Fitase - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Fitase - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da Fitase, definição, ação, fontes, fungos, bactérias, levedura.
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1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

FITASE

CURITIBA

2008

Trabalho apresentado à disciplina de Engenharia Enzimática do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Federal do Paraná. Professor Dr. Carlos Ricardo Soccol

1. INTRODUÇÃO

Fitase (mio-inositol-hexaquifosfato fosfohidrolase, EC 3.1.3.8) é uma enzima

que catalisa a liberação do fosfato de fitato (mio-inositol hexaquifosfato), o qual é a

principal forma de fósforo predominantemente ocorrendo em grãos cereais, legumes

e sementes oleaginosas (PANDEY, A, 2001). Onde o ácido fítico armazenado

compreende de 1 a 5% em peso (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

Ácido fítico e intermediários de inositol têm sido incluídos na resposta de

glucose do sangue, diminuindo o colesterol e triglicerídeos, na formação de tumores,

no tratamento da doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esclerose múltipla

(VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

A hidrólise do ácido fítico (fitato) a mio-inositol e ácido fosfórico é considerada

como um importante processo metabólico em vários biosistemas. A sensibilização

da sociedade e os regulamentos, cada vez mais exigentes, do mundo de controle

sobre poluição agrícola, particularmente na poluição de fósforo (P), que limita o

conteúdo de fósforo no estrume, têm intensificado a pesquisa sobre as fitases. O

foco tem sido principalmente sobre a produção de fitase e sua utilização como um

meio de reduzir a suplementação fósforos inorgânicos na alimentação e

conseqüente redução na excreção fecal de fósforo. A poluição ambiental, devido ao

estrume com muito fosfato, tem resultado na acumulação de fosfato em várias

localizações, especialmente em corpos de água. A suplementação de fitase pode

reduzir a quantidade de fosfato no estrume para aproximadamente 30% (PANDEY,

A, 2001).

Fitases são consideradas de grande valor no melhoramento da qualidade

nutricional de ração, aumentando a quantidade de fosfato disponível. Fitase também

melhora a bio-disponibilidade de fosfato de fitato em alimentos vegetais para

humanos. Dois grupos importantes de animais, porcos e aves, carecem da enzima

necessária para a digestão eficiente do fitato nas rações (PANDEY, A, 2001).

Existem três grandes problemas gerados pela falta de fitases e incapacidade de

digestão de fósforo de fitato pelos animais monogástricos. Primeiro, o fósforo da

alimentação não aproveitado acaba no estrume, causando sérios problemas de

poluição ambiental em áreas de intensa pecuária. (KIM, T., 2006)

Um dos problemas ambientais global é o da eutrofização, que ocorre quando o

fosfato acaba em rios, propiciando o crescimento de cianobactérias, hipóxia e morte

de animais aquáticos (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

Segundo, é necessário a suplementação de fosfato inorgânico na dieta de

suínos, aves e peixes para satisfazer as exigências nutricionais de fósforo. Isso

representa um custo significativo na alimentação animal. Terceiro, o fósforo

inorgânico é não-renovável, e os acessos fáceis ao fósforo inorgânico em terra

podem estar exauridos em 80 anos, com a atual taxa de extração. Em excesso, o

fitato pode quelar oligoelementos, como ferro e zinco, causando deficiência

generalizada desses nutrientes em populações cuja alimentação é baseada em

leguminosas. (KIM, T., 2006)

No entanto, para crescimento ósseo correto, esses animais necessitam de

fosfato em concentrações adequadas. Isso cria uma situação complexa. Mas a

suplementação de fitase à alimentação fornece uma alternativa para enfrentar

efetivamente essas duas condições (PANDEY, A, 2001).

Uma abordagem alternativa para diminuir o teor de ácido fítico em produtos

agrícolas poderia ser o uso de métodos químicos, no entanto, esses métodos

geralmente são caros e afetam a qualidade nutricional do produto (PANDEY, A,

2001).

A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) em consulta

com a IUPAC-IUB, Comissão Mista em Nomenclatura Bioquímica (JCBN) listam dois

tipos de fitases: EC 3.1.3.8 e EC 3.1.3.26 (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

 EC 3.1.3.8

Nome recomendado: 3-fitase

Nome sistemático: mio-inositol hexaquis fosfato-3-fosfohidrolase

Hidrolisa a ligação éster na terceira posição de mio-inositolhexaquisfosfato em d-

mio-inositol-1,2,4,5,6-pentaquisfosfato e ortofosfato (VATS, P.; BANERJEE, U. C.,

2004).

 EC 3.1.3.26

Nome recomendado: 6-fitase

Nome sistemático: mio-inositol hexaquis fosfato-6-fosfohidrolase

Hidrolisa a ligação éster na sexta posição do mio-inositolhexaquisfosfato em d-

mio-inositol-1,2,3,4,5-pentaquisfosfato e ortofosfato. Subseqüentes ligações éster no

substrato foram hidrolisadas em diferentes taxas. Em um estudo recente, Mullaney e

Ullah, descreveram três classes de fitases baseadas em diferenças estruturais e

propriedades catalíticas variadas. Estas incluem membros de fosfatases de histidina

ácida (HAPs), β-propeller fitase (BPP) e fosfatases ácido roxas (PAP) (VATS, P.;

BANERJEE, U. C., 2004).

Dos vários tipos de fitases de histidina ácida, phyA e phyB são os

representantes mais amplamente caracterizados. Uma é caracterizada como fitase

(phyA) com dois pHs ótimos (2,5 e 5,0) e foi fortemente glicosilada com um peso de

molecular de 85 KDa, enquanto o monômero de proteína foi desglicosilado de 48,5

KDa. Verificou-se que a enzima manteve-se estável por meses em filtrado de cultura

bruta e mostrou termoestabilidade inerente, possuindo uma temperatura ótima de

58ºC, com 10 resíduos de cisteína envolvidos em formar cinco pontes dissulfeto. O

papel da glicosilação na expressão funcional da phyA foi estudado por diversos

autores e achou-se vital para a termoestabilidade da enzima (VATS, P.; BANERJEE,

U. C., 2004).

A secunda enzima é a phyB, que foi inicialmente referida com pH ótimo de 2,5

de fosfatase ácida. A enzima perde a atividade degradadora de fitato em pH 5,0

enquanto em pH 2,5 ela hidrolisa eficientemente fitato com um número de queda de

628 s-1 se comparado a 348 s-1 para phyA. Isso foi atribuído a distribuição de carga

em sítios específicos do substrato de phyA e phyB (VATS, P.; BANERJEE, U. C.,

2004).

