FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE INOCULO - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE INOCULO - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos frasco agitados e preparo de inóculo, solubilidade de oxigênio gasoso, equipamento, condições de inóculo.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

SETOR DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE INÓCULO

Trabalho acadêmico apresentado à

disciplina Processos Fermentativos

Industriais da Universidade Federal

do Paraná.

CURITIBA

2008

1

SUMÁRIO

1.CULTIVO EM FRASCOS AGITADOS ................................................................. 2

1.1. SOLUBILIDADE DO OXIGÊNIO GASOSO ................................................... 4

1.2. DEMANDA DE OXIGÊNIO PELOS MICRORGANISMOS ............................. 8

1.3. EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS ............................................................. 11

1.3.1.Frascos ................................................................................................ 11

1.3.2.Tampas ................................................................................................ 14

1.3.3.Agitadores ............................................................................................ 16

2.PREPARO DE INÓCULO .................................................................................. 18

2.1. CONDIÇÕES DO INÓCULO ....................................................................... 22

2.2. INÓCULO DE LEVEDURAS........................................................................ 23

2.3. INÓCULO DE BACTÉRIAS ......................................................................... 24

2.4. INÓCULO DE FUNGOS FILAMENTOSOS ................................................. 26

3.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 29

4.ANEXOS ............................................................................................................ 31

2

1. CULTIVO EM FRASCOS AGITADOS

Os frascos agitados são freqüentemente usados na biotecnologia. Apesar de

sua grande importância prática, muito pouco tem se estudado sobre as propriedades

e características de uma cultura agitada. Eles podem variar em volume de 25 mL até

6 L (em alguns casos podendo chegar até 60 L). Pode-se também designar como

frascos agitados tubos de ensaio de cerca de 10-25 mL e as microplacas de 120μL a

3 mL. Esses frascos podem ou não ser equipados com chicanas (também chamados

de septos ou baffles), as quais são feitas de vidro ou de plástico.

A cultura em frascos imóveis é útil para a produção de pequenas quantidades

de cultivos de fungos para serem inoculados em substratos sólidos. A vantagem

desse método frente ao cultivo sólido é a fácil detecção de contaminação por outros

microrganismos e a facilidade de determinação da biomassa. O problema desse tipo

de cultura estática é a transferência de oxigênio, pois há uma dependência na

superfície de transferência entre a fase líquida e gasosa, e por isso frascos de

Erlenmeyer de 500mL podem conter somente 100mL de meio de cultura.

Uma nova era na fermentação iniciou-se com a introdução em 1933 da

técnica de agitação de frascos por Kluyver e Perquin. Essa técnica de agitação

(chamada pelos autores de Schüttelkultur) foi desenvolvida inicialmente para cultivo

em escala laboratorial, mas logo passou também a ser utilizada em algumas

fábricas, como na fabricação de antibióticos. Na indústria, o cultivo em frascos

possibilita realizar inúmeras fermentações de uma só vez, enquanto o cultivo em

vários biorreatores ao mesmo tempo é economicamente inviável devido aos custos

do equipamento. Kennedy et al.(1994), citado por BÜCHS (2001), argumentou que

"não existe nenhuma outra forma de se fazer a otimização do meio senão em

frascos agitados simplesmente porque o número de experimentos a serem

conduzidos é muito grande. O efeito das diferentes componentes do meio é relativo,

e por isso o melhor meio obtido em frasco agitado também será o melhor meio

tanque.". Esta última afirmação tem de ser considerada com cautela, pois não se

pode pressupor que os microrganismos irão agir de uma maneira equivalentes nos

dois tipos de cultivo.

Frascos agitados são freqüentemente utilizados para a cultura de bactérias,

fungos, leveduras, e algumas células animais e vegetais. Dependendo do

microrganismo estudado, os parâmetros operacionais de um cultivo agitado podem

3

influenciar significativamente os resultados. Estes tipos de interações são muitas

vezes esquecidos ou ignorados pelos pesquisadores. É preciso ter conhecimento e

controle dos fenômenos hidrodinâmicos, da transferência de gases e dos

parâmetros físicos que influenciam as culturas durante o processo de agitação. Isso

irá garantir uma reprodutibilidade e confiabilidade nos resultados obtidos na

fermentação.

