Enzimologia e processos fermentativos - Apostilas - Engenharia Química_Parte2, Notas de estudo de Engenharia Química. Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
Pao_de_acucar
Pao_de_acucar5 de Março de 2013

Enzimologia e processos fermentativos - Apostilas - Engenharia Química_Parte2, Notas de estudo de Engenharia Química. Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)

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Apostilas de Engenharia Química sobre o estudo da enzimologia e processos fermentativos, inibidores competitivos, inibidores não competitivos.
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Bioquímica_completo_

1 – Inibidores Competitivos

2 – Inibidores Não competitivos

Obs: Tabela 3.7 (Bailey Ollis – pg. 122) Classificação de inibidores

Além desses inibidores temos outros que se ligam ou ao substrato ou ao complexo ES e que também

irão interferir negativamente sobre a atividade enzimática.

Definição - Atividade Enzimática: Unidades de atividade enzimática designa a quantidade de enzima

que fornece certa quantidade de atividade catalítica sob determinadas condições padronizadas (pH,

Temperatura, Concentração de substrato e força iônica) para aquela enzima em particular. Por exemplo

uma unidade de atividade de glicoamilase é definida como a quantidade de enzima a qual produz um

micromol de glicose por minuto numa solução de amido a 4% , pH 4,5 e 60°C.

1) Cinética enzimática na presença de inibidores competitivos

Um inibidor competitivo compete com o substrato para se ligar ao sítio catalítico da enzima. Geralmente

são substâncias que possuem semelhança com o substrato. Um mecanismo proposto para cinética

competitiva é:

E+S↔ES→E+P

(01)

E+I↔EI

(02)

A partir desse mecanismo pode-se chegar na seguinte expressão que descreve a reação enzimática

quando um inibidor competitivo está presente no meio reacional.

(03)

(04)

(05)

Graficamente:

S K

I K

SV v

i m

m

+ 

  

 +

= 1

 

  

 += Ki

I KK m

Ap m 1

SK

SV v

Ap m

m

+ =

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Figura 1. Curva com e sem inibidor Michaelis Menten(Sem inibidor I=0(azul);Com inibidor I>0(vermelha))

Nota-se que o inibidor competitivo não altera a velocidade máxima da reação quando comparada

aquela sem inibidor competitivo (I=0).

Figura 2. Gráfico Lineweaver-Burk com e sem inibidor

Um exemplo prático de inibição competitiva pode ser observado no caso do antibiótico sulfanilamida. A

sulfanilamida tem estrutura molecular similar ao ácido p-aminobenzóico que é utilizado pela célula para

produzir um composto vital chamado ácido fólico. A sulfanilamida bloqueia esta rota bioquímica da bactéria

e acaba por mata-la.

Obs: Os efeitos negativos do inibidor competitivo sobre a cinética enzimática podem ser atenuados

promovendo-se a reação em altas concentrações de substrato visto que nas altas concentrações de

substrato as taxas se aproximam da velocidade máxima que não é alterada na presença do inibidor

competitivo.

2) Cinética enzimática na presença de inibidor não competitivo

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Os inibidores não competitivos podem se ligar ou a enzima ou ao complexo ES o que prejudicará a

formação do produto, neste caso o mecanismo proposto é:

E+S↔ES→E+P

(06)

E+I↔EI↔EIS

(07)

ES+I↔EIS (08)

onde, (09)

Neste caso Km não é afetada porem a uma diminuição em Vm e consequentemente na velocidade da

reação.

Graficamente:

Figura 3. Curvas com inibidores não competitivos (a)Michaelis-Menten (b) Lineweaver-Burk

Observando o modelo, nota-se que, o inibidor não competitivo diminui a velocidade máxima da reação e

assim a sua presença no meio reacional sempre dará menores taxas para reação, quando comparada com

a reação sem o inibidor não competitivo.

Inibição pelo substrato

Muitas reações enzimáticas são inibidas quando a concentração de substrato é elevada, ou seja, a

partir de uma concentração crítica de um substrato, um aumento na concentração do substrato provoca

uma diminuição nas taxas, neste caso o mecanismo proposto é:

SKm

SV v

ap m

+ =

 

  

 + =

Ki

I

Vm V apm

1

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E+S↔ES→E+P

(10)

ES+S↔ES2

(11)

si

ap m

m

K

S SK

SV v

²++ =

(12)

Graficamente:

A inibição é dominante nas altas concentrações de substrato e pode-se mostrar que Scritico que é a

concentração de substrato a partir da qual a velocidade começa a diminuir.

