Fitase - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Fitase - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da Fitase, Características moleculares, Propriedades estruturais e seqüenciamento, imobilização.
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1

Fitases geralmente mostram ampla especificidade de substrato, com maior

afinidade por fitato (VOHRA & SATYANARANA, 2002). A especificidade de

substrato pela fitase pode variar, devido às diferenças nas características

moleculares das enzimas purificadas de diferentes fontes (LIU et al., 1998). Por

testes com fitato é possível distinguir fitase de fosfatase ácida, que é incapaz de

degradar fitato (KONIETZNY et al., 1995). A fitase de Bacillus sp. DS11 foi muito

específica para fitato e tinha pouca ou nenhuma atividade éster de fosfato como o p-

nitrofenil fosfato, ATP, ADP, AMP, β-glicerofosfato, pirofosfofosfato e α-naptil fosfato

(KIM et al., 1998a). Fitase de Pseudomonas sp. não mostrou atividade frente a

pifosfofosfato inorgânico, β-glicerofosfato, ADP ou AMP e a atividade para p-

nitrofenil fosfato foi de 14% daquela em fitato (IRVING & COSGROVE, 1971).

Fitases de A. niger, A. terreus CBS e E. coli menos específica para ácido fítico,

enquanto as de A.fumigatus, E. nidulans e M. thermophila exibiram uma ampla

especificidade de substrato (WYSS et al., 1999).

Geralmente, a taxa de hidrólise enzimática é expressa como a cinética de

Michaelis-Menten, ou seja, a liberação de fosfato (Pi) pela fitase é dependente da

concentração de substrato usada. A constante de Michelis (Km) para a hidrólise de

fitato de sódio pela fitase da semente de mung (tipo de arbusto indiano) foi de 0,65

mM e foi similar a enzima de B. subtilis (0,5 mM) (SHIMIZU, 1992), sementes de

canola (0,36 mM) (HOUDE et al., 1990), sementes de algodão (0,37 mM)

(VALIKHANOV et al., 1981). Valores de Km comparativamente menores foram

determinados para fitases de A.ficuum (40 mM) (ULLAH & GIBSON, 1987) e S.

castelli (38 mM) (SEGUEILHA et al., 1992).

Fosfatos inorgânicos causam inibição de produto (inibição competitiva) da

hidrólise de fitato (GREINER et al., 1993; HOWSON & DAVIS et al., 1983). A inibição

de substrato poderia ser observada em concentrações de fitato maiores que 1,2 m

para fitase de A.ficuum (ULLAH, 1988) e inibições similares para fitases de soja e

raízes de milho e foram encontradas as concentrações de 20 mM e 300 mM,

respectivamente (HUBEL et al., 1996). Também foi observado que a presença de

substrato junto com a enzima previne a desnaturação térmica da enzima em

temperaturas acima da temperatura ótima. (ROOPESH, K et al.)

3.4.5. Características moleculares

3.4.5.1. Massa molecular

Fitases são proteínas de elevada massa molecular variando de 40 a 500 kDa.

Elas podem ser um monômero, como a de Selenomonas ruminantium, com 46 kDa

(YANKE et al., 1999); a de B. subtilis, com 35,6 kDa (POWAR & JAGANATHAN,

1982), 36 kDa (SHIMIZU, 1992); a de C. krusei Wz-001, com 330 kDa (QUAN et al.,

2002). E também podem ser tetrâmeros de Schwanniomyces castelli com 490 kDa

(SEGUEILHA et al., 1992) (ROOPESH, K et al.).

3.4.5.2. Propriedades estruturais e seqüenciamento

As características catalíticas, bem como as propriedades das interações da

enzima com o substrato só podem ser entendidas através de estudos feitos a níveis

moleculares. Vários métodos como difração de Raio-X / técnicas de espalhamento

de luz, analise da cristalografia, sequênciamento químico e etc. tem sido explorados

para o melhor entendimento dos sítios catalíticos e da própria seqüência de

aminoácidos.

