 .............................................................................................. 34

Fig. 10. Visitas às inflorescências de L.hypogaea nos períodos noturno e diurno

pelas principais ordens de artrópodes ocorrentes nas inflorescências da

planta............................... 39

Fig.11. Aspectos de predação às inflorescências de L. hypogaea ................................ 40

Fig.12. Corte longitudinal de um fruto múltiplo de L.hypogaea mostrando as regiões

utilizadas para a extração do DNA genômico ............................................................... 60

Fig.13. Aspecto do produto final de extração do DNA (pelete) de L. hypogaea

retirado de brácteas, escapo e eixo da inflorescência ................................................... 62

Fig. 14. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio

caracterizando a obtenção do DNA genômico extraído de 3g de tecido de

L.hypogaea retirado de amostras necrosadas com o uso de CTAB 7% e CTAB

2%.Produto final de PCR-RAPD realizado a partir de tecidos frescos com o

oligonucleotídeo S118.................. 63

Fig. 15. Dendrograma de similaridade genética baseado no critério UPGMA ............... 67

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Animais visitantes das inflorescências de Langsdorffia hypogaea, número de visitas por maior taxa, porcentagem de flores visitadas por menor taxa e

recursos consumidos ...................................................................................................... 37

Tabela 2. Identificação dos oligonucleotídeos RAPD testados para o estudo de L. hypogaea, suas respectivas sequências de nucleotídeos e o polimorfismo expresso por cada um deles........................................................................................................... 66

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................... 7

1.1. O HÁBITO PARASÍTICO ................................................................................. 7

1.2. FAMÍLIA BALANOPHORACEAE ..................................................................... 9

1.3. FAUNA VISITANTE ....................................................................................... 11

2. CAPÍTULO 1: INFLORESCÊNCIAS DA HOLOPARASITA DE RAIZES

LANGSDORFFIA HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO CHAVE

PARA UMA FAUNA GENERALISTA ASSOCIADA À ESTAÇÃO SECA .................. 13

2.1. NTRODUÇÃO .............................................................................................. 18

2.2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 19

2.2.1. ANISMO DO ESTUDO ............................................................................... 19

2.2.2. AL DO ESTUDO E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................ 20

2.2.3. MORFOLOGIA FLORAL ............................................................................ 23

2.2.4. FENOLOGIA REPRODUTIVA .................................................................... 24

2.2.5. VISITANTES FLORAIS .............................................................................. 25

2.3. ESULTADOS ................................................................................................. 26

2.3.1. MORFOLOGIA FLORAL ............................................................................ 26

2.3.2. FENOLOGIA REPRODUTIVA .................................................................... 29

2.3.3.VISITANTES FLORAIS ................................................................................ 34

2.4. DISCUSSÃO ................................................................................................... 40

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 44

4. APÊNDICE ........................................................................................................... 51

7 1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1. HÁBITO PARASÍTICO

A maioria das angiospermas conhecidas é autotrófica. No entanto, existe um

número significante de plantas parasitas que adotam o heterotrofismo total ou

parcial, buscando suas fontes de carbono, nutrientes e água em outros organismos

(Nickrent, 2002). Algumas plantas parasitas são adaptadas a viverem em ambientes

perturbados por atividades antrópicas, geralmente são habitat-específicas,

dependentes da comunidade ecológica onde suas hospedeiras estão inseridas

(Musselman & Mann, 1977; Nickrent, 2002; Watson et al, 2007). A interação planta-

planta pode ocorrer nas partes aéreas, como é o caso da família Loranthaceae ou

de forma subterrânea, através das raízes, como as Balanophoraceae.

De acordo com seus padrões nutricionais, essas plantas podem ser

classificadas em duas categorias, hemiparasitas e holoparasitas. As hemiparasitas

são clorofiladas e fotossintéticas durante parte de seu ciclo de vida, sendo o

fenômeno presente em Lorantaceae, Opiliaceae, Santalaceae e Scrophulariaceae.

As holoparasitas são totalmente aclorofiladas e, portanto, não fotossintéticas. Obtêm

água e nutrientes através do xilema e floema de plantas hospedeiras, algumas delas

parasitando raízes (Nickrent, 2002). O holoparasitismo ocorre em Balanophoraceae,

Cynomoriaceae, Hydnoraceae, Rafflesiaceae, Cuscutaceae, Lennoaceae e

Orobanchaceae, sendo apenas Cynomoriaceae, Hydnoraceae, Lennoaceae e

Balanophoraceae, parasitas de raízes (Nickrent, 2002). Através de fixação via

haustório, as parasitas retiram nutrientes e água da hospedeira célula a célula,

conectado ao xilema por haustórios. (Nickrent, 2002). Os haustórios são uma

8

espécie de raíz modificada que promove o contato morfológico e fisiológico entre a

planta e seu hospedeiro (Kuijt, 1969).

Embora a maioria das plantas parasitas cresça na parte exterior da

hospedeira, existem algumas espécies que possuem o hábito endoparasítico, cujos

tecidos são praticamente incorporados aos da hospedeira (Kuijt, 1969), só

possuindo as estruturas reprodutivas livres, como é o caso do gênero Pilostyles

(Apodanthaceae).

Segundo Ejeta (2005), essa peculiaridade é determinada pela forma com a

qual essas plantas interagem com suas hospedeiras, fator que as tornam muitas

vezes importantes agentes patogênicos no setor agrícola de alguns países. O

parasitismo pode ter um efeito que leva desde o enfraquecimento do hospedeiro,

causando prejuízos no seu investimento em biomassa e estruturas reprodutivas, até

sua morte. Um conhecido exemplo é o gênero Striga (Orobanchaceae), uma erva

holoparasita de raízes que ataca plantações em muitas regiões da África, parte da

Ásia e Estados Unidos, tendo com principais hospedeiros, dentre outras culturas, o

milho (Zea mays L.), sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) e o arroz (Oryza sativa L.)

(Dörr, 1997). Uma das maiores dificuldades em se combater essa planta está em

seu hábito hipógeo, que permite que sua identificação somente ocorra quando o

parasitismo já está intimamente estabelecido (Ejeta et al., 1991; Ejeta, 2005), ou

seja, na época reprodutiva, quando as flores podem ser visualizadas.

Estudos fisiológicos e bioquímicos têm sido realizados no intuito de melhorar

o entendimento sobre estas interações. Um caso bastante discutido é o strigol, um

composto químico liberado pelas plantas hospedeiras que induz a germinação das

sementes parasitas e a posterior formação dos haustórios, que por sua vez surgem

após receptarem um segundo sinal (Ejeta, 2005). Estudos realizados com

9

Scrophulariaceae (Estabrook e Yoder, 1998; Yoder, 1999; Yoder, 2001) mostraram

que esses sinais são flavonóides e outros compostos fenólicos, tais como gás

etileno, e que dentro de cerca de 24 horas após captar essa substância, já é

possível visualizar o crescimento do tecido haustorial parasítico. Esse

comportamento de germinação e formação de haustório após contato com a

rizosfera da hospedeira também foi observado por Govindappa e Shivamurthy

(1976) para Balanophora abbreviata Blume. Entretanto, a maioria dos mecanismos

de contato, crescimento e escolha de hospedeiro é completamente desconhecida.

De fato, para holoparasitas subterrâneas, devido à dificuldade de acesso, até

mesmo o entendimento básico sobre arquitetura e estrutura populacional é escasso

ou inexistente.

1.2. FAMÍLIA BALANOPHORACEAE

Balanophoraceae é uma família de angiospermas constituída por espécies

herbáceas, dióicas, raramente monóicas, aclorofiladas e holoparasitas de raízes. Os

indivíduos são formados basicamente por um rizoma subterrâneo dotado de

haustórios responsáveis pelo parasitismo e inflorescências carnosas, unissexuais ou

hermafroditas circundadas por folhas modificadas em brácteas (Falcão, 1975), de

aspecto coriáceo, que assim como o rizoma, são desprovidas de clorofila e

estômatos (Kuijt e Dong, 1990).

A família possui distribuição quase exclusivamente tropical (Fig. 1), com

casos raros nas regiões subtropicais e temperadas, e é representada por 18 gêneros

e 44 espécies (Hansen, 1980). No Brasil, são descritos seis gêneros: Helosis,

Scybalium, Lophophytum, Lathrophytum, Ombrophytum e Langsdorffia e as

11

seguintes espécies: Helosis cayennensis var. cayennensis (Swartz) Sprengel,

Helosis cayennensis var. mexicana (Liebm.) B. Hansen, Lophophytum leandri

Eichl., Lophophytum mirabile subsp. Mirabile Schott & Endl. e Langsdorffia hypogaea

Mart. (Falcão 1975; Hansen, 1980), Scybalium fungiforme Schott & Endl. e

Langsdorffia heterotepala (para a região fluminense do Rio de Janeiro - Cardoso et

al. 2011). Existe uma grande carência de informação sobre a área de distribuição

destes taxa devida a pouca coleta e identificação incorreta de algumas coleções.

