ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo do isolamento de microrganismos, meios de cultura, diversidade microbiana, Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

SETOR DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Trabalho acadêmico apresentado à

disciplina Processos Fermentativos

Industriais da Universidade Federal

do Paraná.

CURITIBA

2008

1

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO................................................................................................ 2

1.1- MEIOS DE CULTURA.............................................................................. 5

2- DIVERSIDADE MICROBIANA........................................................................ 7

3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SÓLIDO........................................................... 13

3.1- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS........................................... 13

3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO............................. 14

3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO........................... 16

3.4- TÉCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE................................ 17

4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LÍQUIDO......................................................... 17

5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTÍNUO..................................................... 18

6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS........................................................... 21

7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS.................................................. 21

8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS................................................................. 23

9- CULTURAS PURAS DE ALGAS.................................................................... 23

10- OUTRAS TÉCNICAS.................................................................................... 23

11- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 25

12- ANEXOS....................................................................................................... 27

2

1- INTRODUÇÃO

Isolamento consiste na obtenção de culturas puras que envolvem somente o

organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleção de uma colônia

através da observação da produção de determinado produto ou da morfologia da

colônia (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

Apesar de existir a possibilidade de utilizar microrganismos geneticamente

modificados, ainda é possível encontrar uma grande variedade de novos

microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser até comercialmente

interessantes. A primeira etapa para a utilização de um microrganismo de interesse

industrial muitas vezes é a etapa de isolamento de uma colônia.

Normalmente, as colônias de microrganismos se originam somente de uma

célula ou esporo de microrganismo. Essas colônias apresentam características

morfológicas diferentes, as quais permitem a distinção entre os microrganismos,

como mostra a Figura 1. No entanto, para conseguir uma visualização das colônias

independentes no meio sólido, é necessário a distribuição uniforme das bactérias

sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2006)

Figura 1- Morfologia de colônias bacterianas

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o

microrganismo de interesse está presente de forma homogênea é denominada

cultura axênica. Um cultivo desse tipo dá oportunidade de investigação de

3

características fisiológicas e genéticas sem a interferência de outros microrganismos

e em uma densidade populacional muito maior do que a encontrada em amostras de

meio ambiente. No entanto alguns fatores podem ser alterados justamente por esse

motivo, pois no meio ambiente ocorre uma interação entre diversas espécies e

nutrientes, podendo, por exemplo, modificar o formato, a textura e a coloração de

colônias (OGUNSEITAN, 2005).

O isolamento, assim como todo o processo que irá se desenvolver

futuramente, deve ser o mais econômico possível, levando-se em consideração a

produtividade que será obtida pelo microrganismo e os gastos necessários para

isolamento de tal microrganismo. Fatores importantes na escolha de um

microrganismo são as suas características nutricionais, pois se almeja obter

microrganismos que utilizem substratos baratos, que podem ser obtidos através da

formulação adequada do meio de isolamento; a temperatura ótima, pois organismos

com temperatura ótima de 40ºC para cima facilitam o isolamento e reduz os custos

de resfriamento do fermentador; ser compatível com o fermentador utilizado e com o

processo de cultivo desejado; e deve ser geneticamente estável, ou quando se

deseja a manipulação genética devem ser conhecidos os melhores mecanismos

(STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

Os microrganismos isolados podem ser obtidos a partir de ambientes naturais

ou a partir de bancos de cepas. Esses centros de cepas, como os mostrados na

Tabela 1, podem fornecer microrganismos de características já conhecidas, mas

nem sempre estão presentes os melhores caracteres desejados, enquanto o

ambiente possui uma infinidade de variações. Os bancos de culturas têm como

função o armazenamento, a prevenção de eventuais mudanças nas suas

características, o ensino e a pesquisa sobre manutenção e caracterização de cepas

(ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988).

Pode ser mais barato comprar uma cultura do que isolá-la da natureza, mas

também pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma

procura extensa no meio ambiente. Mas geralmente é necessário utilizar uma cepa

dos bancos como uma referência para comparação com novos microrganismos

descobertos através do isolamento da natureza (STANBURY, WHITAKER E HALL,

1995).

4

Tabela 1 – Principais centros de coleção de culturas

Fonte: ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988.

O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provável de conter o

microrganismo desejado, podendo variar desde solo até águas, ar, lodo, alimentos

ou órgãos. Características que um determinado organismo possui para se

5

desenvolver em certo ambiente são usadas como fatores seletivos no processo de

isolamento.

Pressão seletiva é muitas vezes utilizada no isolamento de microrganismos

que se desenvolvem preferencialmente em determinado substrato, na presença de

certos compostos ou no cultivo sob condições que são adversas a outros

microrganismos que não são de interesse.