Baseada no seqüenciamento químico, a estrutura primária da fitase de A.

ficuum foi elucidada por ULLAH (1988) e ULLAH & DISCHINGER (1993). A fitase de

A. ficcum contém 594 resíduos de aminoácidos, dos quais 37% são apolares, 42%

polares, 11,5% ácidos e 9,5% básicos. A estrutura secundária da enzima de A.

ficuum e de A. niger é constituída de 17,3% de α-hélices, 29% de folhas β, 32,6% de

dobras e 24,7% de coils (ULLAH et al., 1994). Tem-se sugerido que o triptofano tem

papel essencial na atividade enzimática da fitase de A. ficuum. Também foi

demonstrado que pontes dissulfeto no sítio ativo são cruciais para manutenção da

estrutura geométrica, e a enzima perde completamente a atividade após redução

das pontes dissulfeto por β-mercaptoetanol (ULLAH & MULLNEY, 1996). O gene

phy de A. niger foi clonado e caracterizado por VAN HARTINGSVELDT et al., em

1993, cujo produto continha 10 possíveis sítios de glicosilação. Também foi

demonstrado que certas regiões do gene clonado aumentaram a atividade da fitase

mais de 10 vezes. Fitase de Emericilla nidulans contém 463 aminoácidos, enquanto

a de T. termophilus contém 466 aminoácidos.

A seqüência da fitase de B. subtilis consiste de 383 resíduos que não

apresentam homologia com qualquer fitase ou fosfatase conhecidas. A estrutura

cristalina da fitase de E. coli foi determinada utilizando técnicas de difração e

espalhamento da luz. HA et al., em 1999, começaram os estudos de uma nova fitase

de B. amyloliquejaciens através da cristalografia de Raio-X. A enzima possui

termoestabilidade, fortemente ligada a íons cálcio (ROOPESH, K et al.).

4.5- IMOBILIZAÇÃO

Após a imobilização por variadas técnicas, a maioria dos autores observaram

que as condições de pH para a enzima não foram modificadas, mas a imobilização

possibilitou uma maior termoestabilidade. Em comparação com a fitase livre, a

imobilizada apresenta a mesma especificidade pelo substrato, sendo que a única

modificação que ocorre é com relação ao Km, que é maior para a enzima

imobilizada (PANDEY et al., 2001).

LIU et al. (1999) também comparou o efeito da imobilização da enzima com

relação à temperatura e pH ótimos de fitase de A. ficuum. O pH ótimo foi muito

próximo daquele encontrado para a enzima livre (pH 5). A explicação mais provável

para esse fato o gel de gelatina usado no experimento para fixar a fitase formou um

filme estável que formou um microambiente ao redor da enzima no qual o pH era

estável. A temperatura ótima de catálise aumentou de 50ºC (enzima livre) para 58ºC

(enzima imobilizada). A enzima imobilizada apresentava termoestabilidade até uma

temperatura de 70ºC.

Com relação à atividade da enzima, ao fazer a imobilização houve uma perda

de praticamente 66% da atividade em 60ºC. Isso se deve ao envolvimento da

enzima pelo gel, à diminuição da afinidade da enzima pelo substrato devido à uma

alteração na conformação da enzima durante a imobilização ou à dificuldade de

transferência de massa dentro do gel (LIU et al., 1999).

Figura 6- Comparação dos parâmetros cinéticos da enzima imobilizada e livre

Fonte: LIU et al., 1999.

MCKELVIE et al. (1995) usou um sistema com fitases imobilizadas para

determinar a liberação de fósforo pela enzima em amostras de águas naturais. Esse

pode ser um método para avaliação do grau de contaminação de águas por fósforo.

A fitase imobilizada apresentou grande estabilidade e podia ser estocada por vários

meses (PANDEY et al., 2001).

4. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

A determinação da atividade da fitase pode ser feita através da detecção

fotométrica dos íons fosfato liberados na hidrólise enzimática. Ela é realizada

através da medição de fosfomolibdato em acetona. Essa determinação foi definida

segundo o protocolo estabelecido por Heinonem e Lahti (1981) que está presente no

site da empresa Sigma-Aldrich. Primeiramente é necessário preparar previamente os

seguintes reagentes:

 Reagente A- Tampão glicina 200 mM, pH 2,8 à 37ºC (para PhyA e PhyB).

 Reagente B- Solução de ácido fítico 44,1 mM feita usando o tampão do

reagente A, pH 2,5 à 37ºC.

 Reagente C- Solução de molibdato de amônio 5% (peso/volume)

 Reagente D- Ácido sulfúrico 5N.

 Reagente E- Acetona

 Reagente F- Solução do reagente colorido: mistura-se 25 mL do reagente

C com 25 mL do reagente D e 50 mL do reagente E.

 Reagente G- Solução de fosfato de potássio 50mM

 Reagente H- Solução tampão A com a enzima fitase.

Adiciona-se os reagentes nos tubos nas quantidades listadas na tabela

abaixo, onde estão presentes o ensaio para o tubo do branco e o tubo de teste.

Tabela 1- Procedimentos

Teste (mL) Branco (mL)

Reagente B (ácido fítico) 0,5 0,5

Ambientação dos tubos à 37ºC.

Reagente H (enzima) 0,025 -

Reagente A (tampão) - 0,025

Agita-se e incuba-se à 37ºC por 30 minutos.

Reagente F (coloração) 4,0 4,0

Água deionizada 0,025 0,025

Agita-se os tubos e faz-se a leitura em espectrofotômetro à

400 nm

Também é necessário fazer a curva de calibração para determinação das

concentrações de fosfato liberado pela enzima. Para isso utiliza-se uma

concentração já conhecida de fosfato com o reagente G e prepara-se os seguintes

tubos:

Tabela 2- Curva padrão

S1 S2 S3 S4 S5 Branco

Água deionizada (mL) 0,04 0,03 0,02 0,01 - 0,05

Reagente G (mL) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 -

Reagente B (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Após 30 minutos de incubação à 37ºC, adiciona-se 4mL da solução F em

cada tubo e faz-se a leitura em 400nm. O fósforo inorgânico reage com o molibdato

de amônio, formando fosfomolibdato de amônio, que é reduzido a azul de

molibdênio cuja intensidade da cor é proporcional à concentração de íons fósforo

presentes na amostra. Faz-se então um gráfico plotando a absorbância medida

menos a absorbância do branco pela concentração de fosfato em μmoles. A

atividade enzimática é definida em U/mL:

Unidades de enzima = (μmoles de fosfato liberado) x (Fator diluição)

mL (30 minutos) x (0,025 mL de enzima)

Uma unidade de enzima corresponde à quantidade de enzima que libera um

μmol de fósforo inorgânico do fitato por minuto em pH 2,5 e temperatura de 37ºC.

A atividade também pode ser determinada segundo outro protocolo também

presente no site da Sigma-Aldrich utilizado por PEERS (1953) e por TAUSSKY e

SKORR (1953). Os reagente necessários são:

 Reagente A- Tampão de acetato e sódio 200mM, pH 5,15 à 55ºC (para

PhyC).

 Reagente B- Solução de sulfato de magnésio 100mM.

 Reagente C- Solução de ácido fítico 6,82mM.

 Reagente D- Solução de ácido tricloroacético 10% (volume/volume)

 Reagente E- Solução padrão de fósforo inorgânico 20μg/mL

 Reagente F- Solução de molibdato de amônio 10% (volume/volume).

 Reagente G- Solução colorida de Tausky-Schorr: mistura-se 10mL do

reagente F, 70mL de água deionizada, 5g de sulfato de ferro heptahidratado;

após dissolução, completa-se o volume para 100mL com água destilada.

 Reagente H- Solução com a enzima fitase.

O teste é feito adicionando 5mL de água destilada, 10mL da solução A, 0,4mL

da solução B, 4,4mL da solução C e incubando a mistura à 55ºC por alguns minutos.

