FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE IN-CULO_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE IN-CULO_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos frasco agitados e preparo de inóculo, tipos de tampa, agitadores, preparo de inóculo.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

12

Fonte: < http://www.nbsc.com >

Frascos normais sem chicanas apresentam um movimento de rotação bem

definido e uniforme e uma área de transferência gás-líquido bem definida. Isso

proporciona uma modelagem matemática do modelo e cálculo da área de

transferência. O cálculo de fatores em um frasco agitado é muito mais simples do

que em um cultivo em biorreatores devido à menor quantidade de variáveis, como

mostra a Figura 6. Em biorreatores, os fenômenos físicos como a formação de

bolhas, a dispersão dessas bolhas, a separação gás líquido no topo, a geração de

espuma, entre outros fatores devem ser levados em consideração. Já em frascos

agitados, muitos desses fatores não estão presentes, facilitando a determinação da

transferência de gases. Isso é de extrema importância no processo de seleção de

microrganismos, e por isso são utilizados geralmente frascos nessa etapa do

trabalho.

Figura 6- Comparação de fatores no cultivo em frascos e em fermentador.

Fonte: BÜCHS, 2001.

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Alguns frascos podem conter estruturas chamadas de chicanas (ou baffles),

que são geralmente invaginações na parede do vidro. Elas promovem um fluxo do

líquido em regime totalmente caótico, com condições de escoamento bastante

diversificadas.

A maior agitação do meio líquido devido à presença desses septos pode gerar

a formação de espirros de meio líquido na tampa do frasco. No caso de tampas de

algodão, que são as mais utilizadas, se ela estiver molhada devido a esses

respingos, haverá uma redução na permeabilidade de gás pelo tampão e poderá

ocorrer uma contaminação do meio. Se a velocidade de rotação em frascos com

chicanas gerar um valor de KLa antes da tampa fique molhada menor que o

encontrado frascos sem chicanas, mas com velocidades mais altas, então é

recomendável trabalhar com o frasco normal.

A aplicação de chicanas não é sempre recomendável. Elas são geralmente

feitas à mão em uma vidraria e, portanto, não são reprodutíveis com relação à

geometria e ao tamanho, gerando diferenças significativas em termos de

transferência de oxigênio entre os frascos. Dados provenientes de culturas em

frascos com chicanas apresentam um desvio padrão muito grande, pois pequenas

diferenças na profundidade das projeções do vidro ou no posicionamento delas

causam diferenças significativas. Quando se deseja obter resultados uniformes em

um grande número de frascos, é necessário utilizar frascos padronizados. Septos

muito grandes também podem perturbar completamente a circulação do meio no

interior do frasco deixando o sistema “fora de fase” e propiciando o crescimento nas

laterais do frasco.

As chicanas também têm influenciam a morfologia de fungos, como mostra o

trabalho de GERLACH et al. (1998), pois aumentam a tensão de cisalhamento.

Comparou-se frascos com dois e quatro septos com frascos normais sem septos,

sendo todos cultivados com Aspergillus awamori em mesmas condições. Sem os

septos e com dois septos observou-se um aumento da fração do volume celular com

o tempo e depois foi atingido um valor constante de volume. No entanto, com quatro

septos, após um certo tempo, o valor da fração cai drasticamente. Com relação à

formação de pellets, observou-se que nos frascos com chicana não houve formação

significativa de pellets, ao contrário do frasco normal. Isso fica evidenciado na Figura

7 presente abaixo.

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Figura 7- Influência de chicanas na morfologia do fungo.

Fonte: GERLACH et al., 1998.

1.3.2. Tampas

Diferentes tipos de tampas (ou tampões) podem ser utilizados para fechar a

entrada do frasco. No entanto, não se deseja lacrar completamente o frasco, pois

assim não haveria entrada do oxigênio necessário em fermentação aeróbicas.