Várias etapas de um processo biotecnológico podem empregar frascos

agitados, como a seleção de um tipo selvagem com uma característica específica,

melhoramento genético e mutação, desenvolvimento de cepas recombinantes,

elucidação de vias metabólicas, optimização de meios de cultivo, estabelecimento

de protocolos analíticos, e investigação das condições básicas do processo como a

estabilidade, a taxa inoculação, o pH e a temperatura ideal, o tempo de cultivo e a

avaliação dos dados cinéticos. Os frascos agitados utilizados na etapa de screening

e melhoramento do processo geralmente contêm meios líquidos complexos

baseados em fontes de carboidratos e nitrogênio (como bagaço, milhocina, melaço

de soja, entre outros). Esses substratos são consumidos em diferentes velocidades,

e esse tempo de consumo irá influenciar a manutenção das condições ótimas para o

crescimento. Materiais sólidos como cal podem ser adicionados para manter o

controle do pH e a formação de agregados celulares (como pellets). Quando

utilizados meios quimicamente definidos deve-se monitorar com mais cuidado as

variações de pH e falta de substrato.

Segundo BÜCHS (2001), pode-se supor que provavelmente mais de 90% de

todas as experiências em biotecnologia envolvem um cultivo em frascos agitados.

No entanto, o estudo da cultura nesses frascos é geralmente subestimado pelos

profissionais da área por se tratar de um experimento com equipamentos muito

simples e ser utilizado principalmente na primeira etapa de um bioprocesso.

Algumas variáveis importantes no processo de agitação são: o tipo de frasco,

a sua geometria e dimensão (volume nominal), o tamanho e o número de chicanas

(se houver), as propriedades da superfície da parede interior do frasco, o diâmetro

da órbita de agitação, volume preenchido pelo meio de cultura e a freqüência de

agitação. Os experimentos em frascos agitados muitas vezes são realizados de

forma imprecisa e sem a determinação desses parâmetros, inviabilizando a

reprodutibilidade em outros laboratórios. A determinação incorreta e o

desconhecimento dos parâmetros ideais para uma cultura em frascos agitados

4

podem gerar perdas de produtividade, inóculos mal desenvolvidos, seleção de

microrganismos não-desejados, meios de cultivo inadequados, e gastos econômicos

desnecessários.

Apesar dos frascos agitados apresentarem problemas como o pequeno

controle nas transferências gasosas, na eficiência da mistura e no monitoramento

contínuo das condições, eles são valiosos para o desenvolvimento de processos.

1.1. SOLUBILIDADE DO OXIGÊNIO GASOSO

A taxa de transferência de oxigênio é de extrema importância no

desenvolvimento de um processo fermentativo industrial. Vários microrganismos

necessitam da presença de oxigênio para poder sintetizar seus produtos, e por isso

é cada vez mais necessário conhecer a respiração celular e a demanda de oxigênio

de cada espécie. As enzimas respiratórias estão todas presentes na fase aquosa,

portanto, os microrganismos podem utilizar apenas o oxigênio dissolvido, mesmo

quando eles crescem na interface ar-água. Além disso, o oxigênio é tão insolúvel

que existem somente pequenas quantidades disponíveis para as células.

Como mostra a Figura 1, o transporte da molécula de O2 precisa passar por

uma série de barreiras, formando gargalos (ou estrangulamentos) que diminuem a

transferência de oxigênio para a célula. Aquele que for o mais difícil de se transpor

será o fator que controla esse transporte. Se, por exemplo, houver uma etapa

limitante na transferência de oxigênio na interface gás-líquido, como mostra a

exclamação na figura, então o melhoramento genético do microrganismo não teria

muito efeito na produção, a não ser que o melhoramento seja com relação à via

respiratória.