Figura 1 – Mapa de distribuição da família Balanophoraceae no mundo. Fonte:

www.parasiticplant.siu.edu

Diferentemente dos gêneros Helosis (Hsiao et al 1993), Ombrophytum

(Mauseth et al,1992) e Dactylanthus (Moore 1940), o padrão haustorial de

Langsdorffia hypogaea é complexo, sendo essa interface parasita/hospedeira

constituída de dois tipos de organização (Hsiao et al, 1994): uma simples e limitada,

formada apenas pelos feixes de L. hypogaea e uma composta, formada por uma

íntima ligação entre os tecidos vasculares da planta hospedeira e da parasita,

aspecto denominado quimeral. Segundo Hsiao et al. (1994), essa característica

10

representa uma vantagem adaptativa em relação à estrutura simples, por aumentar

a habilidade da parasita na translocação de nutrientes para si. Outro aspecto

importante da espécie é o fato do parasitismo ocorrer através da penetração de

elementos traqueais da parasita, onde não há contato direto entre os vasos do

xilema de ambas (Hsiao et al. 1993; Mauseth et al. 1992).

1.3. FAUNA VISITANTE

A fauna edáfica associada a raízes de plantas parasitas, no geral formigas e

besouros, é considerável, mas estas interações são parcialmente estudadas, sendo

a maioria dos estudos descritivos e qualitativos. O coleoptera Hydnorobius hydnorae

(Belidae) tem sido registrado em plantas de Hydnoraceae (Marvaldi, 2005), já

Alloxycorynus bruchi Heller foi coletada em flores de Ombrophytum

(Balanophoraceae) e dois exemplares do gênero Oxycorynus (Belidae), foram

coletados em Lophophytum, pertencente à mesma família. Um novo gênero de

Curculionidae, nomeado como Balanophorobius, foi descrito por Anderson (2005)

como parasita de outra espécie de Balanophoraceae, que o autor sugere ser Helosis

cayennensis. A espécie holoparasita de raízes Cytinus hypocistis (Cytinacae), foi

documentada por de Vega et al. (2009) como sendo polinizada por dez diferentes

espécies de formigas, uma de Halictidae (Hymenoptera), uma de Halictidae e uma

de díptera. A espécie indiana Balanophora abbreviata Blume, reportada por

Govindappa e Shivamurthy (1975) foi observada sendo visitada por abelhas da

espécie Apis floreaI enquanto as espécies Balanophora kuroiwai Makino e B.

tobiracola Makino são visitadas por formigas, baratas, mariposas e moscas,

(Kawakita e Kato, 2002). Na Costa Rica, as inflorescências dos gêneros Helosis e

12

Corinae servem de atrativos para moscas (Gómez, 1983) e no Brasil, a espécie

amazônica Lophophytum mirabile, polinizada por pequenos coleópteras, dentre eles,

duas espécies da família Nitidulidae, e pilhada por abelhas, como documentado por

Borchsenius e Olesen (1990).

O único mamífero registrado até o momento visitando espécies de

Balanophoraceae, foi o lêmure de Madagascar Propithecus diadema, que Irwin et al.

(2007) observaram forrageando Langsdorffia sp. e Cytinus sp. (Cytinaceae). Os

mesmos autores ainda relatam que esse comportamento de forrageio no chão

utilizando o olfato para localizar o alimento, é pouco comum dentre os primatas.

Outro relato foi feito por Ecroyd (1996), que descreve vários aspectos da ecologia de

Dactylanthus taylorii Hook.f. e sua polinização por morcegos e ratos.

12

2. CAPÍTULO 1: INFLORESCÊNCIAS DA HOLOPARASITA DE RAÍZES

LANGSDORFFIA HYPOGAEA (BALANOPHORACEAE) COMO RECURSO

CHAVE PARA UMA FAUNA GENERALISTA NA ESTAÇÃO SECA

LUANA DA S. FREITAS2; RUBEM S. ÁVILA3; DIEGO DEMARCO.4;

HILDEBERTO C SOUSA2 AND SÉRVIO P. RIBEIRO2

2 Departamento de Evolução e Biodiversidade, Instituto de Ciências Exatas e

Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Campus Morro do Cruzeiro s/n°

CEP 35400-000 Ouro Preto, Minas Gerais, Brasil.

3 Universidade Federal do Pampa, campus São Gabriel, Av. Antônio Trilha 1847.

CEP 97300-000. São Gabriel, RS.Brasil.

4. Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo,

Caixa Postal 11461, CEP. 05508-090, São Paulo, SP, Brasil.

O manuscrito foi submetido à Botanical Journal of the Linnean Society

14

RESUMO

Plantas que se reproduzem no período de baixa disponibilidade de recursos

são importantes para a manutenção temporal de polinizadores e herbívoros. Foi

testada a hipótese de que as inflorescências de Langsdorffia hypogaea são

recursos-chave para parte da fauna em florestas sazonais por surgirem na estação

seca e emitirem variados recursos em época de escassez. É esperada a existência

de mecanismos para minimizar a herbivoria e otimizar a polinização.

A reprodução da planta foi estudada em 2010 e 2011, em relação a sua

duração, padrão fenológico, sincronia populacional e correlação com a pluviosidade.

Baseado na morfologia floral e no comportamento dos animais visitantes procurou-

se averiguar a potencial síndrome de polinização e levantar indícios de possíveis

polinizadores e predadores. Após o término do período reprodutivo ocorrido em

2009 e 2010, os rizomas foram escavados para análise da estratégia reprodutiva

(monocarpia ou policarpia).

A floração é anual, de março a setembro, abrangendo todo o período de seca

e parte do chuvoso. Houve sincronia populacional na floração de 2011 e emissão de

botões em ambos os anos, sendo este correlacionado com a pluviosidade. A

mortalidade pós evento reprodutivo sugere monocarpia (N= 21). As inflorescências

são morfologicamente distintas, anteras com deiscência extrosa, estigma exposto

acima do perianto e ausência de síndromes de polinização. Foram observados 259

artrópodes visitantes, a maioria Hymenoptera/Formicidae (149 indivíduos, 17

espécies), oito espécies de Aranae e quatro de outros insetos. Uma espécie de

Coleoptera/Nitidulidae, o potencial polinizador, foi mais abundante (28% do total de

15

visitantes na fase adulta), representados por adultos e larvas e apenas 12,5% dos

agrupamentos de inflorescências chegaram à frutificação, em decorrência de

predações.

O alto investimento em reprodução atrai um grande número de herbívoros.

Em contrapartida, a planta intercala períodos de alta e baixa sincronia populacional e

oferta seus recursos reprodutivos no inverno, reduzindo a taxa de predação e

aumentando a efetividade da polinização. Adicionalmente, o recurso em pleno

período árido consiste de um recurso-chave ao atender as necessidades de uma

fauna variada, principalmente espécies generalistas e oportunistas.

PALAVRAS-CHAVE: Brachymyrmex sp.; ecossistemas montanos; estratégias

reprodutivas; morfologia floral; predação em massa; interação multitrófica.

16

ABSTRACT

Premise of the study: Plants that reproduce during periods of low resource

abundance support the temporal fauna. We tested the hypothesis that

Langsdorffia hypogaea inflorescences are key resources for part of the fauna in

seasonal forests due to their emergence in the dry season and varied resources.

Mechanisms to minimize herbivory and optimize pollination are expected.

Methods: We investigated the following reproductive traits in 2010 and 2011:

duration of reproductive events, phenological pattern, population synchrony and

correlation with rainfall. Based on floral morphology and analysis of flower visitors

we gathered evidence of some potential pollinator and predator species. Plants

were excavated for analysis of reproductive strategy (monocarpy or polycarpy).

Key results: Flowering is annual, from March to September, during dry and wet

seasons. Population synchrony present in the 2011 flowering event and bud

emergence in both years, the latter correlated with rainfall. Post-reproductive

death (N = 21) suggested monocarpy. The inflorescences are morphologically

different, anthers with extrorse dehiscence, stigma exposed above the perianth,

and absence of pollination syndromes. In total, 259 arthropods visited the plants,

mostly Hymenoptera/Formicidae (149 individuals, 17 species), eight species of

Aranae and four species of other insects. A species of Coleoptera/Nitidulidae, and

potential pollinator, was the most abundant (28% of total visitors), represented by

adults and larvae. In both years, only 12.5% of all patches fructified due to

predation.

Conclusions: The plant alternates periods of high and low population synchrony

and allocates its reproductive resources in winter to escape from predators

17

attracted by the large investment in reproduction that results in high resource

supply, while ensuring pollination and acting as a key resource in the system by

supporting a varied fauna. The beetle of the family Nitidulidae is a potential

pollinator of L. hypogaea.

Keywords: Brachymyrmex sp., phenology, floral morphology, high montane

seasonal forests, trophic guilds, mass predation.

18

2.1. INTRODUÇÃO

Estruturas florais elaboradas podem representar uma demanda evolutiva

conflituosa entre custos e benefícios para a planta, pois enquanto aumentam a

eficiência da polinização, atraem animais herbívoros (Shaanker & Ganeshaiah,

1988). Algumas plantas conseguem driblar esse efeito antagônico através do saciar

do predador, primeiro descrito por Janzen (1976) para o bambu Phyllostachys

bambusoides Siebold & Zucc. A produção massiva e sincronizada de sementes

dentro da população sacia os herbívoros predadores, fazendo com que parte desse

banco de sementes seja poupada para a perpetuação da população (Crawley,

1997).