Aula 07 – 22/03

(3.34 Shuler – inibição pelo substrato)

Determinação de Km ap, Ksi e vm

Neste modelo, para se determinar tais parâmetros, devemos fazer algumas considerações:

1- Faz-se a reação com baixas concentrações de substrato. Nessa situação S2/Ksi«1 e o efeito

inibitório do substrato praticamente não é observado, e a equação da taxa pode ser escrita como:

 =  *1 + +, -

Logo, podemos usar um dos métodos de linearização (L.B, H.W. e E.H) e assim se obtém Km ap e vm

2- Para se obter o Ksi, obtém-se dados cinéticos com elevadas concentrações de substrato onde a

inibição é predominante. Neste caso Km ap/S2«1

 = .1 + /01

Assim, linearizando a equação a cima por um dos métodos vistos, e com os pares v e S (S>critico),

obtém-se

Ksi e vm.

Exemplo 1: a hidrólise da uréia pela uréase sofre com um tipo de inibição. Os seguintes dados foram

obtidos para esta reação de hidrólise:

S=0,2M 1.v-1 I 0,22 0 0,33 0,00

12 0,51 0,00

27 0,76 0,00

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44 0,88 0,00

61 1,10 0,00

8 1,15 0,00

93 S=0,0

2M

1.v-1 I 0,68 0 1,02 0,0

013 1,5 0,0

022 1,83 0,0

032 2,04 0,0

037 2,72 0,0

044 3,46 0,0

057

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a- Determine a constante de MM:

b- Qual tipo de inibidor esta presente?

c- Qual a constante de inibição?

Ex: foram obtidos os seguintes dados cinéticos para uma reação enzimática:

V(E0=0,015

g.L-1)

S(g.L-

1)

V(E0=0,00875

g.L-1)

1,14 20

0,87 10

0,7 6,7

0,59 5

0,50 4,0

0,44 3,3

0,39 2,9

0,35 2,5

Aula 08 – 24/03

Gráfico de LB com inibição de substrato ****** fazer

Projeto de reatores enzimáticos

Como vimos, o modelo mais utilizado para representar a velocidade de uma reação enzimática é o

modelo clássico (ou modelo de MM) ou outros modelos que se baseiam no modelo clássico e que

descrevem situações particulares, como por exemplo fenômenos de inibição.

Assim,basta aplicar a equação da velocidade na equação de projeto do reator e assim resolvendo a

equação de projeto juntamente com a equação da velocidade, nós podemos determinar por exemplo o

tempo para que a reação atinja uma dada conversão ou o volume do reator necessário para produzir uma

certa quantidade de produto.

1- Reatores batelada ou descontínuos

[ENTRA] - [SAI] + [REAGE] = [ACÚMULO]

− =  Vamos considerar  = 23./ 34/ na equação acima, e as condições iniciais S(t=0)=S0 e S(t)=S, integrando

obtemos:

. ln 7 + 87 − 9 = .  Logo, a equação acima nos permite calcular implicitamente o tmepo necessário para que S0 diminua até

um valor de S qualquer. Pode-se escrever em termos de conversão:

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. ln 11 − & + 7& = .  2- Reatores contínuos agitados (CSTR)

Q=vazão volumétrica(Qe=Q=cte)

Se=[S] na alimentação

Pe=[P] na alimentação (Pe=0)

V=volume reacional (cte)

[ENTRA] - [SAI] + [REAGE] = [ACÚMULO]

:. ; − :.  − . ' = .  .  =

: ' 8; − 9

Definindo D=Q/V=tava de diluição temos:

  = <8; − 9 − 

No estado estacionário:

 = <8; − 9 Considerando a equação da taxa de MM obtemos:

< =  . &

1 − &1 + ;&

Aula 09 – 29/03

Reatores enzimáticos (continuação)

-Reatores batelada

$. ln = 11 − &> + ?. @ = '$. A -Reatores CSTR

'$ < = $. =

@ 1 − @> + !. @

-Reatores PBR (com enzimas imobilizadas)

!. @ = $. ln81 − @9 + '$. 'B. C: Onde x=conversão

Se= [S] na alimentação

C= porosidade do leito = '!D/'B Q é a vazão volumétrica

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'B :⁄ = tempo de residência *Referência: Gacesa e Hubble-Tecnologia de enzimas capítulo 4.