Várias fitases foram reportadas na literatura que não possuem motivos de sítio

ativo e motivos HD (explicados na parte de AÇÃO), por isso, têm requerimentos

diferentes para a ação catalítica. KEREVUO et al. isolou, purificou, caracterizou e

clonou fitase extracelular de Bacillus subtilis VTT E-68013. A enzima teve atividade

máxima a 55ºC, pH 7,0, requerendo Ca+2 para atividade e estabilidade. E não

mostrou homologia com a seqüência do sítio ativo de HAPs, por isso, designada

como phyC tendo atividade de fitase. GREINER et al. reportaram uma monomérica

de 40 KDa, 3-fitase de Klebsiella terrigena, a qual assim como a phyA tem

temperatura ótima de 58ºC e não é uma metaloenzima. SEGUEILHA et al.

purificaram e caracterizaram a fitase de Schwanniomyces castellii que tem peso

molecular de 490 Kda (tetrâmero) com uma larga subunidade (125Kda) e três

subunidades identidades (70 Kda). SANO et al. reportou uma fitase secretora de

Arrula adeninivorans tendo uma temperatura e pH ótimos de 75ºC e 4,5,

respectivamente. O nível de enzimas secretadas excede ao reportado anteriormente

das fitases de levedura, mas a enzima não era resistente ao calor na ausência de

fitato. A fitase de soja não mostrou homologia na seqüência com nenhuma fosfatase

de histidina ácida e foi encontrada como homóloga ao N-terminal da fosfatase ácido

roxas de Arabidopsis thalliana. Em geral, fitases produzidas por bactérias tem pH

ótima na faixa neutra a alcalina com baixo rendimento, que impede os seu uso como

aditivo de alimentos (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

A Figura 1 mostra a estrutura da molécula de fitase e a Figura 2 mostra

apresenta uma imagem da estrutura superficial dessa enzima.

Figura 1: Imagem 3D gerada em computador da molécula de fitase

Fonte: Freeing Phosphorus. Disponível em: <www.ars.usda.gov/is/AR/archive/

jul06/phos0706.htm>. Acesso em: 22/04/08.

Figura 2: Imagem da estrutura superficial da molécula de fitase

-

Fonte: Freeing Phosphorus. Disponível em: <www.ars.usda.gov/is/AR/archive/

jul06/phos0706.htm>. Acesso em: 22/04/08.

1. AÇÃO

A fitase catalisa a hidrólise de fosfomonoésteres de ácido fítico (mio-inositol

hexaquisfosfato, IP6), retirando o grupo fosfato e formando, seqüencialmente, mio-

inositol pentaquis-, tetraquis-, tris-, bis-, e mono-fosfatos (IP5 IP4 IP3 IP2 IP1),

assim como fosfato inorgânico (VATS e BANERJEE, 2004).

O fitato possui seis grupos que podem ser liberados, dependendo da fitase

utilizada, em velocidades e ordem diferentes. Na conformação energética mais

favorável do fitato (Figura 3), cinco dos grupos fosfatos estão em posição equatorial,

enquanto o outro está em posição axial. As fitases fúngicas e de E. coli conseguem

liberar somente cinco dos seis grupos (somente aqueles que estão em posição

equatorial), sendo que os produtos finais são mio-inositol 2-monofosfato (WYSS et

al., 1999).

Figura 3: Conformação energética mais favorável do ácido fítico.

Fonte: WYSS et al., 1999.

O acompanhamento da retirada dos fosfatos foi estudado por Mitchell et al.

(2008). Observou-se que a retirada dos grupos fosfatos das posições equatoriais

acontecia rapidamente, enquanto a hidrólise do grupo axial acontecia tão lentamente

que a conversão total do fitato a mio-inositol monofosfato estava completa antes do

aparecimento do mio-inositol livre (Figura 4).

A especificidade da enzima pelos intermediários da reação também muda,

como mostra a Figura 4. Fez-se a comparação da especificidade com relação a

primeira reação, portanto, a primeira reação aparece no gráfico como especificidade

1. Observa-se que a enzima apresenta uma maior especificidade por IP5 e ela vai

diminuindo para as outras formas (MITCHELL et al., 2008).

Figura 4- Acompanhamento da formação de produtos (esquerda) e especificidade da

fitase de várias fontes (A-F) pelos intermediários (direita)

Legenda: 1- IP6, 2- IP5, 3- IP4, 4- IP3, 5- IP2, Q- IP1

Fonte: Mitchell et al., 2008.

Com base nas propriedades bioquímicas Oh et al. (2004) dividiu as fitases em

duas classes. A primeira delas é a fitase de histidina ácida que contém os grupos

phyA, phyB e phyC e abrange a maioria das fitases bacterianas e fúngicas

(KEROVUO, 2000).

Dentre as fitases do grupo fosfatases de histidina ácida, as que foram

melhores caracterizadas são a phyA e a phyB. Essas enzimas possuem um motivo

protéico conservado (Arg-His-Gly-X-Arg-X-Pro) da classe das ácido fosfatases,

proporcionando a hidrólise de fosfomonoésteres em duas etapas reacionais (VATS e

BANERJEE, 2004). Nesse sítio ativo, existem resíduos como histidina e arginina,

que em pH ácido apresenta carga positiva, a qual pode interagir com as cargas

negativas da molécula de fitato (VAN ETTEN et al., 1991). A carga positiva do grupo

guanidina da arginina do resíduo Arg-His-Gly interage diretamente com o grupo

fosfato do fitato, deixando-o mais suscetível ao ataque nucleofílico da histidina. A

histidina serve como nucleófilo e faz uma ligação covalente, formando um

intermediário (fosfohistidina). O ácido aspártico presente num resíduo C-terminal doa

um próton ao substrato, o qual é liberado da enzima sem o grupo fosfato

(KEROVUO, 2000).

As fitases denominadas phyC não apresentam o motivo protéico Arg-His-Gly-

X-Arg-X-Pro no sítio ativo, e, portanto, tem uma ação catalítica diferente. Elas

também necessitam da presença de íons cálcio para a atividade e estabilidade da

enzima (VATS e BANERJEE, 2004). O grupo das fitases alcalinas contém as phyD.

Elas necessitam do complexo fitato-cálcio para serem ativas e trabalham em pH

alcalino (KEROVUO, 2000).

O mecanismo de reação para fitases phyC, ou também chamadas de fitases

β-propulsoras devido a sua configuração espacial, consiste num sítio ativo que

contém de 3 a 6 átomos de cálcio ligados no qual irá penetrar um grupo fosfato.