O papel do oxigênio dissolvido no meio de cultivo é bastante importante no

metabolismo celular e na síntese de compostos, e isso já é bem conhecido desde a

época de Pasteur. No entanto, publicações recentes às vezes dão pouca atenção

para a questão do abastecimento de oxigênio, talvez devido à incerteza quanto à

sua classificação como um fator físico ou químico que afeta o crescimento.

5

Figura 1- Barreiras no transporte de substâncias.

Fonte: BÜCHS, 2001.

O oxigênio é um gás pouco solúvel em água a 20º C e 1 atm. Nestas

condições, somente 9 ppm de oxigênio se dissolvem em água. À medida que a

temperatura é levantada, oxigênio, como qualquer outro gás, torna-se insolúvel. Por

exemplo, à 37º C, menos de 7 ppm de oxigênio são solúveis em água. A solubilidade

de oxigênio é substancialmente independente da pressão total e da presença de

outros gases. Ela é, no entanto, diretamente proporcional à pressão parcial de

oxigênio na fase gasosa. Este fato é conhecido como a lei de Henry, a qual pode ser

escrita como:

(1)

onde H' é uma constante da lei de Henry baseada na concentração molar e a

pressão parcial é expressa em atmosferas. O asterisco em C denota concentração

no líquido em equilíbrio. A solubilidade deve ser expressa como uma fração molar,

mas para gases pouco solúveis, o erro é pequeno ao se utilizar a molaridade como

proporcional à fração molar. A Lei de Henry prevê que, em uma atmosfera de

oxigênio puro, água irá dissolver cerca de cinco vezes mais que o oxigênio no ar,

onde a pressão parcial é apenas 0,21 atm.

Umbreit, Burnis, e Stauffer, citado por FINN (1954), apresentaram dados

sobre o efeito de sais dissolvidos na solubilidade de oxigênio. Estes e outros dados

6

na literatura são muitas vezes expressos em termos de um coeficiente de Bunsen,

denominado de α. O coeficiente de Bunsen deve ser multiplicado

por 1.000 / 22,4 para se obter H', que é mais conveniente na análise dos estudos.

Em caldos nutrientes saturados com ar a 25º C, o valor de C* é aproximadamente

0,20 mM por litro, e o valor de H' é próximo à unidade.

A quantidade de compostos dissolvidos no meio de cultivo pode influenciar a

solubilidade de oxigênio e o coeficiente de difusão KL. Geralmente em grandes

quantidades de compostos dissolvidos há uma menor solubilidade do oxigênio. Isso

afetará o crescimento celular e a formação de produtos metabólicos.

A taxa de transporte de oxigênio pelo meio líquido é proporcional à área de

interface, e pode ser também expressa de acordo com a seguinte fórmula:

(2)

onde a é a área de interface, C* é a concentração na interface líquido-gás obtido

pela lei de Henry, C é a concentração real do oxigênio no líquido e KL é o coeficiente

global de transferência de massa. O recíproco 1/KL é igual à soma das resistências

presentes (no filme de gás, na interface, e no filme do líquido). Quando estas

resistências são grandes, KL é pequeno e vice-versa. O artigo em ANEXO 1 mostra

em alguns detalhes a transferência de oxigênio nas culturas em frascos agitados, a

análise de alguns parâmetros físicos e a construção de alguns modelos

matemáticos.

Um fato cotidiano em uma pesquisa é a interrupção da agitação para o

recolhimento de amostras. Isso é um fator que pode afetar a taxa de transferência

de oxigênio. Como mostra a Figura 2, durante o cultivo de Bauveria densa, em

frascos de 250mL com volume de meio de 40mL agitados à 200 rpm, quando se faz

uma pausa na agitação (indicada pela seta), há uma queda do oxigênio disponível e

conseqüentemente na atividade respiratória. O fato de durante a amostragem há

uma interrupção do fornecimento de oxigênio é muitas vezes esquecido pelos

pesquisadores.