Durante a estação seca, momento em que há baixa atividade fotossintética

média em florestas estacionais alto montanas, a holoparasita Langsdorffia hypogaea

Mart. (Balanophoraceae) se reproduz, lançando uma quantidade significativa de

recursos próximos ao solo, podendo representar um recurso-chave para alguns

representantes da fauna. Além disso, quando a fenologia de uma planta é ajustada

de forma que o recurso seja previsível no tempo, especialmente em momentos de

escassez, a importância do produtor para a fauna daquele ambiente é ainda maior

(Develey & Peres, 2000; Barea & Watson, 2007). Entretanto, esta é exatamente uma

situação em que o benefício da polinização contrapõe aos custos da predação. No

caso, quando o recurso de maior interesse não é semente, mas frutos e flores, a

possibilidade de escapar de toda uma guilda de predadores é mais difícil no tempo,

podendo resultar no espaço.

O entendimento desta relação evolutiva com a paisagem biótica carece do

entendimento básico sobre a biologia reprodutiva desta espécie. Assim, este

19

trabalho tem como objetivo apresentar a fenologia, morfologia floral e fauna

associada à L. hypogaea. Como a floração é sincronizada e ocorre na estação seca,

é relativamente fácil de ser encontrada por polinizadores. Por outro lado, espera-se

que exista alguma estratégia de variação espacial no surgimento das flores de um

ano para o outro, de forma a minimizar a previsibilidade das mesmas para seus

predadores. Foi testada a hipótese de que a planta representa um recurso-chave

para a fauna associada e é polinizada por formigas e besouros de solo, por ser uma

planta herbácea, hipógea e de flores diminutas.

2.2. MATERIAL E MÉTODOS2.2.1. ANISMO DO ESTUDO

A planta Langsdorffia hypogaea é uma das 44 espécies descritas de

Balanophoraceae, constituída por ervas dioicas, suculentas, aclorofiladas e

holoparasitas de raízes, geralmente de árvores. Para o Brasil, existem atualmente

seis espécies registradas (Falcão, 1975; Cardoso et al. 2011). Morfologicamente, L.

hypogaea se divide em duas regiões: um corpo vegetativo irregularmente cilíndrico,

alongado e hipógeo, de aspecto tomentoso e carnoso, denominado rizoma ou

tubérculo, a partir do qual surgem os tecidos responsáveis pelo parasitismo,

chamados haustórios (Hansen, 1980) e unidades reprodutivas, representadas por

inflorescências de eixo suculento e unissexuais, que irrompem dos escapos,

circundadas na base pela bainha de brácteas, sendo os frutos aquênios e diminutos

(Fig. 2). A morfologia floral de Balanophoraceae não é muito clara (Souza e Lorenzi,

2008, Eberwein et al., 2009). A espécie está restrita às regiões tropicas, em florestas

21

montanas e campos cerrados, com altitudes que variam de 400 a 3100m, onde foi

encontrada parasitando Geonoma sp., Iriartea sp., Mimosa sp., Byrsonima sp.,

Trichilia sp., Ficus sp. (Hansen, 1980), pertencentes a quatro famílias

filogeneticamente não relacionadas entre si.

2 cm

Figura 2 – Morfologia externa de um indivíduo de Langsdorffia hypogaea mostrando as

estruturas reprodutivas (setas pretas), o rizoma (setas cinzas) e raízes hospedeiras (setas brancas).

2.2.2. LOCAL DO ESTUDO E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O Parque Estadual do Itacolomi se situa entre os municípios de Ouro Preto e

Mariana – MG e ocupa uma área de aproximadamente 7.500 ha. A altitude média do

Parque é de 1.350 metros e o clima é do tipo Cwb, de acordo com a classificação de

20

Koppen, com duas estações bem definidas, uma seca e uma chuvosa, verões

suaves concentrando cerca de 90% da precipitação anual que varia de 1.100mm a

1.800mm e temperatura média anual de 17,4°C a 19,8°C (Gomes, 1998). A

composição florística nestas áreas possui variações, principalmente quanto à

altitude, disponibilidade de água e nível de interferência antrópica (Pedreira e Sousa,

2011).

A área amostral está localizada na microbacia do córrego do Manso e possui

uma vegetação secundária, caracterizada como Floresta Estacional Alto-Montana,

dotada de um solo frequentemente raso (Pedreira e Sousa, 2011) (Fig. 3). A

ocorrência da população de L. hypogaea foi registrada em duas áreas distantes 370

m uma da outra e localizadas a 1347m de altitude. A primeira área é em encosta

rasa e aberta com monodominância de Eremanthus erythroppapus (DC.) McLeish

(Asteraceae) (20°26' S e 43°30' W), distante 5 m de uma trilha. A segunda área é em

floresta mista secundária, mais abaixo na encosta, a quatro metros de uma estrada

(20°25' S e 43°30' W).

Por não ser possível distinguir visualmente os indivíduos de L.hypogaea pelo

fato da mesma ser hipógea, a nomenclatura utilizada para este estudo foi

agrupamento de inflorescências. Para individualizar os agrupamentos ou pseudo-

indivíduos, estabeleceu-se uma distância mínima de 20 cm entre a inflorescência da

borda e sua vizinha mais próxima (Fig. 3 e 4).

A fim de determinar o número de agrupamentos e a densidade destes, em

cada área foi feita uma minuciosa varredura ao longo de dois transectos de 1000x5

m, ambos paralelos e marginais aos acessos (estrada e trilha, respectivamente), já

que esta espécie ocorre frequentemente próxima aos acessos humanos. Nesta

varredura de 20.000 m², as florações surgiram nos mesmos locais nos anos de 2009

22

(observação prévia), 2010 e 2011. Para analisar o tipo de estratégia reprodutiva da

planta, 21 agrupamentos foram escavados e desenraizados, sendo que sete deles

se reproduziram em 2009 e o restante em 2010. Medidas de comprimento e número

de ramificações de cada rizoma foram coletadas.

D≥20 cm

Figura 3 – Distribuição espacial dos agrupamentos de L. hypogaea em sua área de ocorrência no Parque Estadual do Itacolomi. Cada círculo preto representa um agrupamento de inflorescências, e as mesmas são representadas pelos círculos vermelhos. As distâncias entre os agrupamentos são maiores ou iguais a 20 cm.

23

4 cm

Figura 4 – Agrupamento de inflorescências femininas de L.hypogaea.

2.2.3. MORFOLOGIA FLORAL

A morfologia das flores foi realizada em material fixado em FAA50 (Johansen,

1940) com o auxílio de microscópio estereoscópico e de microscópio eletrônico de

varredura. Para esta última análise, flores masculinas e femininas foram isoladas,

desidratadas em série etílica, secas pelo método de ponto crítico, montadas e

metalizadas com ouro. As observações e o registro de imagens foram efetuados em

microscópio eletrônico de varredura Zeiss DSM 940 a 10 kV com câmera digital

acoplada.

24

2.2.4. FENOLOGIA REPRODUTIVA

As observações fenológicas foram realizadas semanalmente, durante os anos

de 2010 e 2011, nas quais foram marcados 22 e 10 agrupamentos de

inflorescências respectivamente, num total de 109 inflorescências. Para averiguar a

ocorrência de apomixia (produção de sementes na ausência de fecundação) na

população, uma amostra de três agrupamentos femininos, num total de oito

inflorescências foi isolada de visitações, com sacos de nylon fino, desde o período

de botão até o final do estudo.

A duração de cada fenofase na população foi investigada e a classificação do

padrão fenológico encontrado seguiu a proposta de Newstron et al. (1994). Foram

analisadas: emissão de botões, floração, frutos imaturos e frutos maduros. O Índice

de atividade foi utilizado para estimar a sincronia, indicando a proporção de

indivíduos que manifestaram determinado evento fenológico ao mesmo tempo.

Assim, para valores inferiores a 20%, a população foi classificada como

assincrônica, 20 a 60% pouco sincrônica e para valores maiores que 60%, assume-

se que a população possua uma alta sincronia fenológica (Bencke and Morellato,

2002). Foram elaborados fenogramas englobando os meses reprodutivos, baseado

na porcentagem de indivíduos em cada fenofase por mês e ano. Os dados de

botões não visualizados foram estimados como dados perdidos a partir do cálculo da

mediana dos dias em que houve frutificação, acrescida da diferença entre número

de inflorescências e botões. Para verificar se houve correlação entre a fenologia e a

pluviosidade, foi feita uma correlação de Spearman (Zar, 1996), considerando como

25

variáveis a frequência de indivíduos manifestando determinada fenofase mensal e a

pluviosidade em ambos os anos do estudo.

2.2.5. VISITANTES FLORAIS

Os dados foram coletados durante quatro noites por dois observadores entre

19h00min e 07h00min e sete dias por um observador entre 07h00min e 19h00min

totalizando 180 horas de campo e 45 inflorescências analisadas, pertencentes a 15

agrupamentos populacionais. Foi utilizada uma lanterna com luz vermelha para

minimizar os impactos do efeito de iluminação nos visitantes noturnos, como

sugerido por Peitsch et al. (1992). Os animais que não puderam ser identificados no

campo foram coletados e encaminhados ao Laboratório de Ecologia Evolutiva de

Herbívoros de Dossel e Sucessão Natural da Universidade Federal de Ouro Preto,

no caso das formigas e Coleoptera, e para o Laboratório de Aracnologia do

Departamento de Zoologia da Universidade Federal de Minas Gerais, no caso das

aranhas. Após a identificação em nível de família, Coleoptera da família Nitidulidae e

larvas foram encaminhados para identificação na Sapienza Universitá di Roma,

Roma Italy. Para visualizar os Hemiptera, foi necessária a retirada da serapilheira

em torno do escapo. A condição para ser classificado como potencial polinizador foi

que a mesma morfoespécie visitasse ambos os sexos de flores, tocando as anteras

e estigmas sem destruir essas estruturas. Animais de maior ocorrência também

foram categorizados dessa forma através do percentual de ocorrência do evento de

visitação em relação ao total de visitantes e em relação ao percentual de flores

visitadas.