Portanto, um bom tampão é aquele que permite a entrada e saída de gases, mas

evita a entrada de microrganismos contaminantes, mantendo a cultura axênica. Ele

também serve para evitar partículas de aerossol proveniente da cultura escapem

para fora do frasco e não ocorra grande evaporação do meio durante a

autoclavagem e o cultivo. Para manter essas condições, o tampão não deve estar

molhado, pois isso dificulta a passagem de gases e propicia a contaminação. A

transferência de gases pelo tampão não depende somente do material do qual ele é

feito, mas também do diâmetro da abertura do frasco, do tamanho da profundidade

do tampão, e da diferença de concentração do gás dentro e fora do frasco.

A transferência de gás através do tampão estéril é descrita através do modelo

de Henzler e Schedel, citado por MROTZEK et al. (2001), no qual a troca de gases

não é apenas descrita pela lei de Fick da difusão. Devem ser considerados novos

aspectos como: a transferência de gás por ação combinada de difusão e de

convecção devido à troca de massa (formando um fluxo descrito por Stefan); os

coeficientes de difusão não são considerados como constantes, mas sim calculados

em função da concentração de gás no local; e a consideração de um fluxo de vapor

de água, o qual é um gás como oxigênio, nitrogênio ou dióxido de carbono e,

por isso, o coeficiente de difusão de vapor de água em nitrogênio é proporcional ao

coeficiente de difusão oxigênio em nitrogênio (DH2O-N2 DO2-N2).

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O tipo de tampão utilizado é uma das resistências à transferência de massa

para a troca de gases em frascos agitados. A maior parte da literatura se preocupa

com a resistência à transferência de gás através da interface gás-líquido, sendo uma

minoria aquelas que analisam a resistência do tipo de fechamento do frasco. A

resistência à transferência de gases do tampão pode ser quantificada com relação à

resistência de trocas de oxigênio (KO2):

Vários materiais (Figura 8) podem ser utilizados na fabricação de tampões,

como algodão, gaze, espuma de poliuretano, material fibroso sintético, filtros, entre

outros. Os tampões de algodão são os mais utilizados, mas apresentam grande

limitação na transferência de gases. Essa transferência será facilitada à medida que

o tamanho da abertura do frasco aumenta e a grossura do tampão diminui.

Figura 8- Alguns tipos de tampão (algodão, papel, espuma, fibra de vidro, alumínio e

silicone).

Fonte: MROTZEK et al., 2001.

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Segundo MROTZEK et al. (2001), a densidade do algodão e tamanho do

tampão pouco influenciou a transferência de gases. Algodão com uma densidade

entre 0,06 e 0,25 g/cm3 reduz a troca de gases em relação a atmosfera entre 25 e

38%. Tampões de papel com uma densidade de 0,19 g/cm3 reduz a troca de dióxido

de carbono em cerca de 37%. A fibra de vidro com densidade de 0,19 g/cm3 reduz a

troca gasosa de dióxido de carbono em cerca de 25%, sendo essa resistência menor

do que no caso do algodão da mesma densidade. No entanto, fibra tem um maior

peso específico do que algodão. Por conseguinte, a resistência é provavelmente

comparável a uma porosidade semelhante. Já a espuma de uretano reduz

consideravelmente as trocas gasosas, pois os poros são provavelmente achatados e

resultam em uma troca de gases mais baixa. Com relação às tampas de alumínio,

seu resultado não foi reprodutível devido à não aderência da tampa ao frasco e seu

deslocamento durante a agitação. As tampas de silicone reduzem

consideravelmente a transferência de gases.

O artigo em ANEXO 2 mostra também o efeito de alguns tipos de tampões.

Os pesquisadores tentaram ainda determinar se havia um aumento na transferência

de oxigênio ao aumentar a rotação da cultura durante a utilização do tampão que

limita a transferência.

1.3.3. Agitadores

Os agitadores, ou shakers (Figura 9), servem para auxiliar na transferência do

oxigênio e na mistura da solução. Esses equipamentos têm funcionamento continuo,

e uma das razões para se ter um fornecimento de energia emergencial em um

laboratório é para que os shakers estejam sempre funcionando. A bandeja onde são

fixados os frascos é livre de agitação externa e é movimentada através de um motor

que exerce movimentos contínuos de forma a agitar os frascos.

