FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE IN-CULO_Parte3, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE IN-CULO_Parte3, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos frasco agitados e preparo de inóculo, inóculo de bactérias, de fungos filamentosos.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

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fermentador, o qual está sujeito a falta de nutrientes, altas concentrações de etanol,

baixa atividade da água, elevada concentração de dióxido de carbono

e de alta pressão. Portanto, a viabilidade das células coletadas nesse local não seria

o ideal para um inóculo.

Uma das principais características fisiológicas de um bom inóculo de levedura

é o nível de esterol nas células. Esteróis estão presentes na membrana celular e são

necessários para a sua síntese, mas eles são apenas produzidos na presença de

oxigênio. Como a produção de etanol é realizada em condições anaeróbicas, ao se

injetar oxigênio no inóculo antes da inoculação, tem-se um aumento da quantidade

de esterol para promover o crescimento celular inicial.

A produção de leveduras para fermento de pão envolve o desenvolvimento de

um inóculo através de um grande número de estágios aeróbicos. Devido ao fato de

que as fases da produção não poderem ser realizadas em condições totalmente

assépticas, o uso de uma cultura pura como inóculo é de extrema importância para

manter o nível de contaminação no início o mais baixo possível. Reed e

Nagodawithana (1991), citado por STANBURY (1995), discutiram o desenvolvimento

do inóculo para a produção de fermento de panificação, a partir de um processo

envolvendo oito fases, sendo as três primeiras asséptica enquanto que as restantes

eram realizadas em tanque aberto. O fungo poderia ser bombeado diretamente de

um frasco para o outro ou o inóculo poderia ser centrifugado e lavado antes de

transferência, reduzindo assim o nível de contaminação.

O artigo em ANEXO 4 mostra a importância da determinação adequada da

concentração celular da suspensão de leveduras. Na determinação do efeito de

substâncias antifúngicas, é necessária uma padronização da quantidade de inóculo

utilizada. Esse artigo visava comparar quatro métodos de determinação adequada

da concentração celular do inóculo.

2.3. INÓCULO DE BACTÉRIAS

O principal objetivo do inóculo para o desenvolvimento fermentações

bacterianas é produzir células ativas, as quais terão uma fase lag curta e será

possível dar continuidade à cultura. Fases lag longas não são vantajosas porque

não só é tempo perdido, mas também o meio de cultivo é consumido durante a

manutenção da viabilidade da cultura antes do crescimento.

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A duração da fase lag é afetada pelo tamanho do inóculo e a sua condição

fisiológica. Como já foi dito, o tamanho do inóculo normalmente varia entre 3 e 10%

o volume da cultura de produção. Lincoln (1960), citado por STANBURY (1995),

salientou que inóculos bacterianos devem ser transferidos na fase logarítmica de

crescimento, enquanto as células estão ainda metabolicamente ativas. A idade do

inóculo é importante no crescimento das bactérias esporulantes, pois a esporulação

é feita no final da fase logarítmica e a utilização de um inóculo contendo uma

elevada quantidade de esporos resultaria numa fase lag longa, atrasando a próxima

fermentação.

Underkofler (1976), citado por STANBURY (1995), enfatizou que, na

produção bacteriana de enzimas, o a fase lag poderia ser quase totalmente

eliminada através da utilização de um meio no inóculo praticamente idêntico ao meio

de produção. A necessidade de utilizar um inóculo em um estado fisiológico ativo é

realmente seguida na produção de vinagre. As bactérias acéticas utilizadas na

produção do vinagre são extremamente sensíveis à falta de oxigênio. Por isso, para

evitar a perturbação do sistema, as células no final de uma fermentação são

utilizados como inóculo para o próximo lote através da remoção de cerca de 60% da

cultura e restaurando os níveis iniciais com meio fresco.

