Identificação e doseamento de Proteínas - Apostilas - Engenharia Quimica, Notas de estudo de Engenharia Química. Universidade Federal de Alagoas (UFAL)
Roberto_880
Roberto_8805 de Março de 2013

Identificação e doseamento de Proteínas - Apostilas - Engenharia Quimica, Notas de estudo de Engenharia Química. Universidade Federal de Alagoas (UFAL)

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Apostilas de engenharia quimica sobre o estudo da Identificação e doseamento de proteínas, procedimento para montagem de uma curva padrão, método de biureto para determinação de proteínas.
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Aula Prática nº 3

Identificação e doseamento de Proteínas

1. Introdução

Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução. Ou seja, analisa a absorvância (capacidade que tem uma solução de absorver uma certa quantidade de energia do feixe de luz incidente)

Devido à existência de uma proporcionalidade directa entre a concentração das soluções e a quantidade de luz absorvida em comprimentos de onda específicos, a espectrofotometria pode ser usada como um método quantitativo de identificação de substâncias. Contudo, faz se necessário, a obtenção de uma relação entre absorvâncias registradas em experimentos para diferentes concentrações de soluções, elaborando-se rectas de calibração, ou seja, curvas padrões.

Experimentalmente é possível conhecer os valores de absorvância de soluções conhecidas e assim, utilizando-se as curvas padrões, podem-se determinar matematicamente as concentrações destas.

2. Desenvolvimento

2.1 Procedimento para montagem de uma curva padrão (Lehninger, 1984).

Quando escolhido um método de dosagem, prepara-se uma solução padrão de concentração rigorosamente conhecida. Mede-se então com pipetas de precisão, diferentes volumes desta solução, completando-se com solvente a um volume final determinado. É calculado e anotado a concentração de cada uma das amostras e então são feitas duplicatas destas amostras e estas são então processadas pelo método de dosagem. Um volume igual de solvente é processado pelo mesmo método, para servir de branco nesta dosagem (tubo 0) eliminado da leitura o erro causado pela absorção de luz pela cuba, solvente, reagente e impurezas.

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2.2 Método de biureto para determinação de proteínas

Um dos métodos utilizados para dosagem de proteína é chamado de método do Biureto. Esse método faz uso da propriedade de iões Cu2+ em meio alcalino de formar ligações com o nitrogénio das ligações peptídicas, que reage de modo quantitativo com as proteínas. Desta reacção (reacção de biureto) resulta uma coloração púrpura intensa, que absorve fortemente a radiação a 540 nm. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de proteína de uma solução. A cor desenvolvida numa reacção de iões de Cu2+ em meio alcalino com estas proteínas deve-se exclusivamente às ligações peptídicas e a sua intensidade é proporcional a quantidade de tais ligações. A absorvância é detectada no espectrofotómetro.

2.3 Procedimento

1. Marcou-se 6 tubos numerados entre t0 e t5 e dois numerados de A1 e A2;

2. Adicionou-se os reagentes de acordo com o indicado na Tabela 1;

3. Agitou-se suavemente e aguardou-se cerca de 10 min para o desenvolvimento da cor;

4. Leu-se a absorvância a 540 nm em cada um dos tubos, usando-se o t0 como branco;

5. Traçou-se o gráfico de absorvância versus concentração final;

6. Usou-se a curva obtida para determinar a concentração final em A1 e A2 e registou-se os valores na Tabela 2;

7. A partir dos valores na tabela 2 calculou-se a concentração inicial em A1 e A2 e registou-se os valores na Tabela 3.

2.4 Cálculos

Concentrações:

Ci x Vi = Cf x Vf

Ci = 5 mg/mL

* Tubo 0

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* 5 x 0 = Cf x 2

* Cf= Ø

* Tubo 1

* 5 x 0.020 = Cf x 2

* Cf = 0.050 mg/mL

* Tubo 2

* 5 x 0.050 = Cf x 2

* Cf = 0.125 mg/mL

* Tubo 3

* 5 x 0.100 = Cf x 2

* Cf = 0.250 mg/mL

* Tubo 4

* 5 x 0.150 = Cf x 2

* Cf = 0.375 mg/mL

* Tubo 5

* 5 x 0.200 = Cf x 2

* Cf = 0.5 mg/mL

3. Anexos

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3.1 Gráfico curva padrão

3.2 Tabelas 1, 2 e 3

Reagentes (µl) | Tubo 0 | Tubo 1 | Tubo 2 | Tubo 3 | Tubo 4 | Tubo 5 | Amostra 1 | Amostra 2 |

Amostra | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | 20 µl | 50 µl |

BSA | ---- | 20 | 50 | 100 | 150 | 200 | ---- | ---- |

Biureto | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |

qsp de H2O para 2 ml | 1000 | 980 | 950 | 900 | 850 | 800 | 980 | 950 |

Concentração final (Cf)| ---- | 0.05 | 0.125 | 0.250 | 0.375 | 0.5 | ---- | ---- |

Absorvância | 0 | ---- | ---- | 0.1101 | 0.1235 | 0.1235 | ---- | 0.0747 |

Tabela [ 1 ]

Reagentes (µl) | Amostra 1 | Amostra 2 |

Concentração final (Cf) (mg/mL) | 0.2725 | 0.1925 |

Tabela [ 2 ]

Reagentes (µl) | Amostra 1 | Amostra 2 |

Concentração inicial (Vi) (mg/mL) | 27.25 | 7.7 |

Tabela [ 3 ]

4. Conclusão

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Através da Curva Padrão pude concluir que os valores da concentração final de A1 e A2 são, respectivamente, 0.2725 e 0.1925.

E que o valor de Ci de A1 e A2 são:

Ci=2*Cf(A1)0.020 (=) Ci= 2*0.27250.020 (=) Ci= 27.25 mg/mL

Ci=2*Cf(A2)0.050 (=)Ci=2*0.19250.050 (=) Ci= 7.7 mg/mL

5. Bibliografia

Júnior, J. C. O., Oliveira G. B., Oliveira, T. M. (31/3/2010) http://pt.scribd.com/doc/30281853/FOTOCOLORIMETRIA-E-ESPECTROCOLORIMETRIA- Fracionamento-das-proteinas-do-leite-e-sua-dosagem-pelo-metodo-do-Biureto consultado em 26/11/2011

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