26

Para avaliar se houve diferença na quantidade de visitas em relação ao

período noturno e diurno foi utilizado o Teste U de Mann Whitney. Para analisar se

os principais grupos de visitantes responderam igualmente ao recurso, foi aplicado o

teste Qui-quadrado (Zar, 1996), utilizando a contagem de visitas destes animais. O

tipo de estrutura explorada pelos visitantes também foi registrado e quando possível,

os animais foram classificados em guildas tróficas. Para diferenciar predação por

mamíferos e insetos herbívoros, cinco inflorescências (três masculinas e duas

femininas) foram protegidas por grades de arame, por onde o acesso à

inflorescência foi limitado aos mamíferos.

2.3. ESULTADOS

2.3.1. MORFOLOGIA FLORAL

As inflorescências masculinas e femininas de L. hypogaea divergem em

vários aspectos. A inflorescência masculina é um racemo circundado por um anel de

brácteas presentes de forma uniforme em sua base (Fig. 5C) e espalhadas ao longo

de todo o escapo. As flores são pediceladas (Figs. 5C,6A,B), monoclamídeas,

dialitépalas, trímeras (eventualmente com duas ou quatro tépalas), com androceu

isostêmone, monadelfo (Figs. 5C, 6A –C). As anteras possuem deiscência extrorsa

(Fig.6C). As flores exalam um aroma adocicado e gotas de néctar foram observadas

na superfície de toda a inflorescência.

A inflorescência feminina se assemelha a uma espádice com um anel de

brácteas em sua base (Fig. 5B), no ápice de um escapo. Ambas as inflorescências

são congestas e possuem um eixo suculento, mas as flores femininas são sésseis,

27

monoclamídeas, gamotépalas, tubulares (Figs.6D,E), irregulares lobadas, com

gineceu sincárpico. Observa-se um único estilete e estigma filiforme (Fig. 6F) que se

projeta acima do tubo do perianto (Fig.6D). Essas flores também exalam um aroma

adocicado, mas o néctar foi observado apenas na base da inflorescência, sobre as

brácteas (Fig. 5F).

O fruto múltiplo imaturo possui uma morfologia externa semelhante à

inflorescência. Os aquênios, de coloração avermelhada, ficam fixos ao eixo (Fig.5D),

até o completo amadurecimento (Fig. 5E).

28

1 cm 1 cm 1 cm

1 cm 1 cm

Figura 5 - Aspecto das estruturas reprodutivas de L.hypogaea A - F. A. Botão da inflorescência com brácteas coriáceas e tricomas nas bordas. B. Inflorescências femininas. C. Inflorescência masculina. D. Fruto múltiplo imaturo. (Fotos: L. Freitas, 2010). E. Aquênio. (Foto: L. Cardoso). F. Néctar (setas pretas) produzido pela inflorescência feminina (Foto: L. Freitas, 2010).

29

Figura 6 - Microscopia eletrônica de varredura das flores de L.hypogaea. A-C. Flores masculinas dialitépalas pediceladas. A. Flor trímera. B. Flor com duas tépalas. C. Detalhe das três anteras livres entre si abertas. D-F. Flores femininas gamotépalas tubulares. E. Detalhe da base das flores sésseis .F. Detalhe do estigma (Fotos: D.Demarco, 2011).

2.3.2. FENOLOGIA REPRODUTIVA

A razão sexual encontrada nos agrupamentos de inflorescências foi de 15

inflorescências femininas para sete masculinas (2:1) em 2010 e cinco inflorescências

femininas para cinco masculinas (1:1) em 2011. O padrão de floração da planta foi

do tipo anual, com duração de sete meses. A época reprodutiva coincidiu com o fim

da época chuvosa, se estendeu por toda a seca e finalizou com o início das chuvas,

compreendendo o final do mês de março até o final de setembro, em um total de 210

dias. Não houve registros de apomixia. No ano de 2010, a fenofase botão (Fig.5A)

31

P lu

vi o

si d

ad e

(m m

)

M ar

-1 0

A p

r- 1

0

M ay

-1 0

Ju n

-1 0

Ju l-

1 0

A u

g- 10

Se p

-1 0

O ct

-1 0

N o

v- 10

D e

c- 10

Ja n

-1 1

Fe b

-1 1

M ar

-1 1

A p

r- 11

M ay

-1 1

Ju n

-1 1

Ju l-

1 1

A u

g- 11

Se p

-1 1

B o

tõ e

s (%

)

teve duração de 38 dias, iniciando em março e finalizando em maio com um total de

73 botões (N=22 agrupamentos, média de 4,3 botões por agrupamento, DP = 4,2)

com pico de atividade em abril e alta sincronia em 2010 (63,6%) e em 2011(60%) na

população. O coeficiente de Spearman mostrou que a fenofase botão apresentou

correlação positiva e significativa com a pluviosidade (rs=0,77; P=0,044) em 2010 e

2011 (rs=0,76; P=0.046)(Fig.7).

250.0

200.0

150.0

100.0

50.0

0.0

80

70

60

50

40 Botões

30 Pluviosidade

20

10

0

Figura 7 - Época de pluviosidade nos anos de estudo e sua correlação positiva com a fenofase botão de L. hypogaea nos anos de 2010 (rs=0,77; P=0,044) e 2011 (rs=0,76; P=0.046) (Correlação de Spearman). Época de ocorrência do período reprodutivo da planta e da fenofase botão (N=22) em 2010 e (N=10) em 2011.

No mês de março de 2010, quando 25% dos indivíduos observados

apresentavam 30 botões florais (N=4 agrupamentos, média de 7,5 botões por

agrupamento, DP=6,5), foi registrada a primeira floração, sendo que em 35 dias,

58% dos agrupamentos estavam no momento de pico da fenofase (N=11 plantas) e

no final de maio, todos (N=73 inflorescências) já haviam florido (N=19

agrupamentos, média por agrupamento=3,8, DP=3,0) (Fig.8). Em 2011, os botões

florais (N=19) ocorreram nos meses de março e abril (N=7 agrupamentos, média de

30

4,7 botões por agrupamento, DP=4,1) e seu pico de atividade registrado neste último

mês (N=6 agrupamentos, média de 4,3 botões por agrupamento, DP=4,9) em 13

botões (Fig. 7).

O surgimento das primeiras 14 inflorescências em 2011 ocorreu no mês de

abril, mesma época em que sua máxima atividade foi registrada. (N=6

agrupamentos, média de 2,3 inflorescências por agrupamento, DP=1,9) e após 29

dias, em maio, essa fenofase terminou, totalizando 19 inflorescências (N=7

agrupamentos, média de 2,7 inflorescências por agrupamento, DP=2,0) (Fig.8). A

fenofase de inflorescência não apresentou correlação com a pluviosidade

(correlação de Spearman rs=0,65; P=0,114) para o ano de 2010 ou 2011 (rs=0.49;

P=0,259), com baixa sincronia populacional (57,9%) em 2010 e alta sincronia

(85,8%) no ano seguinte.

No ano de 2010, no mês de maio, enquanto ainda ocorria floração, as

primeiras frutificações foram registradas em sete agrupamentos e 60 dias depois,

estavam maduros. A frutificação imatura teve seu pico de atividade em junho,

quando foram observados ao todo 54 frutos múltiplos (N= 16 agrupamentos, média

de 3,3 frutos múltiplos por agrupamento, DP = 2,0) ao longo então de 36 dias (Fig.8).

Nesse primeiro ano do estudo, a população mostrou baixa sincronia (56,2%) e não

apresentou correlação significativa com a pluviosidade (correlação de Spearman rs=

0.17; P=0,072), sendo que no pico de frutificação, 26% dos agrupamentos já haviam

tido seus frutos totalmente dispersos ou predados e sete dias após o registro do

mesmo, seis agrupamentos com 17 frutos múltiplos, ou seja, 89% desapareceram,

causando um brusco decréscimo na população.

32

N ú

m er

o d

e a

gr u

p am

e n

to s

m ar

ap r

m ay

ju n

ju l

au g

se p

m ar

ap r

m ay

ju n

ju l

au g

se p

No ano seguinte não foi possível avaliar sincronização desta fenofase, pois

das 19 inflorescências geradas apenas uma frutificou, sendo que demais foram

predadas.

A ocorrência de frutos imaturos (Fig. 5D) perdurou 36 dias, até final de junho,

com o surgimento de frutos maduros no mês seguinte (Fig. 8). Em 2011, o

amadurecimento foi registrado em setembro. Esta fenofase não pôde ser

correlacionada de forma robusta com pluviosidade, devido ao número extremamente

pequeno de indivíduos que chegaram a produzir frutos maduro (Fig. 5E).