Existe também um outro sítio de ligação para um segundo grupo fosfato, mas esse

sítio não é catalítico. Quando o fosfato liga-se nesse segundo sítio há uma alteração

na conformação da fitase de modo que sua atividade é melhorada. O íon fosfato que

irá ser liberado está perto de uma molécula de água e irá ser atacado pelo íon

hidróxido. Ocorre então o ataque da ligação entre o grupo fosfato e o mio-inositol por

um resíduo ácido de aminoácido, resultando na liberação do fosfato (SHIN et al.,

2001).

Elas também podem ser divididas em três tipos: 3-fitase (mio-inositol

hexaquisfosfato 3-fosfohidrolase, EC 3.1.3.8), que contém os grupos phyA e phyB,

pois começam a fazer a hidrólise do fitato preferencialmente na posição do carbono

3; 6-fitase (mio-inositol hexaquisfosfato 6-fosfohidrolase, EC 3.1.3.26), contendo a

phyC e começando a hidrólise preferencialmente pela posição C-6; e 5-fitase (mio-

inositol hexaquisfosfato 5-fosfohidrolase, EC 3.1.3.72), contendo phyD, que inicia a

quebra do fitato pelo carbono 5. A 3-fitase é mais encontrada em microrganismos, a

6-fitase e 5-fitase em plantas (KEROVUO, 2000).

A especificidade de substrato de fitases produzidas por E. coli e A. niger foi

testada por Wyss e colaboradores utilizando diferentes compostos fosfatados (p-

nitrofenil fosfato, fenil fosfato, frutose 1,6-bifosfato, frutose 6-fosfato, glucose 6-

fosfato, ribose 5-fosfato, α-glicerolfosfato, β-glicerofosfato, 3-fosfoglicerato,

fosfoenolpiruvato, AMP, ADP, e ATP). Foi apresentada uma boa atividade catalítica

com os três primeiros substratos, além do fitato, para a maioria das fitases testadas.

As fitases de A. niger e E. coli foram as que apresentaram maior especificidade para

fitato (WYSS et al., 1999).

Os fosfatos do fitato são carregados negativamente, e por isso, podem quelar

íons positivos como Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+ e K+, diminuindo a absorção

desses minerais por animais de criação como porcos e aves (Figura 5). Ele pode

também pode se integrar a íons positivos de proteínas, aminoácidos, carboidratos e

lipídios, diminuindo sua solubilidade e digestibilidade. A fitase também pode interagir

com resíduos de lisina e arginina de enzimas como tripsina e outras proteases,

diminuindo a atividade delas (NOCERA, 2005; Phytase and Layer Diets).

Figura 5: Fitato quelando íons Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, e Fe2+

Fonte: <www.spesfeed.co.za/winter99.htm>

Íons metálicos e reagentes sulfidril podem modular a atividade da fitase. No

entanto, não é provável que íons como Cu2+, Fe3+, Fe2+, Al3+, e Mn2+ se liguem

diretamente à enzima para diminuir sua atividade, mas sim através da interação dos

íons com o fitato, que assim não consegue se ligar fortemente a enzima. Em

algumas fitases, o detergente EDTA pode aumentar a atividade, enquanto em outras

como a phyC Bacillus subtilis que necessitam íons metálicos como Ca2+, o EDTA

diminui a atividade (WYSS et al., 1999).

2. FONTES

2.1. Vegetal

A fitase já foi encontrada em várias fontes vegetais, como trigo, milho, algumas

ervas como faba, arbustos como mung, alfaces, centeio e sementes oleaginosas,

sendo que a atividade mais alta foi encontrada no trigo, no centeio e na cevada. As

fitases obtidas de sementes em germinação e polém têm sido purificadas e

caracterizadas. Fitase alcalina também tem sido identificada no pólem de Lilium

longiflorum, Typha latifólia e em sementes de legumes (ROOPESH, K et al.).

Aos vegetais, geralmente, atribuem-se baixos valores de fitase, mas

Jongbloed e Kemme (1990) e apud COLE (1991) demonstraram que a fitase do trigo

pode melhorar a digestibilidade do fósforo de 27 para 50%. No entanto, para que se

extraia a enzima de fontes vegetais em alta produção, é necessário um longo tempo

para a germinação e um processo de extração em vários estádios, usando materiais

perigosos, como hexano (NEWMAN, 1991). Ademais, KORNEGAY (1996)

demonstrou que a fitase do trigo atua em um limite de pH bem menor do que a fitase

fúngica e ressaltou algumas vantagens da fitase fúngica sobre a de origem vegetal,

como a de ter atividade conhecida e ser estável. (FIREMAN, A. K. B. A. T. et al.,

1998.)

A tabela a seguir aponta as concentrações de P em várias fontes vegetais, sua

porção disponível para utilização pelo ser vivo, e sua atividade.

FONTE: (SELLE, P. H.; RAVINDRAN, V., 2008)

Fonte vegetal

Total de P (g.kg-1)

P na forma de fitato (g.kg-1)

Proporção (%)

Bioavaliabilidade (%)

Atividade da fitase (FTU kg-1)

Cereais

Cevada 3,21 1,96 61,0 30 348

Milho 2, 62 1,88 71,6 12 – 14 25

Sorgo 3,01 2,18 72,6 20 35

Trigo 3,07 2,19 71,6 49 503

Óleos vegetais

Óleo de Canola

9,72 6,45 66,4 21 5

Óleo de Algodão

10,02 7,72 77,1 1 11

Óleo de Soja

6,49 3,88 59,9 23 – 31 42

Derivados

Falero de Arroz

17,82 14,17 79,5 25 129

Farelo de Trigo

10,96 8,36 76,3 41 2173

A biotecnologia de plantas tem permitido a expressão de genes microbianos,

geralmente bacterianos e fúngicos, em plantas de fácil cultivo, como o arroz. Como

vantagem, perde-se a necessidade de utilizar biorreatores complexos ou grandes

quantidades de energia obtida de combustíveis fósseis. Isso fez com que as plantas

voltassem a ter destaque na produção de fitase. (HAMADA, A. et al., 2006)

Maiores detalhes dessa tecnologia serão discutidos na seção de Inovações

Tecnológicas.