Os equipamentos mais modernos possuem uma cabine e um sistema de

controle de temperatura, proporcionando uma incubação do caldo a ser fermentado

em condições ótimas mais controladas. Alguns shakers possuem também controle

de iluminação (importante no cultivo de algas), de nível de umidade e disponibilidade

de gases.

17

Figura 9- Exemplos de shakers.

Fonte: < http://www.nbsc.com >

Os frascos podem ser agitados em dois tipos de equipamentos, sendo que a

diferenciação está no padrão do caminho de agitação, como mostra a Figura 10. Um

deles é chamado de rotativo, orbital ou girotrônico, o qual realiza órbitas circulares

de 50mm em média, movimentando a cultura suavemente e uniformemente dentro

do frasco. A velocidade de agitação varia entre 100 e 500 rpm geralmente, mas em

laboratórios é usual não passar de 250 rpm.

O outro tipo de agitador é o de movimento recíproco ou de movimento

alternativo. Ele realiza o deslocamento do líquido em um padrão diferenciado, com

uma órbita alternativa. Esse tipo de agitação foi comumente utilizado no passado,

mas tem perdido importância nos últimos anos. Ele é utilizado geralmente para

culturas de células animais e meios de cultivo viscosos.

Figura 10- Caminho do fluido em shaker rotativo (esquerda) e recíproco (dieita).

Fonte: Adaptado de < http://www.biosan.lv/eng/index.php?page=multi-bio-3d >.

O aumento da rotação do shaker pode aumentar a taxa de transferência de

oxigênio. Também pode ocorrer um aumento de danificação das células devido a

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essa agitação, sendo que é necessário encontrar a velocidade de agitação mais

adequada para o processo.

Freedman, citado por BÜCHS (2001), concluiu ao comparar os dois tipos de

shakers que o padrão de turbulência criado no agitador rotativo não é tão afetado

pelo meio, pela viscosidade, pelo início da agitação, ou pelo volume do frasco. Este

é, segundo o pesquisador, o motivo pelo qual o agitador rotativo é usado com maior

freqüência no cultivo de microrganismos.

Um fator importante na boa utilização do equipamento para aumentar a sua

vida útil é a distribuição adequada dos frascos. Isso é importante para não

desnivelar a bandeja devido ao peso excessivo em um dos lados e causar desgaste

do motor. A manutenção ou a compra de equipamentos novos não é muitas vezes

economicamente viável.

2. PREPARO DE INÓCULO

A realização de uma fermentação em larga escala necessita do preparo de

um inóculo em menor escala. Inóculo é toda suspensão de células em

concentrações adequadas capazes de conduzir economicamente um processo

fermentativo de um dado volume de meio. A importância desse inóculo para o

processo inteiro pode ser observada numa citação de Hockenhull: “Uma vez que a

fermentação é iniciada, ela pode se tornar pior, mas nunca melhor.”. Portanto,

utilizar uma cultura de inóculo de boa qualidade é essencial. Um bom inóculo

deverá: conter células saudáveis e ativas, minimizando, assim, o período de

adaptação das células ao meio de cultivo na fermentação seguinte; estar em volume

suficiente para fornecer células na devida quantidade; estar em uma forma

morfológica adequada; estar livre de contaminações; e manter as características de

produção do produto desejado.

Um dos fatores críticos na obtenção de um inóculo adequado é

a escolha do meio de cultura. Tal como no meio utilizado para a produção, o meio de

inóculo deve conter não apenas as necessidades de nutrição

do microrganismo, mas também os requisitos para a formação do produto. No

entanto, como o inóculo não tem como objeto produzir o produto, mas sim biomassa,

a sua formulação pode ser diferente do meio de produção, possibilitando assim uma

forma de reduzir alguns gastos.

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Geralmente utilizam-se meios para inóculo suficientemente semelhantes ao

da produção para diminuir a fase lag de crescimento, ou seja, o período de

adaptação das células ao novo meio. A Tabela 2 mostra uma comparação entre

alguns meios de inóculo utilizados e os meios de produção. Pode-se notar que os

meios para inóculo são geralmente menos nutritivos do que os meios de produção e

que contém níveis mais baixos de carbono.