Nominalmente, para 2010 tivemos três indivíduos nos meses de julho (n=1) e

setembro (n=2), e apenas um em 2011, em setembro. No entanto, devido ao período

de floração sempre começando no início da seca e ao tempo de desenvolvimento da

fase reprodutiva, invariavelmente os frutos maduros surgiram ainda em meses

secos.

12

10

8

6 Inflorescências

Frutos múltiplos imaturos 4

Frutos múltiplos maduros

2

0

2010 2011

Figura 8 - Número de indivíduos nas fenofases floração de L.hypogaea em 2010 (N= 19) e 2011 (N=7), frutos imaturos em 2010 (N=16) e 2011 (N=1) e frutos maduros em 2010 (N=3) e em 2011 (N=1), com seus respectivos picos de atividade e época de duração.

33

Em média, após o amadurecimento, os frutos compostos levaram 22 dias

para serem dispersos ou predados. Após o primeiro fruto amadurecer em um

agrupamento, leva em média 26 dias até que todos tivessem se dispersado, quando

caem ao solo, agregados uns aos outros, por gravidade ou atividade de insetos

atraídos pelo eixo suculento, e 228 dias desde a primeira inflorescência surgir. Este

valor foi estimado para 2010 que teve um número substancial de frutos. Um

fenômeno importante segue-se ao desaparecimento do fruto, que é a aparente

morte do próprio indivíduo, o que nos faz sugerir pela primeira vez que esta espécie

seja monocárpica.

Os rizomas dos 21 agrupamentos escavados apresentaram uma média de

11,8 cm de comprimento e cinco ramificações e todos estavam em estado de

decomposição, que era mais ou menos avançado de acordo com a época em que

ocorreu a reprodução. A epiderme desta região apresentava-se levemente

acinzentada e nas plantas que se reproduziram em 2009, foram observados pontos

de necrose. Em relação à morfologia, em todas as plantas, tanto a epiderme quanto

os pêlos que a reveste estavam intactos. As ramificações das plantas que se

reproduziram em 2009 estavam quebradiças, fator que dificultou a escavação, no

entanto, naquelas cuja reprodução foi mais recente, 2010, a arquitetura foi mantida

na maioria das coletas.

A região interna dos rizomas encontrava-se escurecida, em estágio de

apodrecimento. Não foram encontrados vestígios de ataques por parasitas nestes

tecidos. Além da região vegetativa, em boa parte dos casos, o escapo com as

brácteas das inflorescências permaneceram anexados aos rizomas, fator que

facilitou a localização exata dos indivíduos no campo. Em 11 indivíduos que se

34

reproduziram em 2010 foram encontradas raízes de hospedeiras em estágio de

decomposição e soltas da planta de origem, acopladas à L. hypogaea (Fig. 9).

Figura 9 - Região vegetativa subterrânea de L.hypogaea, senescente no período de pós- reprodução em 2010, mostrando a epiderme intacta, brácteas e escapos vestigiais (setas brancas) e raízes mortas das hospedeiras (setas pretas).

2.3.3. VISITANTES FLORAIS

As inflorescências de L. hypogaea foram visitadas por 259 artrópodes ao

todo, representantes das ordens Hymenoptera, Hemiptera, Dermaptera, Blattodea,

Araneae e Coleoptera. Além disto, indícios encontrados nas plantas (marcas de

dentes e demais aspectos do forrageio) sugerem visitação por pequenos mamíferos.

Foram identificadas 17 espécies de formigas pertencentes às subfamílias

35

Myrmicinae, Formicinae, Dolichoderinae e Ponerinae. Além destes, também foi

observada uma espécie da ordem Blattodea e uma espécie da ordem Hemiptera,

uma espécie da ordem Dermaptera e uma morfoespécie do gênero Stelidota,

(Nitidulidae), o qual foi o invertebrado mais dominante no sistema (veja abaixo).

Afora insetos, oito espécies da ordem Araneae pertencentes às famílias Salticidae,

Theridiidae, Lycosidae, Gnaphosidae, Thomisidae e Linyphiidae (Tabela 1).

O grupo taxonômico mais frequente foi Formicidae, com 149 indivíduos

observados (57% do total de indivíduos observados; três formigas por inflorescência

monitorada). A quantidade de ocorrências de formigas nas inflorescências não foi

significativamente diferente em relação aos turnos diurno e noturno (Mann Whitney Z

= 1,88; P = 0,058) (Fig. 10A). As espécies de formigas foram observadas utilizando

fontes de açúcar (exsudato de hemíptera e néctar), cortando tecidos e eixo floral ou

predando outras formigas (Tabela 1). Apesar de estes insetos terem visitado uma

grande quantidade de flores de ambos os sexos, estes não foram visualizados

tocando o estigma, e assim desconsideramos a possibilidade de atuação como

agentes polinizadores da planta.

O gênero de Nitidulidae, Stelidota sp. (Coleoptera) observada foi a mais

abundante (73 indivíduos –28% do total de visitantes), com maior ocorrência à noite

(Mann Whitney Z = -2.07; P = 0,037. Estes insetos foram observados forrageando o

néctar e em 13,7% das ocorrências foi registrado o comportamento de cópula,

seguido pela perfuração das flores até atingir o eixo da inflorescência, onde ocorria a

ovoposição. Em uma coleta complementar de 13 inflorescências, foram encontradas

68 larvas se alimentando do escapo e eixo dessa estrutura. Além de terem feito

visitas nos períodos diurno e noturno (Fig.10B), sendo este último na época de

produção de néctar, aroma e antese masculina (in prepp.), tocavam as partes

36

reprodutivas das flores masculinas, carregando grãos de pólen durante a coleta de

néctar, e das flores femininas durante a cópula, além de terem visitado 55% das

inflorescências amostradas (N= 25).

As aranhas observadas utilizavam as inflorescências de L. hypogaea como

sítios de forrageamento para captura de presas. Para esses animais também não foi

observada diferença significativa nas visitas em relação aos períodos noturnos e

diurnos (Mann Whitney Z=1,79; P=0,072) (Fig. 10C). Foram registrados dois

indivíduos da ordem Dermaptera, que também utilizavam as inflorescências para

forragear presas durante o dia. As cochonilhas foram encontradas em 4% dos

eventos e duas morfoespécies de baratas não identificadas foram observadas

coletando néctar durante o dia. A análise de Qui-quadrado mostrou uma co-

ocorrência entre os grupos de maior visitação, Nitidulidae e Formicidae no período

noturno (X²=3,345; df=3; P>0,05) ou diurno (X²=4,033; df=6;P>0,05).

37

Tabela 1 - Visitantes das inflorescências de 15 plantas de duas populações de Langsdorffia hypogaea, nos meses de março a setembro de 2010 e 2011. O número de visitações por maior taxa é apresentado bem como a porcentagem de flores visitadas por menor taxa e os recursos consumidos. Classe

Ordem

Família

Insecta

Hymenoptera

Espécies/menor taxa Nº de animais

/taxa

Nº de flores

visitadas /menor

taxa

Recurso

consumido

Formicidae 149

Acromyrmex sp. 11 Escapo flora, eixo

da inflorescência,

flores

Acromyrmex cf. subterraneus

Forel, 1893

1 Escapo flora, eixo

da inflorescência,

flores

Brachymyrmex heeri 4 Néctar

Brachymyrmex sp.1 17 Néctar

Brachymyrmex sp.2 2 Néctar

Camponotus melanoticus

Emery, 1894

4 Néctar

Crematogaster sp. 16 Hemiptera

Hypoponera sp. 2 Presas

Linepithema cf. pulex Wild,

2007

1 Néctar, Hemiptera

Linepithema sp.1 15 Néctar, Hemiptera

Pheidole cf. flavens Roger,

1863

4 Néctar

Coleoptera

Pheidole sp.1 2 Néctar

Pheidole sp.2 3 Néctar

Pheidole sp.3 4 Néctar

Pheidole sp.4 2 Néctar

Solenopsis sp. 2 Néctar

Wasmannia sp. 1 Hemiptera

Stelidota sp.(adultos) 73 55 Escapo flora, eixo

da inflorescência,

38

flores

Stelidota sp. (larvae) 68 13* Escapo flora, eixo

da inflorescência

Dermaptera 4

Dermaptera sp. 4,5 Formigas

Blattodea 4

Blattodea sp. 4,5 Néctar

Hemiptera 11

Hemiptera sp. 18 Seiva

Araneae

Arachnidae 17

Salticidae

Theridiidae

Lycosidae

Gnaphosidae

Salticidae sp. 1 Presas

Theridiidae sp. 1 Presas

Lycosidae sp. 3 Presas

Camillina sp. 1 Presas

Thomisidae

Eilica aff.modesta Keyserling,

1891

2 Presas

Linyphiidae

Thomisidae sp. 3 Presas

Sphecozone castanea 2 Presas

Linyphiidae sp. 3 Presas

Mammalia 11

72** Escapo flora, eixo

da inflorescência,

flores e rizoma

Notes: * Coleta complementar de inflorescências

** A visitação por mamíferos está relacionada ao número total de plantas (n=32) do estudo.

39

Figura 10 – Visitações às inflorescências de L.hypogaea nos períodos noturno e diurno. A-C

Principais ordens ocorrentes nas inflorescências da planta. A. Formicidae. B. Nitidulidae. C. Aranae. Mediana e percentis: 25% e 75%.