Determinação dos parâmetros cinéticos Vm e Km utilizando os dados obtidos do reator

1- Reatores batelada

Neste caso a Equação 1 pode ser reescrita como:

1  . ln =

1 1 − @> =

'$ $ −

?@ $. 

Esta é uma Equação da reta do tipo y=b-ax, onde y é dado por F . ln . GH1 e x é /I.F , logo . F . ln . GH1 X

/I .F é uma reta com coeficiente angular -1/km e com coleficiente linear J . Assim, com uma regressão linear, calculamos o km e conhecendo km e o coef, linear determinamos o Vm.

-Reatores CSTR

A Equação 2 pode ser reescrita como

!.  = '$< − $ = @

1 − @> Novamente temos uma equação da reta (S/X) vs. (X/1-X), logo, faz-se vários experimentos com

diferentes vazões que na alimentação e coleta-se os dados no regime estacionário para uma dada vazão,

reorganiza-se os dados na forma linear acima e faz-se a regressão linear e determina-se Km e Vm.

Exercício 1- 7.8 do Fogler) Considere a reação de decomposição da uréia pelo ureiase vista

anteriormente. Considere essa reação efetuada em um reator batelada sobre as mesmas condições para

uma dada concentração de enzima utilizada para obter os dados vistos no exemplo.

Pergunta-se:

a) Determine o tempo necessário para atingir uma conversão de 90 % quando a concentração inicial da

uréia for Cao=0,02 mol/L.

b) Determine o tempo necessário para atingir esta mesma conversão no caso de a concentração da

enzima ser o dobro da utilizada anteriormente.

Exercício 2) Fazer o exercício 7-11 do Fogler.

Cinética da desativação enzimática

Como vimos, as enzimas são moléculas protéicas de configuração complexa que atuam como

catalisadores que são sensíveis as condições físico-quimicas ambientais, ou seja, podem sofrer

desnaturação. No decorrer das reações enzimáticas a desativação ou desnaturação da enzima ocorre com

uma dada velocidade (taxa) que dependera da estrutura da molécula e das condições do processo. Logo,

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a quantidade de enzima ativa responsável pela transformação do substrato em produto pode diminuir

consideravelmente durante a reação. Assim, torna-se importante conhecer a cinética da desativação

enzimática.

Um modelo proposto de desativação enzimática é o da desativação irreversível de primeira ordem

com relação à enzima ativa (Ea), ou seja:

% K L Onde kd é a constante de desativação. Como é uma desativação de primeira ordem, temos:

− %  = . %

Com

%|FM7 = I Logo:

%89 = %?!GNK.F (2) A Equação 2 mostra que a concentração da enzima ativa diminui exponencialmente com o tempo.

Logo este fenômeno de desativação pode ser levado em conta nos modelos cinéticos.

Na obtenção de MM, vimos que logo quando a concentração de enzima ativa diminui, devido à

desnaturação irreversível é de se esperar que a velocidade máxima também diminua.

'$ =  %89 '$ =  I!GNK.F

'$89 = '$. !GNK.F (3) A estabilidade das enzimas pode ser dada pelo tempo de meia vida  / , ou seja, o tempo necessário

para que a atividade enzimática seja reduzida para a metade, ou seja, o tempo de meia vida é dado por:

 / = OP 89NK (4) Exercício 3) Utilizando um reator batelada, obter uma equação considerando a desativação enzimática

de primeira ordem.

Aula 10 – 31/03

Modelo cinético para enzimas regulatórias

SE APLICA A DADOS QUE SE COMPORTEM DE FORMA SIGMOIDAL

 = J3/Q 34/Q = − K/KF (1)n= coeficiente de cooperatividade

n>1 cooperatividade positiva

n<1 Cooperatividade negativa

Representação gráfica do modelo (1)

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Determinação de n: temos  = J3/Q 34/Q Logo:

2 J3 = /

Q 34/Q

Assim:

ln = ' − > = R SR89 − SR89 Obtêm-se o gráfico linearizado de ln . 2J3G21 versus SR89, obtendo por regressão os parâmetros n e Km. IMOBILIZACAO DE ENZIMAS (REF SHULER 3.4)

Vimos até o momento a reação enzimática com as enzimas livre, isto é, tais moléculas tinham a

liberdade de se movimentar por todo o volume reacional o que traz algumas desvantagens como por

exemplo a instabilidade, rápida perda da atividade catalítica e também a reutilização já que separá-las do

meio após a reação teria altos custos, logo também teremos a contaminação do produto com as enzimas.