Então adiciona-se 0,2mL do reagente H (enzima) e deixa-se a reação ocorrer à 55ºC

por aproximadamente 30 minutos. Depois de transcorrido o tempo, retira-se 2mL da

mistura e transfere-se para outro tubo, onde também é adicionado 1mL da solução

de TCA (a qual irá parar a reação), 2mL de água deionizada e 5mL do reagente G.

Agita-se o tubo e faz-se a leitura em espectrofotômetro à 660nm.

A curva padrão é feita utilizando concentrações de fosfato inorgânico de

acordo com a tabela abaixo:

Tabela 3- Curva padrão

Branco S1 S2 S3 S4 S5

Reagente E (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Água deionizada (mL) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1

Reagente D (mL) 1 1 1 1 1 1

Faz-se a curva padrão para poder-se determinar a quantidade de fosfato

inorgânico e calcula-se a atividade da enzima por:

Unidades de enzima = (μmoles de fosfato liberado) x (Fator diluição) x (20 mL da solução inicial)

mL (30 minutos) x (0,2 mL de enzima) x (2mL aliquotados)

Uma unidade de enzima corresponde à quantidade de enzima que libera um

μmol de fósforo inorgânico da solução do fitato por minuto em pH 5,15 e temperatura

de 55ºC.

BERRY e BERRY (2005) apresentaram um novo método para a determinação

da atividade da fitase. Eles utilizaram uma substância análoga ao ácido fítico, o 5-O-

[6-(benzoilamino)hexil]-D-mio-inositol-1,2,3,4,5,6-pentaquisfosfato (Figura 7), o qual

é cromóforo e permite uma medição direta da quebra da ligação éster em um HPLC

com detector de UV.

Figura 7- Ácido Fítico e análogo molecular (T-IP5)

Fonte: BERRY e BERRY, 2005.

Essa técnica pode ser empregada na detecção da atividade da fitase em

amostras de solo e água durante o screenig de algum microrganismo, pois utiliza um

substrato sintético possível de ser reconhecido durante a passagem na coluna de

cromatografia (Figura 8). Apesar de ser possível fazer uma quantificação da

atividade da enzima, quando há uma grande quantidade de testes são preferíveis os

outros dois métodos citados anteriormente (BERRY e BERRY, 2005).

Figura 8- Cromatograma em diferentes tempos de reação mostrando os

intermediários

Fonte: BERRY e BERRY, 2005.

Outro método interessante é a detecção da atividade da fitase através de

biossensores. MAK et al. (2004) utilizaram um biossensor constituído de piruvato

oxidase e um eletrodo de platina. A piruvato oxidase é imobilizada em uma

membrana. A fitase livre catalisa a reação com fitato e libera o fósforo, o qual

atravessará a membrana e chegará a piruvato oxidase imobilizada. Essa por sua

vez, irá utilizar o fosfato, o oxigênio e o piruvato para catalizar a sua reação,

liberando peróxido de hidrogênio, o qual será quantificado pelo eletrodo (Figura 9).

Esse método apresentou uma boa resposta linear para determinação da atividade

da fitase.

Figura 9- Determinação por biossensor.

Fonte: MAK et al., 2004.

5. APLICAÇÕES

5.1. Ração animal

Ruminantes digerem o fitato pela ação de fitases produzidas pela flora

microbiana do rúmen, sendo que o fosfato inorgânico hidrolisado do fitato é utilizado

tanto pelo ruminante quanto pelos microrganismos. Porém, essa situação é diferente

com animais monogástricos, como suínos, aves e peixes. Esses animais não são

capazes de metabolizar o ácido fítico, uma vez que eles não produzem, pelo menos

em quantidade suficiente, fitase gastrintestinal. Assim, fosfato inorgânico é

adicionado à ração para atender as necessidades fisiológicas do animal. Isso

aumenta o custo de produção e contribui para problemas ambientais relacionados

com o fosfato. A suplementação da ração animal com fitase permite a assimilação

do fosfato nos ingredientes da ração e diminui a presença deste nas fezes e

subseqüente contaminação do ambiente. O efeito da adição de fitase na ração

animal já foi quantificado. Se a fitase fosse adicionada na ração de todos os

monogástricos dos Estados Unidos, 8,23x104 toneladas de fosfato deixariam de

contaminar solo e água por ano.