No entanto, um inóculo de alta atividade aumenta da probabilidade de

degeneração da cepa. Por exemplo, Sabatie (1991), citado por STANBURY (1995),

demonstrou que a estabilidade do plasmídeo e produtividade em E. coli para a

produção de biotina são melhores quando o inóculo utilizado está na fase lag, e não

na exponencial. Ele afirmou que a cópia dos plasmídeos é maior em estacionário do

que em exponencial do que em outros, resultando em uma menor perda dos

plasmídeos durante a fermentação.

Na fermentação do ácido lático deve-se preparar um inóculo livre dessa

substância, pois as bactérias podem ter seu crescimento inibido por ela. Assim, a

produção ácido láctico no inóculo pode resultar em inóculos de má qualidade.

Yamamoto et al. (1993) gerou grande qualidade de inóculo de bactérias lácticas

utilizando eletrodiálise, removendo assim o lactato do meio de inóculo e reduzindo a

duração da fase lag durante a produção.

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2.4. INÓCULO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

A preparação de inóculos para fermentações que promovem o crescimento

micelial de fungos filamentosos é empregada para a maioria dos fungos importantes

industrialmente, onde se utiliza uma suspensão de esporos durante o

desenvolvimento do inóculo. A grande vantagem de se utilizar inóculos contendo

esporos é que se contêm muito mais estruturas propagativas do que em uma cultura

de células vegetativa. Três técnicas básicas têm sido desenvolvidas para produzir

uma alta concentração de esporos para utilização como inóculo.

A primeira é a esporulação em meio solidificado. A maioria dos fungos e

estreptomicetos esporulam em meio com ágar adequado, mas uma grande área de

superfície desse ágar deve ser utilizada para se produzir uma quantidade de

esporos suficiente.

Outros organismos filamentosos irão esporular naturalmente na superfície de

cereais e grão, a partir dos quais os esporos podem ser recolhidos. Substratos como

a cevada, o farelo de trigo, o milho e o arroz são superfícies adequadas para a

esporulação de uma vasta gama de fungos. A esporulação de um determinado

fungo é particularmente afetada pela quantidade de água adicionada ao cereal antes

da esterilização e a umidade relativa da atmosfera, a qual deve estar a mais alta

possível durante esporulação.

O último método seria a esporulação em cultura submersa. Alguns fungos

sofrem esporulação em meio líquido desde que um suporte adequado seja

empregado. Esta técnica é mais conveniente do que o uso de meios sólidos, porque

é mais fácil de trabalhar assepticamente e de ser aplicado em grande escala. A

técnica foi aprovada pela primeira Foster et al. (1945) que induziu esporulação de

Penicillium notatum em cultivo submerso através da adição de 2,5% de cloreto de

cálcio em um meio definido. A maior parte dos actinomicetos não esporulam em

condições submersas, e, portanto, as outras técnicas descritas anteriormente devem

ser utilizadas. Rhodes et al. (1957), citado por STAMBURY (1995), descreveram as

condições necessárias para a esporulação em meio líquido de Penicillium patulum.

Observou-se que para ocorrer a esporulação o nível de nitrogênio tinha de ser

limitados a entre 0,05 e 0,1% p/v e que uma boa aeração deveria ser mantida. Eles

também observaram que quanto menor for a aeração, menor a concentração de

nitrogênio necessária para induzir a esporulação.

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Alguns fungos não são capazes de produzir esporos assexuados, e, portanto,

é necessário preparam inóculos à partir das estruturas vegetativas. O grande

problema em usar o micélio vegetativo como inóculo é a padronização da

quantidade de inóculo e dificuldade da obtenção de um inóculo uniforme. Pode-se

evitar isso tentado fragmentar o micélio em peneiras ou num liquidificador de Waring

antes de utilizá-lo como inóculo. Este método proporciona um grande número de

partículas miceliais e, portanto, um grande número de partículas de propagação.