Em ambos os anos do trabalho, somente 12,5% dos 32 agrupamentos de L.

hypogaea observados completaram seu ciclo de vida em decorrência principalmente

de predação das inflorescências e dos frutos múltiplos imaturos. Indícios deixados

nas estruturas parcialmente predadas e no local, tais como marcas de dentes

(Fig.11B), apontaram para pequenos roedores ou marsupiais (L. Scoss; Pontífica

Universidade Católica, comunicação pessoal). Foram encontrados casos em que

animais se alimentaram somente do escapo, eixo da inflorescência e flores,

poupando brácteas e parte aérea do rizoma (Fig. 11B), enquanto em outros casos,

além dessas estruturas, o animal escavou o solo superficial e se alimentou também

de parte do rizoma (Fig. 11C). Todas as cinco inflorescências engaioladas

apresentaram o padrão de forrageamento feito por formigas do gênero Acromyrmex

(Fig. 11A), que cortavam os pedicelos das flores masculinas e em seguida, o eixo da

inflorescência.

41

A B C

Figura 11 - Aspectos de predação às inflorescências de L. hypogaea. A – C. A. Flores e parte do eixo da inflorescência masculina cortados por formigas do gênero Acromyrmex. B. Inflorescência feminina possivelmente predada por um roedor, fato evidenciado pela marca de dentes (setas pretas). C. Predação de flores, escapo, eixo da inflorescência e parte do rizoma.

2.4. ISCUSSÃO

A reprodução das plantas é geralmente sincronizada para o melhor

aproveitamento da disponibilidade sazonal de polinizadores e dispersores e

influenciada por fatores climáticos (Janzen,1976; Howe & Westley,1997; Lambert et

al.,2010). O teste de correlação de Spearman mostrou que, com exceção à emissão

de botões, as fenofases perduraram por toda a seca, tornando o recurso flores

suculentas e frutos, disponível para atrair esses animais. Somente a emissão de

botões em ambos os anos e a floração em 2011 apresentaram alta sincronia

populacional, sugerindo que a vantagem adaptativa da sincronia parece ser

superada pela necessidade de minimizar a previsibilidade deste recurso para

predadores. Mais que sincronizada, a fenofase botão apresentou correlação positiva

40

com a pluviosidade, época em que o mesmo se desenvolve recoberto por brácteas

coriáceas de borda margeada por tricomas (Fig.5A), até que aconteça a floração no

início da seca. Isso pode representar uma demanda evolutiva conflitiva, já que a

planta parece necessitar de água para iniciar sua reprodução e na época das chuvas

a presença de predadores generalistas é maior. Ou seja, é possível que tenha

havido uma forte pressão seletiva na direção de brácteas coriáceas dotadas de

tricomas marginais, e um retardamento na época de abertura das mesmas, para que

este desenvolvimento precoce seja feito integralmente de forma protegida, com a

abertura dos botões ocorrendo apenas após o início da seca. Embora vários animais

ativos nesse período venham a usar a inflorescência, este dano é potencialmente

menor do que poderia ser caso ocorresse na época chuvosa.

Plantas que se reproduzem fora do pico reprodutivo da comunidade em que

estão inseridas são importantes para manutenção da fauna por desempenharem o

papel de recursos-chave (ou espécie-chave, sensu Terborgh, 1986a; Barea &

Watson, 2007). Esse trabalho mostrou que L. hypogaea assume um importante

papel ao sustentar uma cadeia trófica que se conecta em função de suas estruturas

reprodutivas, através da ocorrência concentrada de inflorescências de cor atrativa

em um mesmo espaço e tempo, com numerosas flores suculentas ricas em néctar e

produtoras de odores, seguidas da disponibilidade de frutos. Para muitos animais na

época de seca, estes recursos surgem em um momento em que a oferta de

nutrientes é pequena, e são suficientemente perenes para sustentar populações de

invertebrados pelo período mais seco e frio destas regiões montanas. A reprodução

da holoparasita se estendeu por todo o inverno, com picos de frutificação em junho e

julho, épocas mais extremas da estação. Durante sete meses por ano, as estruturas

florais foram exploradas no período noturno e diurno, por uma variada fauna da qual

42

29 espécies foram ao todo coletadas, enquanto buscavam nutrientes da planta,

sítios reprodutivos, local de nidificação e presas.

Entretanto, por serem recursos para uma fauna relativamente diversa e

abundante, as estruturas reprodutivas destas plantas estão inevitavelmente sob

risco. Uma estratégia evolutiva capaz de minimizar a ação de predação é a

síndrome do saciar do predador (Janzen, 1976). Esta estratégia pode explicar a

variação na sincronização da floração entre anos, e passa pelo escape de longo

prazo via alternância de fornecimento de recursos abundantes e previsíveis em um

ano, e dispersos e escassos no ano seguinte.

Em um ano, a grande quantidade de recursos disponibilizada ao mesmo

tempo pode saciar os herbívoros sem prejudicar a transferência efetiva do pólen ao

estigma (ou por mera probabilidade, garantir o escape de algumas sementes da

predação). No ano seguinte, a inesperada redução da quantidade de recurso

disponibilizado resultaria na súbita redução da capacidade de suporte para as

populações dos predadores e seu eventual colapso.

Embora não seja esperado que flores masculinas e femininas de uma mesma

espécie difiram em relação à fusão de tépalas e presença de pedicelo, esse é um

fato comum em Langsdorffia e diversas variações quanto ao perianto são

encontradas nos diferentes gêneros de Balanophoraceae (Eberwein, et al., 2009).

Por outro lado, a morfologia distinta dessas flores associada à grande proximidade

entre elas, gera uma superfície da inflorescência onde grãos de pólen e estigma são

encontrados em abundância. As flores masculinas dialitépalas mantêm as anteras

totalmente expostas com gotas de néctar em diversos locais, sugerindo um

polinizador generalista que forrageie a inflorescência como um todo. As flores

femininas são gamopétalas, mas apresentam o estigma exserto que, por ser

43

reduzido e as flores estarem muito próximas umas das outras, aumenta a área

receptiva da inflorescência como um todo, também sugerindo um polinizador

generalista. A presença de perfume noturno também indica a atração de

polinizadores que respondem a esse tipo de estímulo nesse período, tais como os

representantes das ordens Hymenoptera, Coleoptera e Blattodea aqui relacionados.

44

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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50

4. APÊNDICE A

EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO DA ESPÉCIE

LANGSDORFFIA HYPOGAEA MART. (BALANOPHORACEAE)

Freitas, L.S.¹; Ribeiro, S.P.¹; Moreira, L.M.²

1 – Programa de Pós-graduação em Ecologia de Biomas Tropicias, Departamento

de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente, Instituto de Ciências Exatas e

Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.

2 – Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas,

Universidade Federal de Ouro Preto.

O protocolo será submetido à American Journal of Botany

52

RESUMO

Uma população da holoparasita Langsdorffia hypogaea Mart. foi

analisada quanto a seus parâmetros genéticos. Para tal, o protocolo de

extração do DNA genômico foi otimizado às peculiaridades da planta, que não

possui folhas verdadeiras ou meristemas disponíveis, além de apresentar

uma grande quantidade de mucilagem e compostos secundários. Após esse

procedimento, o DNA extraído do escapo, brácteas e eixo floral de 26

inflorescências pertencentes a 17 agrupamentos ou (pseudoindivíduos) foi

avaliado a partir do uso de 12 oligonucleotídeos (primers) mediante técnica de

RAPD. Destes, sete foram testados pela primeira vez nesta família botânica,

ao passo que o restante foi previamente descrito como eficientes para outras

espécies da família Balanophoraceae. Dos oligonucleotídeos testados,

apenas cinco apresentaram bandas polimórficas passíveis de serem

analisadas, sendo que o S118 foi o mais eficiente para esta análise. De

acordo com os resultados encontrados, este oligonucleotídeo apresentou um

considerável potencial para a caracterização de diversidade desta espécie.

Com base nos polimorfismos gerados, foi construído um dendrograma

seguindo o critério UPGMA, que revelou uma maior diversidade genética

entre inflorescências do mesmo agrupamento do que entre inflorescências de

agrupamentos diferentes. Apesar de este padrão ser próprio de plantas com

reprodução cruzada, o que é o caso de L hypogaea, a escassez de

oligonucleotídeos, limitação no número de bandas obtidas e de amostras

pode ter induzido tal resultado.

53

INTRODUÇÃO

Existem atualmente diversas técnicas na área da biologia molecular que

possibilitam a detecção de variabilidade genética entre organismos ao nível de DNA

(Ferreira e Gratapaglia, 1996). Através do uso de marcadores de DNA é possível

analisar um elevado número de genótipos em um curto prazo e por um custo

relativamente baixo, com o benefício de não serem influenciados pelas condições

ambientais e podendo amostrar um alto grau de polimorfismo caso exista (Williams

et al.,1990)

Para a manipulação do DNA de qualquer organismo é necessário submetê-lo

a uma série de reações, afim de que o material genético extraído apresente

qualidade e quantidade satisfatórias para investigações moleculares. Entretanto,

algumas espécies de plantas apresentam características que podem dificultar o

procedimento de extração e amplificação, como a presença de mucilagens e

polifenóis, ou quando os tecidos disponíveis para o estudo se restringem aos de

proteção e sustentação, por serem geralmente rígidos e compactos, compostos por

células mortas, portanto, sem DNA.