Quando não é possível fazer uso da pressão seletiva, utilizam-se

características detectáveis como morfologia (tipo e forma da colônia) ou produção de

compostos característicos de determinada espécie (como, por exemplo, a produção

de antibióticos por estreptomicetos) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

1.1- MEIOS DE CULTURA

Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de

cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura é um material

nutriente preparado em laboratório cuja utilização é importante para o crescimento,

transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes

emprega-se o ambiente natural como modelo de composição, pois os requerimentos

nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado

(PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintéticos

(quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintéticos são aqueles em

que a composição química exata é conhecida. Alguns microrganismos necessitam

de um meio definido com muitos fatores necessário para o crescimento e são

denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios

quimicamente definidos são utilizados normalmente em trabalhos experimentais em

laboratórios ou para o crescimento de seres autotróficos (TORTORA et al., 2006).

Já os meios complexos são aqueles que apresentam algum componente que

tem uma composição variável. Nesse caso estão incluídos extratos de leveduras, de

carne, de plantas ou produtos da digestão protéica como peptonas. Quando o meio

complexo está na forma líquida é chamado de caldo nutriente e quando está na

forma solidificada é chamado de ágar nutriente. Esses meios são utilizados

normalmente para bactérias heterotróficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios

complexos também são usados quando não as necessidades nutricionais de um

6

microrganismo em particular não são conhecidas e, portanto, um meio definido não

pode ser construído (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

No caso de microrganismos anaeróbios deve-se utilizar um meio especial

denominado meio redutor. Eles contêm reagentes como o tioglicolato de sódio que é

capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido, eliminando-o da cultura

(TORTORA et al., 2006).

Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vários tipos de

microrganismos são chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth.

Quando esses meios são complementados com algumas substâncias de forma a

fortificá-lo, temos então um meio enriquecido.

Quando há substâncias que favorecem o crescimento de determinado

organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de

meios seletivos. Nesses meios há componentes como sais de bile e cristal violeta

(inibem o desenvolvimento de bactérias gram-positivas), substratos degradados

somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibióticos (PRESCOTT, HARLEY

e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo também podem ser diferenciais quando é possível

distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no

ágar sangue é possível separar bactérias hemolíticas (que formam um halo ao seu

redor) de não-hemolíticas (que não formam halo), ou no ágar MRS com corante azul

de anilina, onde as bactérias lácteas irão ficar azuladas e outros microrganismos

não.

Também existem os meios de enriquecimento, que são utilizados no

isolamento de bactérias presentes em pequeno número junto com outras que estão

em grande quantidade. Ele é semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferença é

que o microrganismo a ser cultivado está em pequena quantidade e seu crescimento

deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). A tabela 2 resume todos esses meio e

em que ocasiões eles devem ser utilizados.

7

Tabela 2- Meios de Cultura

Tipo Finalidade

Quimicamente

definido

Crescimento de quimioautotróficos e autotróficos e análises

microbiológicas.

Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotróficos.

Redutor Crescimento de anaeróbios obrigatórios.

Seletivo Impedir o crescimento de microrganismos não desejados;

favorecer o crescimento do organismo de interesse.

Diferencial Diferenciar colônias do organismo de interesse dos outros

microrganismos.

Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a característica importante de

aumentar o número de bactérias de interesse tornando-a

detectável.

Fonte: TORTORA et al., 2006.

2- DIVERSIDADE MICROBIANA

O termo diversidade, no contexto biológico, define a multiplicidade de formas

presente em um sistema, sendo que muitas vezes essas diferentes formas só ficam

aparentes através da utilização de ferramentas especializadas de observação.

Essas ferramentas podem ir desde a visualização através de microscópio ou até

uma análise em nível molecular.

No entanto, mesmo com toda a tecnologia disponível, não é possível obter

uma informação completa sobre todos os microrganismos presentes em uma

amostra de ambiente, devido à inadequação de certos microrganismos às técnicas

de recuperação, isolamento e cultivo utilizadas atualmente. Esses microrganismos

não cultiváveis ainda são metabolicamente ativos e são chamados de “viáveis, mas

não cultiváveis” (VBNC – viable but non-culturable) ou de somnicélulas ou

“dormentes não-esporuladas”. Portanto, muitos microrganismos presentes na

natureza ainda não formaram colônias viáveis sob condições laboratoriais e somente

10% (ou menos) é passível de ser cultivado em laboratório. A figura 2 esquematiza

os microrganismos possíveis de serem cultivados (ativos, danificados e dormentes)

e aqueles não-cultiváveis (VBNC, inativas, e mortas) (OGUNSEITAN, 2005).

8

Figura 2- Estados fisiológicos dos microrganismos e possibilidade de cultivo

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Para os organismos cultiváveis, ainda pode haver uma diferença na sua

atividade na natureza e sob condições laboratoriais. Por exemplo, as cianobactérias

Trichodesminium são capazes de formar colônias em laboratório, mas na natureza

são encontradas somente na forma individualizada.