Quando fungos filamentosos são cultivados em fermentação submersa, o

crescimento varia entre a forma de "pellet", a qual é uma massa de hifas compactas,

e uma forma filamentosa forma por hifas uma forma homogênea. O tipo de

filamentoso dará origem a um caldo viscoso que poderá ser de difícil areação, ao

passo que o crescimento em pellets dará origem a um meio menos viscoso, mas

também menos homogêneo. Na estrutura do pellet ocorre o problema do micélio que

se encontra no centro não receber grandes quantidades de nutrientes devido às

dificuldades de difusão.

A forma morfológica do fungo pode influenciar a produtividade da cultura, pois

algumas fermentações são eficientes com o fungo na forma filamentosa e outras na

forma de pellets. Por exemplo, o crescimento filamentoso tem sido reivindicado

como uma condição ótima para a produção penicilina por P. chrysogenum, enquanto

que o crescimento em pellets foi reivindicado como sendo ótimo para a produção e

de ácido cítrico por Aspergillus niger e de lovastatina por Aspergillus telreus.

A morfologia do micélio é influenciada pela concentração de esporos no

inóculo e os o meio de cultivo no qual esse inóculo foi desenvolvido. Normalmente,

inóculos com grande quantidade de esporos produzem um micélio disperso na forma

de filamentos, enquanto que um inóculo com baixa concentração de esporos irá

favorecer a formação de pellets. A partir da Tabela 4 é possível observar a influência

da concentração de esporos na forma de crescimento de Penicillium chrysogenum.

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Tabela 4- Efeito da concentração de esporos na morfologia e produtividade de

penicilina por Penicillium chrysogenum.

Fonte: STANBURY, 1995.

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3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BÜCHS, J. Introduction to advantages and problems of shaken cultures.

Biochemical Engineering Journal, v.7, p.91-98, 2001. DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p.

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Disponível em: < www.mmbr.asm.org >. Acesso em: 17 de maio de 2008. GERLACH, S. R.; SIEDENBERG, D.; GERLACH, D.; SCHÜGERL, K.; GIUSEPPIN, M. L. F.; HUNIK, J. Influence of reactor systems on the morphology of Aspergillus awamori. Application of neural network and cluster analysis for characterization of fungal morphology. Process Biochemistry, vol. 33, nº 6, p.

601-615, 1998. JÄNICKE, G.; SAUTER, C.; BUX, R.; HAAS, J. Characterisation of shake flasks for cultivation of animal cell cultures. R. Smith (ed.), Cell Technology for Cell

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Applied Microbiology, 95, p. 1034-1038, 2003. STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357

p.

30

TABORSKY, V. Small-scale processing of microbial pesticides. Food and

Agriculture Organization of the United Nations, FAO Agricultural Services Bulletin Nº 96, Rome, 1992. Disponível em: < http://www.fao.org/docrep/t0533e/ t0533e08.htm#6.5.2 >. Acesso em: 17 de maio de 2008. WHIPPS, J. M.; LUMSDEN, R. D. Biotechnology of Fungi for Improving PlantGrowth. British Mycological Society Symposium, Cambridge University Press, 1989,

303 p.

31

4. ANEXOS

ANEXO 1

CHARACTERISATION OF THE GAS-LIQUID MASS TRANSFER IN SHAKING

BIOREACTORS

ULRIKE MAIER & JOCHEN BÜCHS

32

ANEXO 2

EFFECT OF SHAKING SPEED AND TYPE OF CLOSURE ON SHAKE FLASK

CULTURES

L. E. McDANIEL & E. G. BAILEY

33

ANEXO 3

INFLUENCE OF INOCULUM PREPARATION ON THE GROWTH OF Penicillium

chrysogenum

M. SAUTOUR, P. DANTIGNY, M.-C. GUILHEM & M. BENSOUSSAN

34

ANEXO 4

MULTICENTER EVALUATION OF FOUR METHODS OF YEAST INOCULUM

PREPARATION

M. A. PFALLER, L. BURMEISTER, M. S. BARTLETT & M. G. RINALDI

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