2.2. Animal

A atividade da fitase já foi descrita em diferentes fontes animais, como fígado de

bezerro por Mc Collum & Hart em 1908, intestino de ratos por Patwardhan em 1937,

intestino delgado de mamíferos por Cooper & Gowing em 1983, eritrócitos de

galinhas por Martin & Luque em 1985 e mucosa intestinal de ratos por Yan et al em

1991. (ROOPESH, K et al) Também foi encontrado no sangue de aves, répteis,

peixes e tartarugas marinhas em 1941 por Rapoport et al. Assim como as fontes

vegetais, apresenta alguns problemas, principalmente uma produção instável e com

determinação enzimática complicada, além de uma produção em média escala e

cara. Uma utilização de fonte animal será discutida na seção de Inovações

Tecnológicas.

2.3. Microbiana

Apesar das fontes animais e vegetais representarem avanços científicos

importantes, sua aplicação prática é limitada. Em compensação, fontes microbianas

apresentam características que permitem um alto rendimento e ampliação de escala,

tornando-se amplamente utilizadas de maneira efetiva na indústria de rações

animais. (KIM, T., 2006)

Várias espécies de fungos, bactérias e leveduras tem sido utilizadas na produção

de fitases, geneticamente modificadas ou não, como mostrado na tabela abaixo.

FONTE: (ROOPESH, K et al)

A fitase microbiana tornou-se disponível comercialmente em 1991, quando a

legislação introduzida nos Países Baixos para controlar a poluição de fosfatos em

unidades de criação de suínos a aves amplificou seu desenvolvimento e aceitação.

O que antes era mais restrito aos países que adotavam essa legislação tornou-se

globalmente utilizado com o reconhecimento do perigo ecológico da eutrofização,

especialmente na última década. Além disso, essa proliferação das fitases no

mercado gerou redução de preços e facilidades na aplicação da criação de animais

monogástricos. Com a proibição da adição de farelos de carne e ossos de animais

na criação de monogástricos, houve um novo incentivo. Esses farelos, que foram

proibidos na União Européia em 2000, forneciam 57% do P adicionado às rações.

Essa proibição teoricamente gerou uma demanda de 110 mil toneladas de P

elemental, mas a utilização da fitase microbiana reduziu essa demanda para 26 mil

toneladas (SELLE, P. H.; RAVINDRAN, V., 2008).

2.3.1. Fungos

Apesar do estudo da fitase ter começado em 1962, apenas a partir de 1991 é

que a fitase de Aspergillus niger foi comercialmente introduzida (SELLE, P. H.;

RAVINDRAN, V., 2008). Desde então, culturas fúngicas têm sido amplamente

utilizadas para produção de fitase principalmente por seus altos rendimentos e

tolerância a condições ácidas.

Shied e Ware, em 1968, buscaram atividade da fitase em mais de 2000

organismos isolados. A maioria produziu fitase intracelular. A atividade extracelular

de fitase foi observada em apenas 30, sempre em fungos filamentosos. Desses, 28

pertenciam ao gênero Aspergillus, um ao Penicillium e um ao Mucor. Dos 28 do

gênero Aspergillus, 21 pertenciam ao grupo Aspergillus niger (KEROVUO, J., 2000).

Howson & Davis, mais recentemente, examinaram mais de 84 fungos de 25

espécies para a produção de fitase extracelular capaz de hidrolisar fitato, da qual A.

ficuum NRRL 3135 mostrou possuir a enzima com mais alta atividade. A. oryzae

(Shimizu 1992), A. niger (Volfova et al. 1994, Ahmad et al. 2000), A. fumigatus

(Mullaney 2000), A. carbonarius (Al-Ashed & Duvnjak 1994), A. terreus (Mitchell et

al. 1997) são algumas fitases produzidas por Aspergillus. Rhizopus oryzae,

Rhizopus oligosporus e Rhizopus stolonifer também já foram descritas como

produtoras de fitase por Howson & Davis, bem como Trichoderma reesei por Nasi et

al. em 1999. Fungos termófilos como Thermomyces lanuginosus e Sporotrichum

thermophile produzem, segundo relatos de Berka et al. 1998 e Ghosh 1997, fitase a

65°C e 45°C respectivamente (ROOPESH, K et al).

A fitase de Aspergillus fumigatus é caracterizada como termo-resistente,

mantendo 90% da sua atividade inicial após ser aquecida a 100°C por 20 minutos.

Em comparação, a fitase de Aspergillus niger PhyA possui muito menos resistência

térmica, apesar se uma atividade específica maior e melhor perfil de pH.

Interessantemente, essas duas fitases apresentam homologia em 66% de suas

seqüências, além de estruturas cristalinas muito semelhantes (ZHANG, W. et al.,

2007).

A tabela abaixo consiste em parte de um estudo comparativo feito por Wyss et

al., em 1998, onde foram comparadas as atividades específicas da fitase de alguns

fungos e de E. coli, bem como alguns de seus valores de Km.

FONTE: WYSS, M. et al., 1999

Fitase Atividade específica

(U/mg) Km (µM)

Fitase de A. niger 102.5 < 5

Fitase de A. terreus 9A1 141.6 10.6

Fitase de A. terreus CBS 195.8 23.2

Fitase de A. fumigatus expressa em A. niger 26.5 ≤ 10

Fitase de A. fumigatus expressa em H. polymorpha 28.1 N.D

Fitase de A. fumigatus expressa em S. cerevisiae 23.4 N.D

Fitase de E. nidulans expressa em A. Niger 28.6 N.M.M

Fitase de E. nidulans expressa em H. polymorpha 33.1 N.D

Fitase de M. thermophila 41.8 -

Fitase de E. coli 811.2 N.D

N.M.M significa que não segue o comportamento de Michaelis-Menten N.D significa que não foi determinado

2.3.2. Bactéria

Poucas espécies selvagens de bactérias são utilizadas para produção de fitase,

principalmente devido ao baixo rendimento e por apresentarem uma faixa ótima de

pH não adequada ao sistema digestivo dos monogástricos. Por isso, a busca

concentra-se mais nas bactérias termo-ácidas-tolerantes. A atividade de fitases

podem ser intra ou extracelular. Quando estudada em Enterobacter sp. 4, 81,7% foi

detectada na fração extracelular, 4,4% na fração periplasmática, e o restante na

porção intracelular (ROOPESH, K et al).

Várias cepas bacterianas, geneticamente modificadas ou não, como

Lactobacillus amylovorus, E. coli, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Klebsiella sp.,

etc., têm sido empregada para síntese de fitase. Sreeramulu et al. (1996) descobriu

19 cepas bactérias acido-láticas do gênero Lactobacillus e Streptococcus produtoras

de fitase extra-celular. Várias delas exibiam atividade enzimática no meio

fermentado, mas Lactobacillus amylovorus B4552 produziu a maior quantidade de

fitase, variando entre 125±146 unidades/ml em SmF usando glucose e fosfato

inorgânico. Essas descobertas ganharam importância considerando que L.

amylovorus tem grande potencial em melhorar as qualidades nutricionais de cereais

e alimentos fermentados.