A maioria das tentativas de isolamento tenta proporcionar uma condição

balanceada de nutrientes como fonte de carbono, condições ótimas de temperatura,

pH, pressão de oxigênio e umidade. Algumas espécies requerem também fatores de

crescimento, sendo que alguns deles podem estar sendo produzidos por outras

espécies que convivem junto no meio ambiente. A simulação de um ambiente

natural é um bom começo para o isolamento e cultivo desses microrganismos.

(OGUNSEITAN, 2005)

Devido à grande diversidade de microrganismos presentes no meio ambiente,

é possível encontrar numa amostra ambiental características nutricionais variadas,

as quais definem o tipo de meio de isolamento a ser utilizado. Pode-se fazer uma

distinção com relação às fontes de energia, fontes de carbono e os oligoelementos.

9

A figura 3 mostra as diferentes combinações dessas características e a classificação

dos microrganismos com relação a elas.

Figura 3- Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Meios de cultivo seletivo ou condições seletivas de incubação podem ser

usados para estreitar a variedade de espécies em uma comunidade microbiana. O

uso de meios enriquecidos com determinado substrato limitante possibilita um maior

crescimento de determinadas espécies em detrimento de outras. Por exemplo,

Beijerinck isolou espécies de Rhizobium de nódulos de raízes através do

enriquecimento por substratos nitrogenados limitantes; estudos recentes usando

enriquecimento também conseguiram descobrir espécies capazes de metabolizar

moléculas xenobióticas e antropogênicas de poluentes. A técnica de enriquecimento

também pode ser chamada na literatura de bioaugmentation ou molecular breeding

(OGUNSEITAN, 2005).

As interações entre microrganismos no ambiente podem ser muito

importantes, e, quando não se deseja utilizar somente um microrganismo isolado,

pode-se fazer uso de dois tipos de culturas: culturas de populações mistas ou

culturas de comunidades microbianas. A primeira consiste na combinação de duas

10

ou mais culturas puras enquanto exclui outros microrganismos, pois é feito em

condições assépticas. Culturas de comunidades microbianas já incluem interações

entre fatores bióticos e abióticos, podem ocorrer variações da composição das

espécies microbianas devido a essas condições. Elas são mantidas em

microcosmos que são estruturados para incubar amostras naturais em laboratório,

sendo importantes na investigação de como mudanças ambientais tem reflexo na

diversidade microbiana. (OGUNSEITAN, 2005)

Há uma grande diversidade de populações microbianas, sendo que em cada

ambiente será encontrado um nicho diferente. Pequenas distâncias como milímetros

no solo podem ter uma condição de oxigênio, luz e nutrientes diferente que propicia

o desenvolvimento de variados microrganismos. A tabela 3 mostra a quantidade de

microrganismos estimada no solo dependendo da profundidade estudada. Esse

número não é certo, pois não é possível isolar em uma placa para contagem todos

os tipos de microrganismos presentes na natureza (TORTORA et al., 2006).

Tabela 3- Microrganismos por grama de um solo típico de jardim em várias

profundidades.

Profundidade (cm) Bactérias Actinomicetos* Fungos Algas**

3-8 9.750.000 2.080.000 119.000 25.000

20-25 2.179.000 245.000 50.000 5.000

35-40 570.000 49.000 14.000 500

65-75 11.000 5.000 6.000 100

135-145 1.400 - 3.000 -

* Bactérias filamentosas

** Algas encontradas em grandes profundidades não são ativas metabolicamente, mas foram

introduzidas por drenagem ou movimentos mecânicos.

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Além dos solos, também podem ser isolados microrganismos do ambiente

aéreo, aquático. No ambiente aquático, as populações microbianas são afetadas

principalmente pela disponibilidade de oxigênio, nutrientes e luminosidade. Para

algas fotossintéticas a luz é a fonte de energia principal e, portanto, elas se

localizam próximas à superfície. Esses organismos são importantes para o ambiente

porque também são fontes de alimento para bactérias, protozoários, peixes e outras

11

formas de vida aquática. Como o oxigênio não se difunde bem na água, perto do

fundo de um lago estarão microrganismos anaeróbicos. A Figura 4 mostra um lago

em três zonas de características diferentes e os microrganismos mais prováveis de

serem encontrados em cada uma (TORTORA et al., 2006).

