FITASE2 - Apostilas - Biotecnologia, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

FITASE2 - Apostilas - Biotecnologia, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da Fitase, Produção em microrganismos, meios, Expressão heteróloga.
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FITASE

Produção

Produção

• Produção a partir de microrganismos; • Produção em plantas transgênicas

Produção em microrganismos • Atender a necessidade comercial da

indústria; • Utilização da SmF e SSF; • SmF é geralmente usada com bactérias

ou leveduras, porém é bem empregada com fungos.

• Emprego de linhagens de Aspergillus sp., principalmente A. ficuum;

Meios

• Resíduos agro-industriais: canola, bagaço de coco, farelo de trigo e outros.

• Suplementação do meio • Uso de materiais inertes • Com A. niger, a liberação lenta de fosfato

inorgânico melhorou a produção • Método de MAYER et al. (1999)

Produção em plantas transgênicas • Capazes de substituir a suplementação da

alimentação • Podem ser biorreatores • Fitases fúngicas expressas em tabaco,

canola e trigo • Em relação às microbianas, diferem no

padrão de glicosilação

• Fitase de A. niger, expressa em tabaco, foi capaz de liberar fosfato da ração animal

• Fitases recombinantemente produzidas para ensaios alimentares

• PROBLEMA: tolerância térmica da fitase de A. niger na produção de farelo de soja.

Expressão heteróloga • DNA recombinante • Vetores • Biblioteca genômica • Pichia pastoris, S. cerevisiae • Possibilidade de glicosilações

Purificação

• Genericamente: precipitação com solventes ou sais, seguida de cromatografia, podendo ser combinada a ultrafiltração.

• Técnicas: precipitação por acetona precipitação por sulfato de amônio cromatografia de troca iônica cromatografia de gel filtração cromatografia aniônica cromatografia de interação hidrofóbica e outras.

Parâmetros Físico-químicos

• Temperatura • pH • Íons metálicos • Especificidade de substrato e cinética • Características moleculares

Temperatura • Temperatura ótima entre 25 e 80ºC • Varia de acordo com a fonte

A. carbonarius: entre 50 e 60ºC Bacillus sp.: entre 70 e 80ºC

• Fitases de mesófilos com temperaturas ótimas na faixa termófila

• Fitases termoestáveis Fitase de A. fumigatus

pH • Maioria: ativas em pHs entre 4,5 a 6,0 • Perda de estabilidade em pH<3,0 e pH>7,5 • Fungos: pH ótimo entre 4,5 e 5,5 • Bactérias: pH ótimo entre 6,5 e 7,5 • Leveduras:

temperatura de 50 a 60ºC: pH ótimo de 4 a 5 temperatura de 37ºC: pH ótimo de 3 a 4

Íons metálicos • A exigência de íons metálicos para a

atividade varia de acordo com a fonte • Algumas são fortemente inibidas e outras

moderadamente inibidas • Algumas necessitam de cálcio • A perda de atividade é, principalmente

devido a mudança conformacional

Especificidade de substrato e cinética

• Ampla especificidade, preferência por fitato • Varia de acordo com as características

moleculares • Geralmente segue o comportamento cinético

de Michaelis-Menten • Fosfato inorgânico→inibição competitiva

Características moleculares

• Massa molecular: Podem apresentar monômeros com 35,6; 36; 46; 330 kDa Podem apresentar tetrâmeros com 490 kDa

• Propriedades estruturais e seqüenciamento Estudo a nível molecular Fitase de A. ficuum:

594 resíduos de aminoácidos triptofano tem papel na atividade

Pontes dissulfeto é essencial para a estrutura geométrica Gene de phy A. niger gerou produto com 10 possíveis sítios de glicosilação

IMOBILIZAÇÃO DA ENZIMA

IMOBILIZAÇÃO DA ENZIMA

Fonte: LIU et al., 1999.

• Sem alteração no pH ótimo.

• Aumento da termoestabilidade.

• Diminuição da atividade.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

MÉTODO DO FOSFOMOLIBDATO EM ACETONA

Teste (mL) Branco (mL)

Ácido fítico 0,5 0,5

Ambientação dos tubos à 37ºC.

Solução da enzima 0,025 -

Tampão - 0,025

Agita-se e incuba-se à 37ºC por 30 minutos.

Solução de molibdato de amônio, ácido sulfúrico e acetona

4,0 4,0

Água deionizada 0,025 0,025

Agita-se os tubos e faz-se a leitura em espectrofotômetro à 400 nm

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

Fonte: BERRY e BERRY, 2005.

• Análogo do fitato • Cromóforo permite análise

em HPLC com detector de UV. • Análise da atividade da fitase

em amostras de solo e água.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

• Biossensores

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