Espectrofotometria  do DNA Genómico - Apostilas - Medicina, Notas de estudo de Medicina. Centro Universitário do Pará (CESUPA)
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Neymar28 de Fevereiro de 2013

Espectrofotometria do DNA Genómico - Apostilas - Medicina, Notas de estudo de Medicina. Centro Universitário do Pará (CESUPA)

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Apostilas sobre a extração e quantificação, por espectrofotometria, do DNA genómico de células hepáticas de um ratinho descendente do cruzamento entre heterozigóticos. Métodos, resultados e discussão.
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Objectivo do trabalho

Extração e quantificação, por espectrofotometria, do DNA genómico de células hepáticas de um ratinho descendente do cruzamento entre heterozigóticos relativamente ao gene Drg11 para posterior amplificação por PCR de fragmentos de DNA correspondentes ao gene supracitado e ao gene reporte LacZ e análise por eletroforese de modo a determinar o seu genótipo.

Métodos

• Extração e quantificação do DNA genómico

1- Escolheu-se 1 tubo (caixa a -20ºC) com uma porção de fígado de ratinho, macerou-se o tecido, o melhor possível, com um pistão de teflon e vortexou-se a solução durante 5 minutos.

2- Adicionou-se 400 l de tampão de extração (200mM Tris-HCl pH 7.5; 250mM N Cl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; Proteinase K) e ressuspendeu-se a solução.

3- Incubou-se a solução a 65ºC durante 20 minutos no termomixer.

4- Centrifugou-se a mesma a 13000 rpm durante 5 minutos.

5- Transferiu-se o sobrenadante, contendo o DNA, para novos tubos.

6- Adicionou-se 300 l de isopropanol ao sobrenadante e inverteu-se o tubo vári s vezes até visualizar os filamentos de DNA genómico.

7- Centrifugou-se a 13000 rpm durante 5 minutos.

8- Retirou-se o sobrenadante, lavou-se o “pellet” com 200 l de etanol a 70% e centrifugou-se novamente durante 2 minutos.

9- Removeu-se todo o etanol e deixou-se secar o “pellet” a 65ºC (com a tampa do tubo aberta).

10- Dissolveu-se o “pellet” de DNA em 50 l de água e incubou-se a 65ºC durante 10 minutos no termomixer.

11- Para quantificar o DNA, preparou-se dois tubos eppendorf: um para diluir o DNA genómico obtido com uma razão de diluição de 1:10, e outro com uma razão de diluição de 1:100 em 200 µl de água. Armazenou-se o DNA genómico restante a 4ºC até à sua utilização na aula laboratorial seguinte.

12- Leu-se a absorvância a 260 nm e a 280 nm no espectrofotómetro.

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13- Com os valores de absorvância obtidos, determinou-se a concentração do DNA genómico extraído, utilizando a diluição de 1:100 e também o grau de pureza.

• Amplificação do DNA por PCR e análise por Electroforese

I – PCR, análise de uma amostra de DNA genómico

1- De acordo com a tabela, juntou-se a quantidade correspondente dos seguintes reagentes em dois tubos diferentes, rotulados como Mistura de PCR “Drg11” e “LacZ”.

Mistura Drg11 Mistura LacZ

Tampão salino 10X 1 µl 1 µl

dNTP mix (10mM) 0.5 µl 0.5 µl

MgSO4 (25mM) 1 µl 1µl

Primer Drg11 upper 3 µl ---

Primer Drg11 lower 3 µl ---

Primer LacZ upper --- 3 µl

Primer LacZ lower --- 3 µl

Taq DNA polimerase 0.5 µl 0.5 µl

2- Centrifugou-se a amostra de DNA genómico, extraída na aula laboratorial anterior, a 13000rpm durante 5minutos.

3- Diluiu-se a amostra de DNA genómico de modo a obter uma concentração entre 0.1-50 ng/µL, precisamente 20,5 ng/µL e pipetou-se 1 µL para o tubo Drg11 e outro para o tubo LacZ.

4- Inseriram-se os tubos no termociclador e correu-se a PCR com o programa “BCM”.

II – Eletroforese em gel de agarose

 Preparar um gel de agarose a 1 % em TAE

1- Derreteu-se no microondas a agarose previamente preparada e deixou-se arrefecer até ser possível tocar no matraz com os dedos sem se queimar.