A fitase Finase® adicionada à dieta a base de soja para suínos é capaz de

converter aproximadamente um terço da fração não-assimilável para assimilável,

segundo Cromwell et al. De forma similar atuam outros produtos como Allzyme

Phytase® e Natuphos®, para suínos e galinhas. Vários estudos com suínos e

galinhas confirmaram a possibilidade de substituir o fosfato inorgânico adicionado

por fitase microbiana em dietas ricas em fitato na criação de animais monogástricos.

Na Holanda, a fitase de A. niger tem sido utilizada de forma satisfatória, levando a

redução de 30% a 40% da poluição por fosfato, segundo Jongbloed et al., 1992.

Essa redução é mais significativa do que aquela obtida pela utilização de

detergentes livres de fosfato (KEROVUO, J., 2000).

A utilização da fitase como complemento de ração animal exige algumas

propriedades da enzima. Particularmente, e enzima precisa ser termoestável, pelo

fato de que numa das etapas da produção da ração, a temperatura pode atingir

90°C.

5.2. Alimentação Humana

Dietas ricas em fibras de cereais, legumes e proteína de soja resultam numa alta

ingestão de fitato. O fitato não digerido afeta negativamente a absorção de zinco,

cálcio, magnésio e ferro. Também reduz a digestibilidade de proteínas e podem inibir

enzimas digestivas. Utilizando Finase®, Simell e colaboradores reportaram em 1989

a produção de proteínas de soja livres de fitato com incremento na solubilidade em

pH baixo (pH 3). Anno et al. (1985) eliminaram o fitato do leite de soja usando fitase

de trigo. Adições da fitase de A. niger a farinha de trigo melhoraram a absorção de

ferro em humanos. Entretanto, mais estudos devem ser feitos antes da utilização de

fitase como aditivo na alimentação humana (KEROVUO, J., 2000).

5.3. Fosfato de mio-inositol

Vem aumentando o interesse em fosfatos de isositol e fosfolipídeos, que tem um

papel fundamental na sinalização transmembrana e mobilização de cálcio de

reservas intracelulares. Além disso, trifosfatos de inositol específicos podem prevenir

ou aliviar doenças ou quadros associados com níveis anormais de Neuropeptídio Y

(NPY). Entre outras, doenças inflamatórias como artrite e doenças respiratórias

como asma. Além disso, outras funções como hipocolesterêmicas e analgésica

também têm sido propostas para fosfatos de inositol específicos.

Surpreendentemente, ésteres trifosfatados de inositol têm demonstrado ação

inibitória significativa contra infecções retrovirais como HIV (KEROVUO, J., 2000).

As aplicações farmacêuticas acima mencionadas aumentaram

consideravelmente o interesse na preparação desses fosfatos de mio-inositol. A

síntese química de mio-inositol apresenta várias complicações e dificuldades,

incluindo a utilização de pressões e temperaturas extremas. Uma vez que a fitase

hidrolisa sequencialmente hexafosfatos de mio-inositol, a produção de seus

derivados ou de mio-inositol livre utilizando fitases é uma alternativa de síntese

química importante. Naturalmente, a hidrólise enzimática apresenta vantagens como

especificidade estérica e condições de reações mais brandas. Além disso, derivados

de fosfatos de mio-inositol podem ser usados como substratos enzimáticos em

reações metabólicas (KEROVUO, J., 2000).

5.4. Indústria de papel

Tem-se especulado que a remoção de ácido fítico de plantas pode ser importante na

indústria de papel. Uma fitase termoestável poderia ter um bom potencial como um

novo agente biológico para degradar ácido fítico nesses processos. A degradação

enzimática não produziria produtos carcinogênicos e subprodutos tóxicos. Assim, a

exploração das fitases nessas indústrias não prejudicaria o meio ambiente e ajudaria

no desenvolvimento de tecnologia limpas (KEROVUO, J., 2000).