Uma espécie bacteriana que produz fitase extracelular foi isolada do solo

próxima a raízes de leguminosas e identificada como Enterobacter sp 4. Sunitha et

al. (1999) otimizou o meio de cultivo para a fitase recombinante de E. coli BL21,

obtendo a mais alta atividade de atividade, de 2250 U/l. Uma modificação de B.

subtilis produziu fitase celular com atividade de fitase extracelular de 2,0

unidades/ml, a qual constituía mais de 90% da proteína total produzida. O

rendimento foi 100 vezes maior quando comparado com a espécie selvagem de B.

amyloliquefaciens DS11. A utilização de Bacillus sp. KHU-10 produziu o mais alto

nível de fitase extracelular, de 0,2 unidades/ml após quatro dias de fermentação em

condições ótimas e com maltose como substrato, segundo Choi et al., 1999

(PANDEY, A, 2001).

2.3.3. Levedura

A produção de fitase por leveduras é geralmente feita em sistemas SmF. As

cepas produtoras incluem Schwanniomyces castellii, S. occidentalis, Hansenula

polymorpha, Arxula adeninivorans, Rhodotorula gracilis, Pichia spartinae, P.

rhodanensis, P. anomala (PANDEY, A, 2001, ROOPESH, K et al). Em cultivo

contínuo usando cepas de S. castellii, a produção de fitase melhorou com aumento

de pH e taxa de diluição, e decaiu quando a concentração de ácido fítico ou fosfato

aumentou. Mayer et al. (1999) desenvolveu um sistema eficiente e de baixo custo

para produção de fitase com Hansenula polymorpha. Glucose ou xarope de glucose

foi utilizado como fonte principal de carbono durante a fermentação, reduzindo em

80% os custos quando comparado à utilização de glicerol. Além disso, altas

concentrações da enzima ativa (até 13.5 g/l) foram encontradas no meio, onde a

fitase representava mais de 97% do total protéico acumulado. Esses níveis de

concentração ultrapassam de longe qualquer outro sistema de produção de fitase

por leveduras até então desenvolvido (PANDEY, A, 2001).

3. PRODUÇÃO

3.1. MÉTODOS DE PRODUÇÃO

3.1.1. A partir de fontes microbinas

Embora fitases possam ser obtidas de várias fontes como descrito

anteriormente, a necessidade comercial para a indústria de alimentação animal é

geralmente encontrada pela produção através de fontes microbianas. Ambas as

fermentações, a submersa (SmF) como a de estado sólido (SSF), têm sido

empregadas para a produção de fitase. A natureza dos substratos, a disponibilidade

dos nutrientes, o tipos da linhagem, as condições de cultivo são fatores críticos que

afetam o rendimento e devem ser considerados criticamente para a seleção de uma

técnica particular. As condições de cultura e o genótipo da linhagem podem afetar a

taxa de transferência de massa. A maioria dos estudos de fermentação submersa

tem empregado as linhagens de Aspergillus sp. Como organismos produtores,

principalmente o A. ficcum. Outras linhagens utilizadas são Mucor sp. e Rhizopus sp.

Geralmente resíduos agro-industriais têm sido utilizados como substrato, como

canola, bagaço de coco, farelo de trigo, e outros. Dependendo da natureza do

substrato, a umidade inicial de substrato pode estar entre 53-64%. A suplementação

do meio, com fontes de carbono adicionais, como glucose em baixas concentrações

(6g/L) e surfactantes como Na-oleato ou Tween 80, pode ser útil para a síntese

enzimática. A linhagem de M. racemosus forneceu o maior rendimento (14,51 IU/g

de atividade de fitase em matéria seca) em bagaço de coco. A produção de fitase foi

aumentada para 26 IU/g em matéria seca quando o bagaço de coco foi

suplementado com glucose, caseína e sulfato de amônio.

O uso de materiais inertes tem sido considerado útil no processo de

fermentação no estado sólido por oferecer vantagens nos processo a down stream.

GAUTAM et al (2002) utilizou esferas de poliestireno para a produção de fitase por

uma linhagem de fungo e reportou potenciais benéficos do uso das esferas sobre

substratos convencionais como o farelo de trigo.

PAPAGIANNI et al. (2000) estudou a produção de fitase usando uma linhagem

A. niger em fermentação submersa e fermentação em estado sólido. Em ambos os

casos a adição de liberação lenta de uma fonte de fosfato orgânico aprimorou a

produção de enzima. O substrato sólido contendo uma combinação de farelo de trigo

e farelo de soja considerando meio de fermentação submersa contendo amido de

milho, glucose, peptona e sais como KCl, CaCl2, MgSO4, KH2PO4. O pH inicial do

meio era de 5,0-5,3, mas a adição de farelo de trigo resultou em pH de 5,5-5,8. Para

a cultura bacteriana de Enterobacter sp., a qual produz fitase, o pH ótimo foi de 5,5

(YOON et al., 1996).

A fermentação submersa tem sido utilizada para a produção de fitase usando

geralmente culturas de bactérias ou leveduras, embora linhagens de fungos tenham

sido bem empregadas. NAMPOOTHIRI et al. (2004) estudou a produção de uma

fitase termoestável de Thermoascus auranticus em fermentação submersa, sendo

farelo de trigo a fonte de carbono suplementado com diferentes mono-, di e

polissacarídeos como: glucose, sacarose, amido, e outros. A adição de glucose e

amido foram úteis para melhorar a produção da enzima, assim como a adição de

Tween 20 (2%). Dentre as bactérias lácticas usadas por SREERAMULU et al. (1996)

a linhagem Lactobacillus amylovorus B4552 foi a melhor, a qual produziu 125-146

unidades de fitase por mL em meio de glucose suplementado com fósforo

inorgânico. KIM et al. (1999) verificou que uma cepa modificada de B. subtilis

produziu fitase (2 U/mL) e o rendimento foi 100 vezes maior que o de B.

amyloliquefaciens selvagem DS11. Outra linhagem de Bacillus sp., KHU-10,

produziu fitase extracelular (0,2 U/mL) em meio de maltose, peptona e extrato de

carne depois de 4 dias de incubação (CHOI et al., 1999).