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2- Colocou-se a solução no suporte adequado, com o pente numa das extremidades e adicionou- se e misturou-se o corante SYBR Safe diretamente no gel e. Deixou-se solidificar.

 Preparação das amostras

3- Colocou-se em cada tubo da reacção de PCR 2 l de 6x “loading bu bromofenol, 30% de glicerol) e colocou-se as amostras no gel.

4- Pipetou-se para um tubo 5µl de DNA genómico contendo 0,1-1 µg e 1 ul de “loading buffer, para analisar em gel o DNA genómico extraído na aula laboratorial anterior.

5- Pipetou-se para um tubo 5µl do controlo positivo Drg11 e para outro 5µl do controlo positivo LacZ e juntou-se 1 µl de “loading buffer” em cada.

 Eletroforese

6- Preencheu-se o volume da tina de Eletroforese com quantidade suficiente de tampão de Eletroforese TAE 1X (40mM Tris acetato, 2 mM EDTA, pH 8.5).

7- Colocou-se o gel na tina de Eletroforese.

8- Aplicou-se as amostras de DNA nos respetivos poços e colocou-se 4 l de padrão de peso molecular.

9- Aplicou-se a corrente elétrica (100 V) e deixou-se correr tempo suficiente para separar as amostras (cerca de 20 min).

5 – Desligou-se a fonte de alimentação elétrica e analisou-se o gel no transiluminador de UV.

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Resultados

G2 F.Diluição A260 A280

1:10 0,410 0,232

1:100 0,038 0,032

Cálculos:

-Diluição do DNA 1:10 (no final da sua extração)

20µl de DNA e 180µl de H2O

-Diluição do DNA 1:100 (no final da sua extração)

2µL de DNA e 198µl de H2O

-Grau de pureza

A260

A280

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-Quantificação do DNA da amostra

1 Unidade A260―50µg/ml de DNA

0.410 UA260 ―X

X=20.5µg/ml DNA

-Quantificação do DNA total

20,5 x 10(factor de diluição) = 205 µg/ml o que corresponde a 205ng/ml

-Diluição do DNA, 1:10 (para posterior adição de 1µl as soluções de Drg11 e LacZ )

1µl de DNA(inicial) + 9 µL de H2O = 20,5 ng/ml de DNA

No final da segunda etapa desta atividade laboratorial, após eletroforese em gel de agarose, o grupo em questão obteve um gel com a disposição de bandas visível na Imagem 1 e representada no Esquema 1.

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Tal com é possível verificar na Imagem 1, formou-se uma coluna com diversas bandas à frente do poço 1, que corresponde ao padrão de peso molecular; à frente do poço 2, que continha o DNA genómico, apenas é visível uma ténue mancha vertical que se estende ao longo da zona de corrida deste conjunto de poços; à frente do poço 3, que continha o controlo positivo de Drg11, formou-se apenas uma banda relativamente pouco marcada e nivelada com a banda correspondente ao poço 5, que continha a amostra em que este gene foi amplificado, e com a banda do padrão de peso molecular relativa a 300 pares de bases; à frente do poço 4, que possuía o controlo positivo de LacZ, formou-se também uma banda pouco marcada e nivelada com a banda correspondente ao poço 6, que continha a amostra em que este gene foi amplificado, e com a banda do padrão de peso molecular relativa a 200 pares de bases.

Discussão

O tampão de extração utilizado no isolamento de DNA genómico é constituído por Proteinase K, enzima que degrada as proteínas e promove a digestão celular, o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), que funciona como agente quelante dos catiões divalentes e é utilizado para inibir a atividade das enzimas que degradam o DNA (DNases), a solubilização dos componentes celulares com detergentes como o SDS (dodecilsulfato de sódio), que é utilizado para lisar as células e solubilizar a maioria dos seus componentes, principalmente as membranas biológicas, libertando assim o DNA para a solução, seguido da precipitação dos ácidos nucleicos com um solvente orgânico, geralmente o etanol ou o isopropanol, e dissolução em água. Para evitar mudanças bruscas de pH que poderiam danificar o DNA, a solução é tamponada com Tris-HCl pH 7.5, e para manter uma força iónica elevada durante o processo, utiliza-se NaCl, de modo a estabilizar os ácidos nucleicos.

A quantificação de amostras de DNA pode ser feita por espectrofotometria para quantidades na ordem das microgramas, sendo que neste caso a concentração da amostra é de 205µg/ml.