6. INOVAÇÕES TECNOLÓGICAS

A seguir é apresentado um resumo de dois trabalhos que podem ser

considerados inovações dentro da tecnologia de produção de fitase. O primeiro tem

o título de “Recombinant, Rice-Produced Yeast Phytase Shows the Ability to

Hydrolyze Phytate Derived from Seed-Based Feed, and Extreme Stability during

Ensilage Treatment”, de HAMADA A. et al. O Segundo tem o título de “Pigs

expressing salivary phytase produce low-phosphorus manure”, de GOLOVAN S. P.

et al. Os dois artigos são exemplos de duas tendências de trabalho, não sendo os

únicos na área.

6.1. Fitase recombinante em arroz

Nos últimos anos, alguns estudos vêm surgindo com a idéia de expressar fitases

de diferente fontes microbiológicas, principalmente fungos e bactérias, em várias

espécies de plantas. Esse sistema de expressão apresenta algumas vantagens

consideráveis, como um menor custo relativo a produção, ao substituir o uso de

biorreatores complexos por um crescimento natural, além da economia de grandes

quantidades de energia de fontes fósseis. Além disso, algumas espécies de plantas

já são naturalmente introduzidas às rações para satisfazer outras necessidades

fisiológicas.

Arroz é uma das plantas mais atrativas para a superprodução de fitase, uma vez

que é cultivado numa vasta área pelo planeta (cerca de 1,55x108ha), e apresenta um

alto rendimento de biomassa na plantação. Geralmente toda a planta é ensilada

após a colheita para adição na ração de bovinos, e estudos recentes demonstram

que também pode ser utilizado nas rações suínas sem comprometimento do ganho

de peso quando é misturado com o aditivo de ração baseado em sementes até 5%

em base seca.

Em estudos anteriores, o mesmo grupo de pesquisadores testou algumas

variações dos plasmídios com o gene da fitase. A que apresentou os melhores

resultados foi utilizada no presente estudo. A fitase de Schawanniomyces

occidentalis foi transferido a plantas de arroz por um plasmídio chamado pModF, o

qual inclui a seqüência sinal de secreção do gene “rice chitinase-3” e a seqüência

inteira do gene da fitase da levedura sem qualquer alteração na seqüência de

aminoácidos. A atividade enzimática nas folhas frescas atingiu cerca de 5U/g-FW,

que é mais de 100 vezes superior à atividade encontrada nas folhas do arroz

selvagem.

Para testar a atividade enzimática “in vitro”, uma ração baseada em sementes

constituída de 75% de milho, 24% de farelo de soja descascado e 1% de arroz, foi

completamente moída. 0,18g deste material foi então transferido a um tubo de 2mL.

Em paralelo, 0,02g de folhas verdes de arroz moídas transgênicas (5,1U/g-FW) em

872µL de tampão acetato (40mM, pH5,5), foram adicionados ao tubo, num volume

total final de 1mL. Considerando a atividade inicial e a diluição, a atividade no tubo

foi marcada como 0,51U/g de ração. Essa mistura foi encubada a 37°C com

agitação. Após 30, 60, 120 e 240 minutos alíquotas foram retiradas do

sobrenadante, adicionado ácido sulfúrico para parar a reação e medida a atividade.

Para comparação, a ração também foi misturada a extratos de arroz selvagem e

fitases de leveduras comerciais com atividades de 0, 0,5 e 1,0U/g de ração.

A figura abaixo resume os resultados dessa etapa do experimento:

Medidas da atividade de fitase nas amostras de arroz transgênico (•), arroz selvagem sem adição da

enzima comercial (○), e arroz selvagem com adição de fitase comercial nas atividades finais de 0,5U/g (∆) e

1,0U/g (□).