A produção de fitase usando a cultura de leveduras aumentou com a taxa de

diluição e o pH em cultura contínua utilizando S. castelli, enquanto o rendimento

decaiu quando o conteúdo de fosfato foi aumentado. MAYER et al. (1999)

desenvolveu um processo eficiente de baixo custo para a produção de fitase. Esse

processo utiliza Hansenula polymorpha, cultivada com glucose e xarope de glucose

principalmente como fontes de carbono ao invés de glicerol. Excepcionalmente, altos

títulos de enzima foram obtidos (acima de 13,5 g/L) com fitase, representando mais

de 97% do total de proteínas. A composição do meio e a morfologia do fungo afetam

a produção de fitase na fermentação submersa.

SUNITHA et al. (1999) otimizaram os componentes do meio para a produção

de uma fitase recombinante por E. coli usando uma metodologia de superfície de

resposta. O efeito combinado dos componentes do meio (triptona, extrato de

levedura e NaCl) foi bem compreendido pelo uso de um design experimental e

também foi encontrado que a adição de glucose no meio influencia grandemente a

produção de fitase. O meio otimizado com glucose resultou em uma atividade de

fitase de 2250 U/mL. Outra otimização estatística dos componentes do meio foi

conduzida usando a metodologia de superfície de resposta para reforçar a produção

de fitase usando uma linhagem de levedura, Pichia anômala (VOHRA &

SATYANARAYANA, 2002). (ROOPESH, K et al.)

3.1.2. A partir de plantas trangênicas

Muitas tentativas foram feitas para usar plantas transgênicas como hospedeiros

de expressão para fitases. Plantas transgênicas podem conter atividade de fitase

suficiente para substituir a suplementação adicional da alimentação com fitases

microbianas. Alternativamente, plantas transgênicas poderiam ser usadas como

biorreatores para a produção de fitases como suplemento.

Fitases fúngicas, como a Phy A de A. niger, têm sido expressas com sucesso

no tabaco (PEN et al., 1993; VERWOERD et al., 1995; ULLAH et al., 1997), trigo

(BRINCH-PEDERSEN et al., 2000) e canola (PONSTEIN et al., 2002). No tabaco, a

enzima foi secretada no apoplasto na falta de uma via de secreção e acumulada a

aproximadamente 14% do total de proteína solúvel (VERWOERS et al., 1995).

Fitase recombinante purificada expressas em folhas de tabaco têm a mesma

temperatura ótima para a hidrólise de fitato, mas foi menos glicosilada e mostrou

uma moderada tendência para pH ótimo mais ácido (ULLAH et al., 1999). Também,

as fitases recombinantes expressas em soja e alfafa têm quase as mesmas

propriedades como fitases endógenas produzidas por fungos, exceto pelo padrão de

glicosilação (LI et al., 1997; ULLAH et al., 2002). A fitase de A. niger produzida em

sementes de tabaco foi funcional em liberar fosfato da ração animal sobre condições

padrão simuladas e as sementes puderam ser armazenadas por pelo menos 1 ano

sem perder a atividade (PEN et al., 1993). Em ensaios de alimentação, fitases foram

recombinantemente produzidas em sementes de canola e soja tendo a mesma

performance que as fitases microbianas (DENBOW et al., 1998; ZHANG et al.,

2000). No entanto, a tolerância térmica da fitase de A. niger não seria suficiente para

suportar o calor encontrado na produção de farelo de soja. Na abordagem de

GUTKNECHT (1997), a planta de alfafa foi utilizada como um biorreator e não

valorizada como um alimento animal. A maioria das fitases produzidas

transgenicamente foi contida no suco coletado após o processamento da alfafa.

Nenhuma fitase fúngica foi produzida em plantas. Os genes de fitase de E. coli

(appA) e da bactéria ruminal Selenomonas ruminantium (SrPf6) foram expressas em

sementes de arroz germinadas. A atividade da fitase atingiu 1,4 U.mg-1 da proteína

celular extraída, que representou 60 vezes a atividade dos não transformados, sem

qualquer efeito adverso no desenvolvimento da planta (HONG et al., 2004). A

expressão de fitase do B. subtilis no citoplasma de tabaco ainda aumentou o número

de flores e frutos. (YIP et al., 2003).

Plantas transgênicas ou não serão usadas para a produção de fitases comerciais no

futuro, seja para a alimentação ou como biorreator, dependerá dos custos de

produção e aceitação pública da biotecnologia verde. (HAEFNER, S. et al., 2005)

3.2. PURIFICAÇÃO

Genericamente fitases são purificadas por precipitação com solventes ou sais,

seguida de cromatografia, como a de troca iônica e a de gel filtração. Ultrafiltração

poderia também ser usada em combinação com a cromatografia. A fitase

extracelular de B. subtilis (natto) N-7 foi purificada 322 vezes para homogeneidade

por ultrafiltração e uma combinação de colunas cromatográficas sephadex G-100 e

DEAE – Sepharose CL – 6B (SHIMIZU, 1992). A fitase extracelular de Bacillus sp.

DS11 foi purificada para homogeneidade por precipitação por acetona e colunas

cromatográficas fenil-sepharose e Superose 12 (KIM et al., 1998). A fitase de E. coli

foi purificada usando precipitação por sulfato de amônio (25 a 80% de saturação),

seguida por cromatografia em CM-sepharose CL6B, DEAE-sepharose CL6B, fenil

sepharose CL4B e MonoS HR, 5/5 (GREINER et al., 1993). GOLOVAN et al. (2000)

purificou a fitase de E. coli, a qual foi mais separada por chromatofocusing em duas

isoformas de tamanhos idênticos com pontos isoelétricos de 6,5 e 6,3. TAMBE et al.

(1994) purificou fitase de K. aerogenes usando cromatografia de troca iônica em DE-

52 seguida de gel filtração em coluna sephadex G-200. Outra fitase de Klebsiella

oxytoca MO-3 foi purificada 400 vezes e parcialmente caracterizada.