Tabela 2- Meios de inóculo e de produção utilizados para alguns processos.

Fonte: STANBURY, 1995.

Hockenhull, citado por STANBURY (1995), alerta para os perigos da

utilização de um meio muito diferente do usado em etapas posteriores. Grandes

diferenças de pH, pressão osmótica composição de ânions pode resultar em

mudanças bruscas nas taxas de consumo do substrato, que, por sua vez, vai afetar

a viabilidade celular. Ele também enfatiza que nas culturas de produção de

antibióticos, o meio utilizado no inóculo deve fornecer uma quantidade suficiente de

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carbono e nitrogênio para propiciar um grande crescimento até e transferência, de

modo que o metabolismo secundário fique reprimido durante o crescimento do

inóculo.

Se não ocorrer a repressão do metabolismo secundário, irão se desenvolver

no inóculo as variantes que produzem menos e crescem mais rápido, superando em

número a quantidade de células que produzem mais metabólitos e por isso crescem

de maneira mais lenta. Hockenhull mostrou um exemplo como o trabalho de

Righelato (1976) no qual foi trabalhada uma cultura quimioestática de Penicillium

chrysogenum sob condições limitadas de carboidratos, o que levou à perda da

capacidade de síntese da penicilina. No entanto, isso não ocorreu em condições em

que a fonte limitada era de nitrogênio, sulfato ou fosfato. Hockenhull tirou dessa

informação que os inóculos desse fungo produzidos sob condições não-limitantes

são livres de variantes, enquanto que as variantes podem surgir freqüentemente

durante situações de limite de carbono.

O volume de inóculo normalmente utilizado é entre 3 e 10% do volume médio

da próxima fermentação. Os microrganismos de uma cultura provêm inicialmente de

um estoque, o qual deve passar por uma série de cultivos até se chegar ao volume

adequado para ser inoculado no fermentador de produção. Isso pode envolver

algumas etapas de fermentação em frascos agitados e biorreatores de bancada, até

se chegar a quantidade ideal, como mostra a Tabela 3. Em cada um desses

processos há um risco grande de contaminação da cultura e degeneração do

microrganismo devido a mutações naturais, sendo que quanto maior o número de

transferências maior o risco.

O desenvolvimento de um inóculo geralmente passa pelas etapas descritas a

seguir. A cultura principal é conservada em meio sólido, e aproximadamente 10

colônias que apresentam características de alta produtividade e morfologia

adequada são inoculadas em meio inclinado para fazer um sub-cultivo. Esses sub-

cultivos podem ser transferidos para frascos agitados de forma a testar a sua

viabilidade e produtividade. São inoculados geralmente frascos de 250 a 500 mL

contendo de 50 a 100 mL de meio de cultivo líquido. Após o crescimento nesse

frasco e verificação da produtividade, ele pode ser inoculado em um frasco maior,

em um fermentador de escala laboratorial. Este, por sua vez, pode então servir de

inóculo para um biorreator de escala industrial. Às vezes, os testes de análise

21

podem não estar prontos antes da inoculação, mas, pelo menos, se houver algum

problema, poderá ser detectado depois em qual etapa ele estava.

Um fator a ser considerado no número de etapas e tamanho do inóculo é a

economia do processo. Por exemplo, um inóculo de 10% do tamanho de um

biorreator de fermentação em escala industrial representa um grande investimento

financeiro, o qual só é justificado se houverem vantagem com relação à

produtividade.

Tabela 3- Níveis de cultivo de um microrganismo.

Fonte: RUTTLOFF, PROLL & LEUCHTENBERGER, 1996.

O momento da transferência do inóculo é de extrema importância, pois a

fermentação não pode ser contaminada durante esse processo. Nas indústrias, o

processo de passagem do inóculo de biorreatores de escala laboratorial para um de

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escala industrial envolve um sistema de válvulas e canais de forma que todo o

cultivo prossiga sem contaminações indesejadas.