A concentração de DNA pode ser determinada através da medição das absorvâncias a 260nm (A260) num espectrofotómetro usando uma cuvette de quartzo. Para uma maior precisão, as leituras devem estar entre 0,1 e 1,0, como mostrado na tabela 2, estas leituras na amostra diluída, 1:10, estão entre os valores referidos. A absorvância de 1 unidade a 260nm corresponde a 50 µg de DNA genómico por ml (A260 = 1 => 50 µg/ml), logo e através dos cálculos apresentados anteriormente a concentração de DNA na amostra, 1:10, é de 20,5µg)ml. Esta relação só é válida a pH neutro.

A razão das leituras a 260 nm e 280 nm (A260/A280) dá uma estimativa da pureza do DNA relativamente a contaminantes que absorvem luz UV, como por exemplo as proteínas. O DNA puro tem uma razão A260/A280 entre 1,7–1,9, sendo a razão calculada de 1,78 podemos concluir que o DNA presente na amostra é puro.

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O ratinho analisado era descendente de um cruzamento entre progenitores heterozigóticos em relação ao gene Drg11 (+/-), ou seja, progenitores que possuem um dos alelos com o gene Drg11 normal (alelo +) e um outro alelo em que o gene Drg11 foi removido e substituído por um gene repórter LacZ (alelo -). Deste modo, e tendo em conta o Esquema 2, o ratinho em questão poderia ser homozigótico (Wild type) (+/+), heterozigótico (+/-) ou KO (-/-) em relação a este gene.

Progenitores

Descendência

Esquema 2 – Representação dos genótipos possíveis para o ratinho em estudo, tendo em conta que ambos os progenitores são heterozigóticos (+/-), isto é, que ambos têm um dos alelos com o gene Drg11 normal (alelo +) e um outro alelo em que o gene Drg11 foi removido e substituído por um gene repórter LacZ (alelo -).

De acordo com a presença ou ausência de cada um dos fragmentos amplificados, é possível determinar o genótipo deste ratinho: caso seja homozigótico, estando ausente o gene LacZ, apenas será amplificado o gene Drg11 pelo que, após o PCR, só se formarão exponencialmente fragmentos correspondentes a este gene; caso seja KO, estando ausente o gene Drg11, apenas

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será amplificado o gene LacZ pelo que, após o PCR, só se formarão exponencialmente fragmentos correspondentes a este gene; caso seja heterozigótico, estando presentes ambos os genes, serão amplificados os genes Drg11 e LacZ pelo que, após o PCR, formar-se-ão exponencialmente fragmentos correspondentes aos dois genes.

Em relação ao gel obtido após eletroforese, se o ratinho fosse homozigótico (Esquema 3), na zona correspondente aos poços contendo as amostras em que foi realizado o PCR (poços 5 e 6) obter-se-ia apenas uma banda de 300 pb que corresponderia ao poço em que foi aplicada a amostra em que foi amplificado o gene Drg11 (poço 5); se o ratinho fosse KO (Esquema 4), na zona correspondente aos poços contendo as amostras em que foi realizado o PCR (poços 5 e 6) obter-se-ia apenas uma banda de 200 pb que corresponderia ao poço em que foi aplicada a amostra em que foi amplificado o gene LacZ (poço 6); se o ratinho fosse heterozigótico (Esquema 1), na zona correspondente aos poços contendo as amostras em que foi realizado o PCR (poços 5 e 6) obter-se-iam duas bandas de 200 e 300 pb que corresponderiam aos poços em que foi aplicada a amostra em que foi amplificado o gene LacZ (poço 6) e a amostra em que foi amplificado o gene Drg11 (poço 5), respectivamente.

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Quanto ao poço em que foi depositado o DNA genómico, não se obtiveram bandas definidas, o que era esperado, já que não estava fragmentado. No entanto algumas porções de DNA foram arrastadas ao longo do gel. Como o DNA genómico foi extraído uma semana antes da realização da análise por eletroforese, pode ter sofrido alguma degradação o que explica os pequenos fragmentos que foram arrastados pelo gel.

Tendo em conta os resultados obtidos, podemos concluir que o ratinho do qual extraímos o DNA genómico das células de fígado era homozigótico (Wild type), pelo que se obteve apenas uma banda, banda esta de fragmentos com 300 pb que corresponde ao poço das amostras de PCR Drg11 (esta dimensão foi determinada por comparação com as bandas do padrão de peso molecular).

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