A questão da disponibilidade de oxigênio é muitas vezes ignorada por

microbiologistas, sendo considerada como um problema insolúvel. No entanto, uma

forma de tentar resolvê-lo é através da utilização de frascos com chicanas (ou

baffles). Quando elevadas quantidades de oxigênio são necessárias, a utilização de

chicanas irá proporcionar uma maior transferência de oxigênio em freqüências de

7

agitação não tão altas. As chicanas também proporcionam um maior estresse

hidromecânico, o qual pode ser vantajoso dependendo do caso, com, por exemplo,

no impedimento da formação de pellets muito grandes.

Figura 2- Transferência de oxigênio ao se parar o agitador.

Fonte: BÜCHS, 2001.

O volume de meio presente no frasco também influencia bastante a

transferência de oxigênio. Quanto menor o volume de meio no frasco, melhor será a

taxa de transferência de oxigênio (OTR). A melhor transferência de oxigênio ocorre,

por exemplo, quando o volume de meio em um Erlenmeyer de 250mL é de 50 mL.

Isso é um problema, pois volumes muito pequenos de meio fermentado podem gerar

pouca produtividade. Volumes pequenos também só podem ser utilizados em

fermentações de pouca duração, pois, caso contrário, irá acontecer evaporação do

meio de cultivo e os nutrientes ficarão muito concentrados.

Fungos são microrganismos que necessitam de grandes quantidades de

oxigênio para se desenvolverem. Portanto, é ideal utilizar pequenos volumes de

meio, chegando no máximo até 15% do volume total do frasco. Já bactérias são

microrganismos que necessitam de menores quantidades de O2 para se

desenvolverem, logo, é possível utilizar frascos contendo um volume de meio de

cultivo maior.

No trabalho de JÄNICKE et al. (2007), observou-se que o aumento no volume

de meio do frasco e o aumento do diâmetro do frasco tiveram efeito negativo na taxa

8

de transferência de oxigênio, enquanto o aumento da freqüência de agitação e no

diâmetro da órbita aumentou essa taxa (Figura 3).

Figura 3- Variação da OTR com relação ao diâmetro do frasco e volume do meio

Fonte: JÄNICKE et al., 2007.

1.2. DEMANDA DE OXIGÊNIO PELOS MICRORGANISMOS

A demanda de oxigênio pelos cultivos microbianos é elevada, e a taxa de

abastecimento deve ser no mínimo igual essa taxa de demanda em cada porção do

meio líquido. Caso contrário, aparecerão locais em que há uma depleção temporária

ou contínua no fornecimento de oxigênio para as células executarem a respiração.

Tais danos foram demonstrados por Hromatka, Ebner e Csoklich, citado por

FINN (1954), que observaram que a interrupção do fluxo de ar no cultivo de

Acetobacter por 15 segundo e causou morte celular e perturbou o metabolismo.

Uma cultura líquida deve ser mantida com o ar saturado em todos os momentos.

Essa condição é dificilmente mantida em culturas aeróbias, mas, felizmente para

microbiologistas, não há necessidade de manter culturas saturadas com ar. A

9

respiração celular acontece a uma taxa que é independente da concentração de

oxigênio dissolvido desde que este último se mantenha acima de um valor crítico.

Para os organismos unicelulares esse valor crítico é extremamente baixo, como

mostra a Tabela 1.

Tabela 1- Valores típicos de C crítico na presença de substrato.

Fonte: FINN, 1954.

Abaixo do nível crítico de oxigênio, a taxa de respiração cai de maneira

hiperbólica. Em uma série de experimentos com células de levedura, Winsler, citado

por FINN (1954), demonstrou que, em baixa tensão de oxigênio, a respiração é

limitada pela insaturação das enzimas e não devido à difusão lenta de oxigênio pelo

citoplasma. Ele utilizou o fato de que o monóxido de carbono funciona como um

inibidor competitivo, deslocando o oxigênio da citocromo oxidase da levedura. Com

misturas de CO - O2, uma queda da taxa de respiração foi observada em condições

em que a tensão de oxigênio era tão elevada que a difusão de O2 não poderia ser

considerada como um fator limitante.