2.1. CONDIÇÕES DO INÓCULO

A condição fisiológica do inóculo no momento da transferência da cultura é de

extrema importância no desenvolvimento da próxima fase do processo e se ter um

grande efeito sobre o desempenho da fermentação. O melhor momento para a

transferência da cultura deve ser determinado experimentalmente e, em seguida,

deve-se estabelecer procedimentos de modo a que inoculação ideal poça ser

alcançada rotineiramente. Para garantir-se isso são realizadas padronizações das

condições de cultura e acompanhamentos do estado do inóculo, de modo que a

transferência ocorra no tempo ótimo e estado fisiológico correto. O critério mais

utilizado para a transferência das estruturas vegetativas dos inóculos é

determinação da biomassa, a qual pode ser determinada através de parâmetros

como peso seco, peso úmido, turbidez, respiração, concentração residual de

nutrientes, morfologia, entre outros. Ettler (1992), citado por STANBURY (1995),

demonstrou que a análise reológica do meio de cultivo de Streptomyces noursei

poderia ser usada como critério na determinação do crescimento celular. A reologia

do meio líquido mudava de newtoniana para não-newtoniana, e o momento em que

ocorria essa mudança correspondia ao tempo ideal de crescimento do inóculo.

Métodos de monitoramento on-line (como a quantidade do oxigênio, do

dióxido de carbono, de algum gás efluente ou verificação do pH) são mais

convenientes para usar como indicadores da qualidade do inóculo. Parton e Willis

(1990) defenderam a utilização da taxa de produção de dióxido de carbono (CPR)

como um critério de análise de efluentes gasosos para a transferência de inóculo.

Esta abordagem é indicada apenas quando a transferência está sendo feita a partir

de um fermentador, pois é mais difícil controlar a atmosfera gasosa de um frasco

agitado.

Nos últimos anos, foram desenvolvidas novas sondas para análise on-line da

biomassa, as quais são inestimáveis para determinar o tempo de transferência ideal.

Boulton et al. (1989) relataram a utilização de um sensor de biomassa para controlar

a adição de levedura (taxa de inóculo) na produção da cerveja. A sonda mede a

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permissividade dielétrica de células viáveis e não é afetada pela presença de células

mortas, bolhas ou detritos, tornando-a ideal para este caso.

O artigo em ANEXO 3 mostra a influência das condições do inóculo no

crescimento do fungo Penicillium chrysogenum. Foram analisados fatores como a

solução de diluição do inóculo, a idade da cultura esporulante, a cepa utilizada e o

tamanho do inóculo. Cada microrganismo necessita de um preparo do inóculo

diferente, e isso é levado em conta separadamente. A seguir serão discutidos os

preparos de inóculos de leveduras, bactérias, e fungos.

2.2. INÓCULO DE LEVEDURAS

A maioria das fermentações industriais que utilizam leveduras visa a produção

de cerveja ou de biomassa. No entanto alguns processos recentes de produção de

produtos recombinantes também necessitam do cultivo de leveduras.

Na fabricação da cerveja, muitas vezes é utilizada uma parcela da

fermentação anterior como inóculo para a próxima fermentação. No entanto, a

realização desse tipo de prática pode resultar na introdução de contaminantes e na

degeneração da cepa com relação à eficiência de produção e capacidade de

floculação.

Muitas vezes para evitar esse dois problemas são utilizadas “leveduras do

meio” (middle skimmings). Durante a fermentação, as células de levedura floculam e

flutuam até superfície. As primeiras células que fazem isso são mais floculantes e,

quando a fermentação é realizada em tambor aberto, são mais susceptíveis à

contaminação. Células que ficam mais em baixo são aquelas com pouca capacidade

de floculação. Portanto, ao pegar as leveduras que estão na camada do meio, estar-

se-ia pegando leveduras com boa capacidade de floculação e livres de

contaminantes.

Essas leveduras recolhidas podem também receber um tratamento antes de

serem inoculadas na próxima fermentação para remover leveduras mortas e

bactérias contaminantes através da redução do pH para 2,5-3, lavagem com água,

lavagem com persulfato de amônio e tratamento com antibióticos como polimixina,

penicilina e neomicina.

A indústria cervejeira também utiliza fermentadores do tipo cilindro-cônico.

Nestes sistemas a coleta de leveduras floculantes é feita no cone no fundo do

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