Metabólitos secundários como os flavonóides, terpenóides e alcalóides, por

exemplo, são investimentos de proteção das plantas contra herbivoria, patógenos

(Herms & Mattson 1992, Meijden 1996) e radiação solar (Markhan et al.,1998). A

contaminação por esses compostos polifenólicos tornam o DNA escurecido

(Romano & Brasileiro,1999), alterando sua migração no gel bem como a interação

com proteínas, fundamental à realização de técnicas moleculares. Isso pode ser

facilmente detectado na amostra extraída, tornando necessário o uso de

54

procedimentos que isolem ou reduzam as concentrações dessas substâncias,

típicas das plantas nativas do cerrado e caatinga.

A técnica molecular chamada PCR (Polymerase Chain Reaction), ou reação

em cadeia da polimerase, é bastante robusta para este tipo de manejo e dentre suas

variações mais usadas estão o RAPD, VNTR e RFLP. A técnica de RAPD

(Randomly Amplified Polymorphic DNA), ou polimorfismo de DNA amplificado ao

acaso, possibilita amplificar regiões casuais do genoma do organismo, utilizando

oligonucleotídeos aleatórios e curtos que se anelam no DNA genômico em

diferentes regiões (Fungaro, 2001). A técnica utiliza apenas um oligonucleotídeo de

sequência aleatória, com 10 nucleotídeos, em contraste à clássica reação de PCR

que faz uso de um par de oligonucleotídeos.

Apesar de apresentar a desvantagem de ser pouco reprodutível e consistente,

a técnica de RAPD é recomendada para organismos dos quais não se possui

conhecimentos genéticos prévios (Lacerda et al., 2002), pois consegue mapear todo

o genoma, já que faz uso de oligonucleotídeos aleatórios. Além disso, possui um

custo relativamente reduzido, menor tempo de execução, menor número de etapas e

é menos complexa de se implementar (Schuster, 1965). A técnica de microssatélites

tem sido mais amplamente utilizada para estes fins em contraposição ao RAPD em

alguns aspectos, pois é altamente reprodutível, já que utiliza oligonucleotídeos

específicos. No entanto, para a obtenção dos mesmos, é necessário ter um

conhecimento prévio do genoma em questão que permita identificar as regiões com

sequências repetitivas (Schuster, 1965), o que não é concebível para a espécie em

estudo, já que esta é a primeira tentativa de estudos deste tipo para este modelo

vegetal.

55

Parte dos problemas de entendimento sobre as espécies de plantas da família

Balanophoraceae está na falta de dados sobre o tamanho populacional. De fato, há

pouca informação sobre a estrutura genética das manchas populacionais de

indivíduos normalmente encontradas em campo. Embora existam ferramentas mais

robustas para estudos de diversidade genética e outras pesquisas do gênero, até o

momento, nenhuma técnica molecular foi empregada para análise de diversidade de

L. hypogaea, não havendo, portanto, banco de dados moleculares disponíveis para

esta espécie. O banco de genes do NCBI (National Center of Biotechnology

Information) por exemplo, possui apenas duas sequências depositadas para a

espécie, uma sequência parcial do gene que codifica para o RNAr 18S (GenBank:

L25683.1) e uma sequência parcial para um gene que codifica para a subunidade

menor do RNAr mitocondrial (GenBank: U82654.1). Com base nesta falta de

conhecimento molecular em associação ao fato de que L. hypogaea é uma planta

cujo modelo de interação a seu hospedeiro é negligenciado por estudos, essa

investigação científica torna-se pertinente.

MATERIAL E MÉTODOS

AMOSTRAGEM

Para essa análise, foram coletadas 26 inflorescências pertencentes a 17

agrupamentos (Fig. 4). Quando possível, dado o pequeno número de inflorescências

disponíveis, coletou-se mais de uma amostra do mesmo agrupamento. Pelo fato de

ser hipógea e não possuir folhas verdadeiras ou meristemas acessíveis, os tecidos

utilizados foram o eixo da inflorescência, escapo e brácteas (Fig. 12). Sendo estes

56

dois últimos tecidos constituídos em grande parte por tecido morto e rígido, tornando

necessária a utilização de uma massa relativamente alta para que o isolamento de

DNA pudesse ser satisfatório.

Após testes preliminares utilizando massas distintas de amostras congeladas,

conservadas em álcool 70%, frescas e até mesmo em fase avançado de

decomposição (na carência de material fresco), estabeleceu-se o uso de

aproximadamente dois gramas de tecido fresco retirado do escapo, eixo floral (isento

de flores) e brácteas. O fator que nos levou a estes testes preliminares tem relação

direta com a fenologia da floração desta espécie bem como o número disponível de

indivíduos na região.

Vale ressaltar que os rizomas não foram coletados para minimizar a injúria à

planta e evitar pegar fragmentos da hospedeira bem como resíduos de rizosfera. Os

tecidos foram transportados em caixas de isopor até o laboratório e acondicionados

em temperatura de 4°C por até 24 horas antes do tratamento.

EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO

O material genético foi isolado utilizando um protocolo de extração baseado

em Doyle e Doyle (1990), ajustado para as condições morfoestruturais encontradas

em L. hypogaea. Ao que parece, além da grande quantidade de mucilagem

(observação pessoal), a planta é rica em polifenóis que dificultaram o isolamento do

DNA, além de ter conferido a coloração que varia do amarelo claro ao marrom

escuro ao produto final (pelete) (Fig.13A - C).

Para eliminar possíveis ectoparasitas, o material foi imerso em hipoclorito de

sódio durante cinco minutos, lavado em água destilada e seco com guardanapo de

57

papel. Para facilitar e otimizar o processo de rompimento das paredes celulares, os

tecidos foram fragmentados com o auxílio de um bisturi esterilizado e então

macerados na presença de nitrogênio liquido em almofariz de cobre até a obtenção

de um pó fino e homogêneo.

Para rompimento das membranas celulares e acesso ao DNA, foi empregada

uma solução extratora de 20 ml de CTAB 2% (5,6 mL de Nacl 5M, 2 mL de Tris-Hcl

0,1M, 0,4g de CTAB 2% (p/v),0,8 mL de EDTA 0,5M, 100µl de beta-mercaptoetanol,

0,4 g de PVP-40, 625 µl de proteinase K 20 mg/ml) e água destilada até completar o

volume de 20 mL. O macerado foi mantido em banho-maria a 55°C por três horas,

agitando ocasionalmente o tubo para manter o extrato ressuspendido. Para

purificação do DNA e eliminação de proteínas e polifenóis, acrescentou-se duas

lavagens com solução de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1 v/v) intercaladas com

três centrifugações a 5.000g. Posteriormente, ao sobrenadante desta solução foi

adicionado 2,5 volumes de etanol absoluto gelado a 4°C e novamente o extrato foi

centrifugado, dessa vez por 20 minutos sob a mesma velocidade. O produto de DNA

gerado (pelete) foi lavado com dois mL de etanol 70% (v/v) e seco por inversão em

papel-toalha por aproximadamente um minuto. Na sequência, as amostras foram

ressuspendidas em 150 µL de tampão TE, com determinação de sua concentração

aproximada definida por espectrofotometria e armazenadas a 4°C para uso

posterior.

Para que o isolamento genômico das amostras não-frescas ou oriundas de

tecidos duros fosse possível, foi necessário acrescentar uma fase adicional ao

processo descrito acima, imediatamente após a remoção da fase aquosa, repetindo-

se a incubação do sobrenadante em outro tampão CTAB, desta vez a 7%, sem

adição de BSA 1%, incubando a solução a 55°C por 1 hora. O DNA precipitado foi

58

recuperado e lavado com etanol 70% (v/v) por duas vezes. Esse processo foi

necessário em função de, no início do trabalho, não haver plantas frescas, cuja

floração e consequente localização da população, aconteceram sete meses depois.

ELETROFORESE

A integridade do DNA genômico isolado foi revelada por eletroforese em gel

de agarose 1% que foi preparado fundindo-se 0.5 g de agarose no volume de 50 ml

de tampão TBE (Tris/Borato/EDTA) 1x em forno de microondas. Após a solidificação,

as amostras contendo 10 µl do material (DNA), 3 µl de tampão de amostra 5x ( azul

de bromofenol, 0,125% xilenocianol, 0,125% e glicerol 50%) e 2µl de brometo de

etídeo (10mg/ml) foram aplicadas nos poços do gel e submetidas a uma voltagem de

100V em tampão de corrida TBE 1x por 40 minutos para então serem visualizadas e

fotografadas sob luz UV. A quantidade de material genético foi estimada por

espectrofotometria 260/280nm.

SELEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS E AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR RAPD

As amostras de DNA de cada material genético foram diluídas em fatores de

1:650 a 1:1000 de acordo com os perfis de rendimento observados no gel de

agarose e quantificados por espectrofotometria para que fossem amplificadas via

PCR. Foram testados 12 oligonucleotídeos, sete da linhagem S, depositados no

Genemark (http://www.genemark.com.tw/106-primers.htm), além de cinco

oligonucleotídeos previamente descritos por Holzapfel et al.(2002) em trabalho

realizado com outras espécies de plantas da família Balanophoraceae (Tab. 1).