Observa-se pela imagem que o arroz selvagem apresenta uma atividade

endógena de fitase que, ao final dos 240 minutos, atingiu o valor de 0,32µmol. A

atividade da amostra transgênica alcançou 1,55µmol de atividade, 4,84 vezes maior

que a variante selvagem, o que corresponde a 33,3% do total de fosfato ligado a

fitina. Essa porcentagem aumentou para 49% depois de 24 horas, não mostrado na

figura acima.

O comportamento semelhante a enzima comercial de atividade de 1U/g, embora

a atividade da enzima da amostra transgênica possuísse atividade inicial de 0,51U/g,

pode dever-se ao fato de que frações insolúveis não foram retiradas da amostra

transgênica durante a incubação, permitindo que enzima presa na fração insolúvel (e

portanto não apresentando atividade detectável) tenham se solubilizado durante

esse processo.

Além do teste de atividade acima descrito, o nível de estabilidade da atividade

também foi analisado. Amostras foram armazenadas a 4, 25 e 37°C por quatro

semanas, onde a cada semana uma amostra era retirada e sua atividade medida. As

figuras abaixo representam os resultados:

Termoestabilidade da fitase heteróloga durante armazenamento. Em A, mediu-se a concentração relativa

das proteínas solúveis durante armazenagem. Em B, a atividade de fitase no mesmo período. As

temperaturas foram de 4°C (○), 25°C(●) e 37°C (∆).

Observa-se pela imagem acima um relativo grau de termoestabilidade,

principalmente em temperaturas menores, se comparado a variação da solubilidade

das proteínas.

A estabilidade da atividade por longos períodos de tempo também foram

analisados, visto a necessidade do processo de ensilagem das plantas. Se elas

mantiverem a atividade por longos período de tempo, isso permitirá que elas sejam

usadas como aditivo nas rações, mesmo após o tempo de estocagem. Os resultados

são resumidos da figura abaixo.

Estabilidade da atividade da fitase heteróloga durante ensilamento.

Observa-se que mesmo após 12 semanas se ensilamento, não houve diminuição

da atividade. Embora o aumento de atividade entre a quarta e oitava semanas não

seja totalmente explicável, os autores suspeitam que devido ao processo

fermentativo da amostra tenha gerado uma condição ótima de temperatura (70°C).

Como conclusão, os autores destacaram que as propriedades da fitase

heteróloga são adequadas a sua utilização como aditivo em rações animais, tanto no

que se refere à capacidade de disponibilizar fosfato da fitina das plantas, quanto a

manutenção da atividade durante os períodos de estocagem. Contudo, os autores

ressaltaram que os efeitos in vivo ainda precisam ser analisados antes da utilização

efetiva dessa fitase.

6.2. Fitase de Escherichia coli expressa em suínos

Nesse trabalho, objetivou-se a criação de porcos transgênicos que

expressassem fitase de Escherichia coli em sua saliva. Para isso foram gerados 33

leitões, chamados de G0, utilizando o transgene PSP/APPA, que corresponde a um

promotor de secreção protéica da parótida (“Parotid secretary protein promoter”)

ligado ao gene da fitase de E. coli appA. A geração dos 33 leitões de G0 se deu por

microinjeção de 4.147 embriões pró-nucleares com uma eficiência de 0,8%. O

número de cópias do transgene foi de 35 por linhagem WA.

Desses 33 leitões (G0), 14 produziram fitase com atividade entre 5 e 6.000U/mL

de saliva no período entre 7 e 11 dias de idade. 15 apresentaram atividade inferior a

5U/mL, e 4 não apresentaram atividade detectável. Dos 53 leitões produzidos em

G1, 23 eram transgênicos (43,4%). Essa linhagem de porcos transgênicos

apresentou a mais alta atividade de fitase, que variou de 341U/mL a 10.077U/mL,

com uma mediana entre 2.000 e 3.00U/mL, que é entre 2 a 5 vezes maior que as

demais linhagens. Os autores destacam que essa medida da atividade na saliva

possui alguns problemas, incluindo variações na alimentação e hidratação dos

porcos antes da amostragem, bem como a própria flutuação na taxa de produção da

saliva.