NAGASHIMA et al. (1999) purificou a fitase de A. niger SK-57 para

homogeneidade em quatro passos, usando cromatografia de troca iônica (2 passos),

gel filtração e chromatofocusing. SDS-PAGE dessa amostra purificada mostrou uma

única banda de massa molecular de aproximadamente 60 kDa. Uma fosfatase ácida

foi purificada de A. ficum NRRL 3135 por gel filtração e cromatografia de dextran

troca iônica (IRVING et al., 1974). PASAMONES et al. (1997) concentrou a fitase de

A. fumigatus super-expressa em A. niger NW205 aproximadamente 50 vezes por

ultrafiltração seguida por cromatografia de troca iônica. Fracionamento por acetona

(60%, v/v), gel filtração em G-100, seguida de cromatografia de DEAE-celulose foi a

técnica utilizada por WANG et al. (1980) para a purificação de fitase de A. oryzae

NRRL 1998. GHARIEB (1990) purificou com sucesso a fitase de A. carneus 43

vezes de culturas filtradas por precipitação por acetona, gel filtração através de

sephadex G-75 e cromatografia de troca iônica em DEAE-celulose. Uma fitase

parcialmente purificada foi obtida de A. adeninivorans por filtração em sephadex G50

e/ou cromatografia DEAE (SANO et al., 1999).

Um método de purificação de três estágios incluindo cromatografia aniônica e

de gel filtração foi utilizada para concentrar a fitase de S. castelli (SEGUEILHA et al.,

1992; LAMBRECHTS et al., 1993). Uma fitase de Cândida krusei Wz-001 foi

purificada para homogeneidade eletroforética por cromatografia de troca iônica,

cromatografia de interação hidrofóbica e gel filtração. Colunas Superdex 75pg e fenil

Sepharose HP foram utilizadas para isso (QUAN et al., 2002). (ROOPESH, K et al.)

3.3. EXPRESSÃO HETERÓLOGA

A fim de se obter processos de grande produção com menor custo vêm se

aplicando técnicas de DNA recombinante. Mesmo que na prática a obtenção desse

DNA recombinante não seja tão fácil quanto parece, rendimentos satisfatórios de

proteínas recombinantes são alcançados. O fragmento de DNA (1,4 kbp) contendo o

gene de produção da fitase foi inserido no vetor de expressão pPICZalpha A e

expressa em Pichia pastoris, que resulta em altos níveis de expressão de fitase

extracelular (RODRIGUEZ et al. 2000). De forma parecida, o gene da fitase de A.

niger (phyA) foi expressa em S. cerevisiae. Nesse caso, o vetor de expressão

utilizado foi pYES2. A fitase expressa tinha massa molecular de 120kDa devido a

glicosilações, além de apresentar termoestabilidade. O gene phyA de A. niger var

awamorri ALKO243 foi clonada e seqüenciada e a sua re-introdução resultou numa

superprodução de fitase (PIDDINGTON et al. 1993).

Gist-Brocades clonou múltiplas cópias de A. niger NRRL 3135 phy A em seu

PluGBug system, produzindo altos níveis de fitase, e passou a comercializar o

produto como Natuphos® (VAN DIJCK 1999). A Novo Nordisk está produzindo uma

fitase comercial sob o nome de Bioffed phytase®. Este produto é resultado da

clonagem do gene codificante de fitase de Peniophora lycii (um basidiomiceto) e

sendo superexpressado em A. niger. O gene phyA do fungo termofílico

Thermomyces lanuginosus foi inserido em um vetor de expressão com controle

transcripcional do promotor do gene codificante de tripsina de Fusarium oxysporum

e o produto recombinante obtido retém sua atividade em 75°C. O gene codificante

de fitase phyC foi clonado da biblioteca genômica de B. subtilis VTT E-68013 e o seu

seqüenciamento não demonstrou qualquer homologia com as fitases ou fosfatases

conhecidas, apesar de exibir atividade de fitase (KEROVUO et al. 1998). O gene

codificante de fitase de Bacillus sp. DS11 foi clonado em E. coli e a massa molecular

da proteína recombinante foi estimada em 41,80 kDa, segundo KIM et al. 1998.

Novos conceitos na biotecnologia de plantas usando engenharia de plantas

transgênicas para produção de enzimas em escala industrial têm sido aplicados na

produção de fitases. O gene phyA de A. ficuum (441 aminoácidos) foi expressa em

folhas de Nicotiana tabacum. A temperatura ótima da proteína recombinante

permaneceu a mesma enquanto o pH ótimo foi alterado de 5 para 4. ULLAH et al,

em 2002, clonou o gene da fitase de A. ficcum e expressou em plantas “alfa-alfa”. A

enzima expressa foi purificada, e exibiu todas as propriedades da enzima fúngica. O

gene da fitase de A. niger NRRL 3135 tem sido expressa na soja, mas a fitase

recombinante tem menor massa molecular em relação à enzima nativa fúngica.

Tem-se buscado a clonagem e expressão de fitases fúngicas em animais. O

gene codificante de fitase appA de E. coli foi clonado em camundongos e regulado

para expressão nas glândulas salivares. A fitase salivar dos camundongos

transgênicos reduziu o fósforo fecal em 11% (GOLOVANT et al. 2001). (ROOPESH,

K et al.)

3.4. CONDIÇÕES FÍSICO-QUÍMICAS DO PROCESSO

Propriedades das enzimas são importantes na determinação de seu uso

potencial nas aplicações industriais. Fitase é uma enzima éster hidrolisante com

uma massa molecular estimada de 35-700 kDa dependendo da fontes de origem. As

distintas formas moleculares das fitases obtidas de diferentes fontes exibem

diferenças nas propriedades físico-químicas como a constante de Michaelis (Km),

pH ótimo e a termoestabilidade. (ROOPESH, K et al.)

3.4.1. Temperatura

A temperatura ótima para fitases está na faixa de 25 a 80ºC, e pode variar

dependendo da fonte como entre 50 e 60ºC para fitases de A. carbonarius (AL-

ASHEH & DUVNJAK, 1994), Klebsiella aerogenes (TAMBE et al., 1994),

Enterobacter sp.4 (YOON et al., 1996), Selenomonas ruminantium (YANKE et al.,

19999) e 70 e 80ºC para Bacillus sp. DS11 (KIM et al., 1998a), S. castelli

(SEGUEILHA et al., 2000). No entanto, fitases de Aerobacter aerogenes e Candida

krusei Wz-001 mostraram temperaturas ótimas entre como 25 e 40ºC,

respectivamente (GREAVES et al., 1967; QUAN et al., 2002).

Dentre os fungos termofílicos, Termomyces lanuginosus tem a atividade de

fitase ótima em 65ºC (BERKA et al., 1998) e Sporotrichum thermophile em 45ºC

(GHOSH, 1997). Fitases de fungos mesófilos como A. fumigatus e A. niger NRRL

3135 mostraram atividade ótima em 37ºC (PASAMONTES et al., 1997) e em 55ºC

(HOWSON & DAVIS, 1983), respectivamente. Nota-se que as fitases de mesófilos

geralmente mostraram temperatura ótima na faixa termofílica.