Longmuir (1954) realizou estudos de C crítico para bactérias. Ele observou

que essencialmente o C crítico é variado com relação à forma e o tamanho do

organismo: quanto maior as bactérias, maior nível crítico de oxigênio. A difusão de

oxigênio é mais difícil para organismos multicelulares ou aglomerados de células

unicelulares.

10

A indisponibilidade de oxigênio no meio de cultivo é um dos problemas mais

freqüentes associados com a aplicação de frascos agitados, e pode causar uma

série de efeitos no microrganismo, como:

 Todo o metabolismo dos microorganismos é desacelerado estabelece com

nenhuma outra conseqüência bioquímica. Neste caso, experiências em que o

mesmo nível de oxigênio é o fator limitante, pequenas diferenças na

geometria do frasco e nas condições de agitação darão resultados

semelhantes e não poderão ser observadas diferenças de atividade

microbiana.

 Mudança para um metabolismo parcialmente anaeróbico, excretado

subprodutos como ácidos e álcool. Isso irá alterar o valor do pH e inibir o

crescimento das células. O produto de formação tem significativas

implicações sobre a atividade metabólica e a cinética de crescimento.

 Reação ao oxigênio fornecido com relação a formação do produto metabólico

desejado. Futatsugi et al., citado por BÜCHS (2001), publicaram que a

produção de glucoamilase extracelular por Saccharomycopsis fibuligera em

diferentes tipos de biorreatores (incluindo frascos agitados) está

correlacionada a taxa de transferência de oxigênio. O crescimento desse

microrganismo não era afetado pela limitação de oxigênio, mas a produção da

enzima sim.

 Mudança completa do metabolismo. Produtos secundários que são

sintetizados somente em condições específicas podem desaparecer do meio

de cultivo na limitação de oxigênio. Por exemplo, Heinemann et al., citado por

BÜCHS (2001), compararam dois experimentos com cultura de Serratia

marcescens, sendo que a única diferença entre os dois conjuntos

experimentais foi que um apresentava frascos com chicanas e outro sem

chicanas. Em frascos com chicanas, houve a produção de um composto de

ação antibiótica e quase nenhuma formação da enzima asparaginase. Já em

frascos sem chicanas, ocorreu uma mudança da via metabólica e encontrou-

se grandes quantidades da enzima e nenhuma quantidade do composto

antibiótico. Isso ocorreu devido ao nível de oxigênio dissolvido no meio.

 Em alguns processos de fermentação, há a presença ou formação de

compostos químicos tóxicos para os microrganismos. Nesses sistemas, os

11

compostos tóxicos podem ser continuamente difundidos para o interior da

célula. O organismo pode reagir produzir energia suficiente para excretar a

substância tóxica ou contrabalançar o efeito nocivo de um composto tóxico

convertendo-o em um composto menos tóxico. Se nesses casos, o

fornecimento de oxigênio esteja comprometido, os microorganismos serão

incapazes de obter energia suficiente para metabolizar esses compostos e

morrerão rapidamente.

1.3. EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS

1.3.1. Frascos

Os frascos utilizados no cultivo de organismos variam em forma, tamanho e

tipo de material (Figura 4) de acordo com a finalidade do processo. Como já foi dito

anteriormente, eles podem variar em tamanho indo de microplacas até Erlenmeyers.

Atualmente, as bandejas dos equipamentos de agitação já possuem estruturas de

adaptação para os variados tamanho, fixando-o na base através de garras, fitas

adesivas, ou estantes de tubos, como mostra a Figura 5.

Figura 4- Alguns tipos de frascos.

Fonte: TABORSKY, 1992.

Figura 5- Formas de fixação dos frascos no shaker.

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