Figura 4- As zonas de um lago e os microrganismos típicos de cada zona

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Podemos ver também a variação dos tipos de microrganismos encontrados

de acordo com cada porção de um ambiente através da coluna de Winogradsky

(Figura 5). Ela consiste de uma coluna de 30 cm de altura por 5 cm de diâmetro

onde há a deposição de um terço do volume com sedimento de rio ou lago e a

complementação com água do mesmo ambiente. É então feito o cultivo por dois a

três meses e, após esse período é possível isolar microrganismos devido ao

gradiente químico. Será possível encontrar microrganismos representantes de cada

uma das categorias apresentadas anteriormente na Figura 3. (OGUNSEITAN, 2005)

12

Figura 5- Separação de microrganismo de acordo com o gradiente químico

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Devido à grande quantidade de microrganismos presentes em um meio

natural altamente competitivo, eles tentam explorar todas as vantagens fisiológicas e

metabólicas possíveis para ter um desenvolvimento melhor em relação aos outros

microrganismos competidores. Eles devem utilizar os nutrientes comuns mais

rapidamente, utilizar nutrientes que outros não consigam metabolizar e ainda se

possível produzir metabólitos que inibem o crescimento de concorrentes. Por

exemplo, bactérias lácticas são capazes de tornar um nicho inóspito para

organismos competidores através da produção de ácido lático que irá acidificar o

meio e inibir alguns outros organismos (TORTORA et al., 2006).

Microrganismos que se desenvolvem em ambientes que apresentam

condições extremas de temperatura, salinidade, acidez ou alcalinidade são

chamados de extremófilos. Seu isolamento tem sido muito importante atualmente

devido à possibilidade de cultivá-los sem que haja contaminações ou o uso de suas

13

enzimas em condições que desativam outras que não são de interesse, como no

caso da Taq polimerase utilizada no processo de PCR. (OGUNSEITAN, 2005)

3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SÓLIDO

Esse método é usado para o isolamento de certos produtores de enzimas,

usando meios seletivos contendo o substrato que podem ser degradados pelas

enzimas produzidas pelos microrganismos desejados.

Os estudos iniciais feitos pelo bacteriologista alemão Robert Koch foram

muito importantes para a obtenção de culturas puras. Antigamente, as tentativas de

isolamento eram feitas somente através de meios líquidos, sendo assim muito difícil

isolar microrganismos como bactérias. Em 1881, Koch fez uma tentativa de cultivo

sólido em superfície de batata. Por volta do mesmo tempo, um associado de Koch,

Frederick Loeffler, desenvolveu o extrato de carne peptonado para o cultivo de

bactérias patogênicas, e Koch tentou solidificar esse meio (PRESCOTT, HARLEY e

KLEIN, 2002). Ele conseguiu através da mistura do meio com gelatina em um

suporte sólido que permitia a sua solidificação, mas tinha a desvantagem de se

liquefazer à temperatura superiores a 28ºC e ser degradada por várias espécies

microbianas que possuem gelatinase (LECLERC et al., 1983).

Por volta do ano de 1882, passou-se a se utilizar ágar como agente

solidificante, que foi descoberto por Minora Tarazaemon, um japonês dono de uma

hospedaria, ao perceber que uma sopa de algas tinha gelificado após uma noite fria

(PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Outro agente solidificante é o ácido silícico,

o qual é quimicamente definido. Ele é importante na preparação de meios que

devem ser rigorosamente definidos (LECLERC et al., 1983).

3.1- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS

Esse método também é chamado de esgotamento de alça. Através de uma

alça de platina, de um fio de platina ou até mesmo um swab, coleta-se uma pequena

parcela do meio de inóculo e o espalha sobre uma placa de Petri com ágar fazendo

movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem

várias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontínua ou contínua

(DROVAL, LIMA e HABU, 2001). A forma descontínua seria feita como mostrado na

14

figura 6, onde são feitas estrias na porção 1 da placa e em seguida flamba-se a alça;

após, faz-se uma retirada de bactérias da região 1 e espalha-se sobre a região 2;

flamba-se mais uma vez e espalha-se bactérias da região 2 na 3. As colônias

presentes na região 3 estarão mais isoladas (TORTORA et al., 2006).

Fazendo de forma contínua, haveria primeiramente a coleta de uma pequena

quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma das bordas da

placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de estrias até a outra

borda da placa (DROVAL, LIMA, HABU, 2001). LECLERC e colaboradores (1983)

descrevem a semeadura por estrias feita em duplicata em uma mesma placa,

percorrendo a alça ou fio de platina somente até o centro da placa, e do lado oposto

fazendo o mesmo procedimento. As colônias isoladas estarão mais ao centro e,

através da repetição, poder-se-ia obter microrganismos que estavam presentes na

segunda amostra do inóculo, porém não presente na primeira.

Figura 6- Semeadura por estrias com alça de platina

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.

3.2- TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO

Nessa técnica, que é mostrada na figura 7, um pequeno volume da solução

de microrganismos contendo de 30-300 células é transferido para o cento de uma

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