A imobilização de enzimas refere-se a restrição da mobilidade da molécula num dado espaço. A

imobilização de enzimas traz inúmeras vantagens tais como a sua reutilização e eliminação dos processos

de recuperação e purificação da enzima. Também, a imobilização pode fornecer um ambiente melhor para

a atividade enzimática o que pode conferir uma maior estabilidade e faixas mais amplas de pH e

temperatura de ação. Como, as enzimas são caras a reutilização do catalisador será vital em muitos

processos. Com a imobilização a pureza do produto é melhorada e também diminui os problemas com

tratamentos de efluentes, ainda as enzimas imobilizadas poderão sofrer menores interferências de

inibidores ou ativadores.

A enzima livre normalmente é imobilizada em um suporte inerte, como por exemplo vidro poroso, sílica,

entre outros que veremos a seguir. O suporte pode ser também ser chamado de matriz e é onde as

enzimas ficaram “grudadas”. Alem de inerte, ou seja, não podem sofrer decomposição física, química ou

bioquímica nas condições do processo, também devera ser obviamente um suporte insolúvel.

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O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um bio catalisador com atividade e estabilidade

que não sejam afetadas durante o processo( não apenas a reação em si mas o bombeamento em si entre

outros) em comparação com sua forma livre. As enzimas também podem ser imobilizadas entre

membranas semipermeáveis, neste caso haverá um processo a aquele que ocorre para as enzimas intra

celulares.

Métodos de imobilização

Os principais métodos de imobilização são ilustrados na figura abaixo, onde temos os dois principais

que são o aprisionamento das moléculas ou a imobilização em superfícies, seja por adsorção das enzimas

ou a imobilização por ligação covalente das moléculas.

Figura(3.16 Shuler, pg 79)

Método de Aprisionamento de Enzimas

O aprisionamento de enzimas consiste no enclausuramento de moléculas de enzima em um pequeno

volume. Neste caso nos temos o aprisionamento em géis ou polímeros e também as moléculas poderão

ficar aprisionadas entre membranas incluindo a micro encapsulação. A imobilização por aprisionamento

pode ser efetuada utilizando materiais poliméricos como por exemplo o alginato de cálcio (cálcio o sódio) o

Agar, k-carragena, géis de poli-acril-amida e colágeno. Neste caso mistura-se uma solução com enzimas

livres e polímero antes que a reação de polimerização seja efetuada, garantindo que as moléculas de

enzimas fiquem aprisionadas na rede polimérica após a reação de polimerização. Também para o

aprisionamento podem ser utilizadas membranas como as de nylon, celulose, polisulfonas e poliacrilatos. É

importante que os poros da membrana sejam capazes de reter as moléculas de enzima que possuem alto

peso molecular, mas que permitam a passagem de compostos com baixo peso molecular como do seu

substrato e produto.

O aprisionamento entre membranas embora possua algumas vantagens da imobilização já

mencionadas também apresenta algumas limitações como por exemplo limitações difusionais e surgimento

de um micro ambiente desfavorável e também muitas das moléculas aprisionadas podem “escapar” para o

ambiente externo contaminando o produto. Para o caso das limitações difusionais (fenômenos intrínsecos

da transferência de massa) deve-se trabalhar o diâmetro da partícula ou o diâmetro do poro.

Aula 11 – 05/04

Imobilização Superficial

As moléculas de enzima podem ser imobilizadas sobre a superfície de materiais que são chamados

de suportes ou matrizes. Temos dois tipos principais de imobilização superficial.

a) Imobilização por adsorção

b) Imobilização por ligações covalentes

Imobilização por Adsorção

A adsorção refere-se á ligação de moléculas de enzimas sobre a superfície de um suporte por

forças fracas, por exemplo, as de Wan der Waals. O sítio ativo da enzima neste caso, da molécula

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