A termoestabilidade da fitase é considerada importante e é um critério útil para

aplicações industriais. Fitases termoestáveis de diferentes fontes mostram graus

distintos de estabilidade ao calor e meia vida em temperaturas elevadas (80ºC e

acima) (PANDEY et al., 2001ª; RODRIGUES et al., 2000; KIM et al., 1999ª). A fitase

produzida por Thermoascus auranticus foi a termoestável cuja temperatura ótima era

55ºC. No entanto, 80% da atividade ainda permaneceu quando a temperatura foi

mudada para 70ºC (NAMPOOTHIRI et al., 2004). Uma fitase extremamente

termoestável de A. fumigatus foi reportada por PASAMONTES et al. (1997), que era

capaz de resistir a temperaturas acima de 100ºC por um período de 20 minutos com

perda de somente 10% da atividade enzimática inicial. Ela foi denominada como a

primeira fitase altamente termoestável. (ROOPESH, K et al.)

3.4.2. pH

A maioria das fitases está ativa dentro de uma faixa de pH de 4,5 a 6,0 e a

estabilidade da enzima decresce dramaticamente em valores de pH abaixo de 3 ou

acima de 7,5. Fitases de fungos mostram pH ótimo entre 4,5 e 5,5 e as originárias

de bactérias têm pH ótimo entre 6,5 e 7,5. A fitase de Aerobacter aerogenes

(GREAVES et al., 1967), Pseudomonas sp. (IRVING & COSGROVE, 1971), E. coli

(GREINER et al., 1993), Lactobacillus amylovorus (SREERAMULU et al., 1996)

mostraram pH ótimo na faixa entre 4 e 5,5. Enterobacter sp.4 (YOON et al., 1996) e

Bacillus sp. DS11 (KIM et al., 1998ª) exibiram atividade de fitase com pH ótimo na

faixa da neutralidade (7,0 a 7,5). A linhagem mesófila A. niger NRRL 3135 produziu

duas fitases diferentes designadas como phyA e phyB, uma com pH ótimo de 5,5 e a

outra com 2,0, respectivamente (HOWSON & DAVIS, 1983). A fitase de A.

carbonarius produzida em fermentação no estado sólido teve pH ótimo de 4,7 (AL-

ASHEH & DUVNJAK, 1994), R. oligosporus tinha um pH de 4,5 (SUTARDI &

BUCKLE, 1988). Fitases de leveduras foram encontradas tendo um pH ótimo de 4 a

5 quando medido em uma temperatura de 50 a 60ºC, enquanto que a 37ºC, muitas

linhagens produziram outra fitase com pH ótimo de 3 a 4 (QUAN et al., 2002).

(ROOPESH, K et al.)

3.4.3. Íons metálicos

A exigência de íons metálicos para a atividade da fitase difere dependendo das

fontes. Uma fitase extracelular purificada ativamente de B. subtilis (natto) N-77 era

grandemente inibida por EDTA, Zn2+, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+ e Al3+(SHIMIZU, 1992).

KEROVUO et al. (1998) purificou uma fitase da linhagem VTTE-68013 de B. subtilis,

que exigiu cálcio para sua atividade e/ou estabilidade e era prontamente inibida por

EDTA. KEROVUO et al. (2000) estudou a exigência de íons metálicos pela fitase de

B. subtilis. A remoção de íons metálicos da enzima pelo EDTA resultou na completa

inativação da enzima. A perda da atividade da enzima foi principalmente devido à

mudança conformacional, como o espectro de dicroismo circular (circular dichroism)

da holoenzima e a enzima empobrecida de metal foi diferente.A enzima estava

habilitada a restaurar parcialmente a conformação ativa quando incubada na

presença de cálcio, considerando que somente a menor reatividade foi detectada

com outro íon metálico divalente e as combinações. Por isso, concluiu-se que para a

conformação ativa da fitase de B. subtilis o cálcio é essencial. A fitase de Bacillus sp.

DS11 foi fortemente inibida por EDTA, Cd2+ e Mn2+ e moderadamente inibida por

Hg2+, Mg2+, Ba2+ e Cu2+ (KIM et al., 1998ª), enquanto a atividade da fitase de

Selenomonas ruminantium foi fortemente inibida pela presença de íons como Fe2+,

Fe3+, Cu2+, Zn2+ e Hg2+ (YANKE et al., 1999). Em ambos os casos, a concentração

do íon metálico na mistura de reação foi a mesma (5mM). Esse padrão de

sensibilidade foi similar ao da E. coli e K. terrigena (GREINER et al., 1993;

GREINER et al., 1997) e A. ficuum (ULLAH & CUMMINS, 1988). Uma purificação

parcial da fitase de Klebsiella oxytoca MO-3 foi fortemente inibida por NaF, Zn2+,

Fe2+ e Cu2+, mas não por EDTA ou N-etilmaleimida (JAREONKITMONGKOL et al.,

1997).

A fitase extracelular da linhagem mesófila de A. niger foi inibida por íons Cu2+,

Zn2+, Hg2+, Sn2+, Cd2+ e foi ativada por íons Ca2+, Mg2+ e Mn2+ (DVORAKOVA et al.,

1997). A fitase de S. catelli foi fortemente inibida por 5 mM de íons Zn2+ e Cu2+,

enquanto a presença de 5 mM de Ca2+, Mg2+, Mn2+ e Fe2+ resultou somente em

ligeira inibição. Os cátions Zn2+ e Cu2+ (0,5 mM) causaram cerca de 50% de inibição

da atividade (SEGUEILHA et al., 1992). A atividade da fitase de Cândida krusei Wz-

001 foi completamente inibida por Zn2+ e fortemente inibida por Mg2+. Nenhuma

inibição significante foi observada na presença de Ba2+ e Pb2+. Aumentando a

concentração de Fe2+ (para 5 mM) resultou em recuperação da atividade da fitase.

EDTA e oxalato não têm nenhum efeito inibitório na enzima purificada e foram

inibidos por agentes de SH, como iodoacetato e p-cloro mercuribenzoato (pCMB),

mas estimulados por 2-mercaptoetanol e ditiotreitol (DTT). Isso mostrou que os

grupos SH participam no sítio ativo da enzima. (QUAN et al., 2002). A enzima foi

sensível à presença de reagentes específicos de serina, como fenil metil sulfonil

fluorero (PMSF). (ROOPESH, K et al.)

3.4.4. Especificidade do substrato e cinética

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