59

Foram realizados ensaios para a padronização da técnica através de variações nas

quantidades de alguns reagentes, na temperatura de anelamento dos

oligonucleotídeos e nos tempos nos ciclos de amplificação do termociclador. Ao

término dos ensaios-piloto, as reações de amplificação foram padronizadas em um

volume total de 50 µL contendo 3µL de DNA diluído (ver fatores de diluição acima),

3µL de MgCl2 25mM, 10 µL de tampão PCR 10x, 1 µL de dNTP 10 µM, 16 µL do

oligonucleotídeo RAPD ,1 µL da enzima Taq polimerase (1 U.μL-1) e 16 µL, QSP de

água destilada.

As amplificações foram efetuadas no termociclador Biocycler, versão 3.2,

programado para 35 ciclos, cada uma constituído pela seguinte sequência: três

minutos a 94°C, um minuto a 46°C e dois minutos a 72°C. Na sequência foi

realizada uma etapa de extensão de 10 minutos a 72°C e redução para 4°C. Aos

produtos das reações foram adicionados 5 µL de azul de bromofenol e submetidos a

eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio na presença de

tampão TBE 1x . A separação eletroforética foi de 6 horas a 70 volts. Por fim, os géis

foram fotografados sob luz ultravioleta. Os fragmentos de DNA amplificados foram

computados como ausência ou presença de bandas.

61

Figura 12 – Corte longitudinal de um fruto múltiplo de L.hypogaea mostrando as regiões utilizadas para a extração do DNA genômico. (Seta preta – escapo, seta branca – eixo do fruto, setas cinzas – brácteas) (Foto: Freitas L, 2010).

RESULTADOS E DISCUSSÃOEXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO

A extração de DNA do material não fresco foi possível após a adição da etapa

de lavagem com CTAB 7% ao protocolo e utilizando uma massa igual ou superior a

3g. No entanto, o produto final apresentou-se degradado, como era esperado (Fig

14A). Conservando-se a mesma massa, porém de tecidos recém coletados, a etapa

do CTAB 7% foi retirado do processo e o rendimento do material genético foi

mantido. Apesar do produto final do material fresco também ter ficado ligeiramente

60

corado ainda assim foi possível utilizá-lo. A coloração do mesmo dependeu do tipo

de tecido utilizado. No caso das brácteas, por ficarem escuras após a floração,

quando utilizadas geraram um pelete escurecido (Fig 13A). Foi evitado o uso desse

tecido quando possível. O escapo, apesar de ser uma região de coloração mais

clara que as brácteas, é rico em mucilagem e pêlos e constituído por um tecido duro

e fibroso que dificultou a maceração e produziu um produto final um pouco mais

claro que o anterior (Fig. 13B). A região de melhor manipulação e produto final foi o

eixo da inflorescência que além de não possuir pigmentação escura, é um tecido

mole de fácil maceração e que também gerou um produto final de cor clara (Fig.

13C). No entanto, sua disponibilidade na planta foi ínfima, sendo necessária a

utilização de outras partes em todas as realizações do procedimento.

A quantificação do DNA por espectrofotometria mostrou um rendimento médio

de 15,0 µg a partir de uma massa média de 3,0 gramas e valor médio de

A260nm/A280nm=1,846, indicando baixa contaminação com polifenóis, proteínas e

carboidratos. A pureza do DNA obtido foi satisfatória, visível no gel de agarose (Fig.

14B) e mostrando-se amplificável à técnica de PCR (Fig 14C).

Reduzindo a quantidade de material sob este novo protocolo, a integridade do

DNA genômico de L. hypogaea se mostrou tão satisfatória quanto em massas

maiores, tornando-o ideal para este modelo de planta de tecidos duros e reduzidos.

Além disso, houve uma otimização de tempo na execução da metodologia e uma

economia considerável de reagentes utilizados no preparo do CTAB 7%. Todas as

amostras obtidas com o novo protocolo se mostraram íntegras, o que é fundamental

para a nitidez e reprodutibilidade de produtos de PCR.

62

Figura 13 – Aspecto do produto final de extração do DNA (pelete) de L. hypogaea de três

tecidos diferentes da planta, brácteas (a), escapo (b) e eixo da inflorescência (c) (Foto: L. Freitas, 2010).

63

Figura 14 - Eletroforese em gel de agarose 1% corado com EtBr caracterizando a obtenção do DNA genômico extraído de 3g de tecido de L.hypogaea retirado de amostras necrosadas com o uso de CTAB 7% (a) 2g de tecido retirado de plantas frescas (15µg) com o uso de CTAB 2% (b) e produto final de PCR-RAPD realizado a partir de tecidos frescos (c). O oligonucleotídeo utilizado na PCR foi o S118, utilizado pela primeira vez e com êxito na família Balanophoraceae (Foto: L. Freitas, 2012).

64

SELEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS E AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR RAPD

Dos 12 oligonucleotídeos testados, foram selecionados apenas cinco (S118,

OP-P02, OP-P10, OP-20, OP-A20) por apresentarem padrões de bandas

polimórficas mais consistentes (Tab. 1). Um total de 28 fragmentos polimórficos foi

selecionado fazendo uso deste conjunto de oligos. O oligonucleotídeo S118

apresentou-se como o mais eficiente (dez bandas) (Fig. 14C), sendo que o registro

deste para a família Balanophoraceae é inédito e fundamental para que uma

biblioteca de oligos família específica seja consolidada.

A partir da leitura dos géis, gerou-se uma matriz binária em que os indivíduos

foram genotipados quanto à presença (1) ou ausência (0) de fragmentos RAPD com

a qual se estimou o coeficiente de similaridade de Jaccard. Os dados foram

analisados e uma matriz de similaridade genética utilizada para construir um

dendrograma (Fig. 15) pelo critério UPGMA utilizando o software TREECON W (Van

de Peer & De Wachter, 1994) e considerando 1000 rodadas de bootstraps.

O dendrograma gerado presumiu a existência de maior variabilidade genética

dentro dos agrupamentos de inflorescências que entre agrupamentos distintos,

sendo que esse perfil é normalmente esperado para populações de plantas que

possuem fecundação cruzada em decorrência da alta movimentação de genes

(Brown, 1979; Reis, 1996) e também foi observado por Holzapfel, et al. (2002) para

Dactylanthus tayloori, pertencente à Balanophoraceae. Ao contrário do resultado

encontrado por esse autor, a linhagem de oligonucleotídeos OP gerou pouco

polimorfismo para L. hypogaea.

No entanto, um novo oligonucleotídeo foi caracterizado como interessante

para amplificação desta espécie (S118) já que foi capaz de amplificar o maior

65

número de bandas polimórficas em relação aos demais. Apesar do perfil sugestivo

apresentado pelo dendrograma, a baixa quantidade de oligonucleotídeos utilizada, a

limitação no número de indivíduos, em detrimento de seu reduzido número na área

de ocorrência bem como a ausência de um grupo externo pode ter induzido um

resultado os resultados encontrados, necessitando, portanto de aprofundamento de

análises dessa natureza.

Apesar de grande parte das inflorescências serem predadas, os poucos frutos

que permanecem no ambiente conseguem amadurecer e dispersar centenas de

sementes, que por sua vez devem ser provenientes de polinização cruzada. De fato,

o amplo investimento da planta em atrativos para a reprodução, somado à

morfologia das flores masculinas e femininas e à variedade de animais visitantes,

levanta fortes indícios de que a mesma possua polinizadores generalistas que

mantêm seu sucesso reprodutivo através da eficiente transferência de pólen.

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OligonucleotídeoSequênciaReferênciaBandas

polimórficas de

L.hypogaea

Bandas polimórficas

Dactylanthus tayloori

de

S2 5’ – TGATCCCTGG – 3’ Este trabalho Não amplificou Não avaliado

S97 5’ – ACGACCGACA – 3’ Este trabalho Não amplificou Não avaliado

S118 5’ – GAATCGGCCA – 3’ Este trabalho Dez Não avaliado

S201 5’ – GGGCCACTCA – 3’ Este trabalho Não amplificou Não avaliado

S346 5’ – TCGTTCCGCA – 3’ Este trabalho Não amplificou Não avaliado

*LL

*LM

5’ – TAATTAGGATGCA – 3’

5’ - AAGTGGAGTAAT – 3

Este trabalho

Este trabalho

Não amplificou

Não amplificou

Não avaliado

Não avaliado

OP-P02 5’- TCGGCACGCA – 3’ Holzapfel et Seis 20

al.(2002)

OP-P10 5 ’- TCCCGCCTAC – 3’ Holzapfel et Cinco 14

al.(2002)

OP-P11 5’ – AACGCGTCGG – 3’ Holzapfel et Não amplificou 14

al.(2002)

OP-P16 5’ – CCAAGCTGCC – 3’ Holzapfel et

al.(2002)

Cinco 15

OP-P20 5’ – GTTGCDISSEGATCC – Holzapfel et Dois 21

3’ al.(2002)

Tabela 2 - Identificação dos oligonucleotídeos RAPD testados para o estudo de L. hypogaea,

suas respectivas sequências de nucleotídeos e o polimorfismo expresso por cada um deles.

* Os oligonucleotídeos LL e LM foram acrescentados de nucleotídeos na tentativa de aumentar a

especificidade.

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Figura 15 – Dendrograma de similaridade genética baseado no critério UPGMA para as 27 inflorescências de L. hypogaea mostrando uma maior variação genética dentro dos agrupamentos que entre agrupamentos de inflorescências. A letra A significa agrupamento e a letra i significa inflorescência.

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