Para determinar o grau de digestibilidade do fosfato pelo animal, 14 leitões da

linhagem G1 com atividade de fitase média de 2.420U/mL foram testados em testes

nutricionais feitos com farelo de soja com 53% de fitato, como sendo a única fonte

de fósforo na alimentação.

O quadro abaixo demonstra os resultados sobre a verdadeira digestibilidade de

fósforo nos animais, que corresponde ao percentual de fósforo digerido e absorvido

da dieta corrigida a liberação de fósforo dito endógeno liberado no trato intestinal,

resultado do próprio metabolismo do animal.

Verdadeira digestibilidade de fósforo (%) nos porcos transgênicos G1 usando farelo de soja como única

fonte de fósforo (a e b correspondem ao resultado estatístico de significância, com p < 0.01).

Observa-se que nos animais transgênicos a digestibilidade foi próxima de 100%

comparado com a digestibilidade próxima dos 50% para animais não transgênicos.

A figura abaixo compara as concentrações de fósforo nas fezes dos animais

transgênicos (□) e não transgênicos (■), em função da concentração do farelo de

soja na dieta.

Concentrações de fósforo nas fezes dos animais transgênicos G1 (□) e não transgênicos (■), em função da

concentração do farelo de soja na dieta.

O conteúdo de fósforo fecal dos animais transgênicos recém-desmamados e

após o período de crescimento foi reduzido em até 75% e 56%, respectivamente,

comprado ao conteúdo dos animais não transgênicos. Como já comentado, o fósforo

residual deve-se ao fósforo gerado no próprio metabolismo, ou fontes endógenas. O

conteúdo de fósforo maior nos animais em mais alto estágio de desenvolvimento foi

justificado pelos autores devido ao fato de que seus sistemas digestórios mais bem

desenvolvidos são capazes de quebrar matéria orgânica como polissacarídeos

diferentes do amido. As concentrações maiores nas dietas com menor quantidade

de farelo de soja foram justificadas pela menor diluição nos componentes não

digeríveis do farelo de soja. Variações no pH do material gástrico nessas diárias

também podem ter levado à obtenção desses resultados.

Também foi verificada a existência de atividade em vários tecidos dos animais, e

os resultados são expostos na tabela abaixo. Verifica-se a predominância de

atividade nos tecidos de glândulas que, em conjunto, produzem a saliva. Atividades

praticamente vestigiais foram encontradas em outros tecidos do sistema digestório,

como estômago e intestino.

Distribuição da atividade de fitase em tecidos dos porcos transgênicos G1

Outros resultados importantes mostraram que a fitase produzida pelo porco

transgênico possui massa maior do que aquela produzida pela E. coli, 50kDa contra

44,7kDa respectivamente, devido a existência de glicosilação na primeira. Assim

como a enzima não-glicosilada de E. coli, a fitase salivar reteve mais de 90% da sua

atividade após incubação em excesso de pepsina em pH 2,5 por 6h, mas apenas

10% da atividade se encubada com uma mistura de tripsina, quimotripisina e

elastase a pH 7 por 6h.

Como conclusão, destacou-se a grande variação da atividade presente na saliva dos

animais transgênicos, entre linhagens diferentes e mesmo dentro da mesma

linhagem, resultado da técnica de transgenia. Além disso, verificou-se o decréscimo

da atividade enzimática com o aumento da idade do animal, provavelmente ligado a

uma diminuição na atividade do promotor. Os estudos mostraram que a atividade

encontrada na saliva é suficiente para fornecer todo o fósforo necessário ao

metabolismo, e considerando a verdadeira digestibilidade encontrada (75%), esse

seria o máximo possível. Níveis maiores do que esse demandariam modificações

metabólicas. Também não foi detectado qualquer efeito deletério da expressão da

fitase na saúde e desempenho dos animais transgênicos.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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