ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas -  Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo isolamento de microrganismos, Semeadura por espalhamento, técnicas de semeadura, isolamento em cultivo líquido.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

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placa de ágar já solidificado com o auxílio de uma pipeta estéril. Em seguida,

mergulha-se uma alça de Drigalski em álcool e a flamba de modo a manter todo o

material estéril. Com o auxílio dessa alça, espalha-se aquele volume depositado por

toda a superfície do ágar. As colônias cresceram espalhadas por toda a superfície

do ágar. (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002)

Figura 7- Semeadura por espalhamento

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

O espalhamento pode ser feito também empregando outros materiais.

GREENE e colaboradores testaram a utilização do aparato mostrado na figura 8,

que consiste de um anel cilíndrico metálico com uma tira de material fibroso. Ao

botar em contato o material fibroso e a amostra de inóculo líquida, por exemplo, os

microrganismos irão se fixar na fibra e estão carimba-se meios de cultivo estéreis

sucessivamente, de modo a obter colônias cada vez mais isoladas e definidas.

Figura 8- Aparato para semeadura do meio

Fonte: GREENE, VERSLEY e KEENAN, 1962.

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3.3- TÉCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO

O método de semeadura por derramamento, ou também denominado de pour

plate é muito utilizado para bactérias e fungos. A amostra original é diluída de forma

que quando é feita a placa consegue-se colônias bem separadas. Um pequeno

volume da melhor diluição é então derramado em uma placa de Petri sem ágar. Em

seguida, derrama-se ágar fundido na temperatura de 45ºC e mistura-se os dois com

uma agitação leve da placa e deixa-se o meio solidificar.

Figura 9- Comparação entre o método de pour plate e de espalhamento

Fonte: TORTORA et al., 2006.

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Esse método permite o crescimento de colônias na superfície e dentro do

ágar, pois algumas células foram misturadas no ágar durante a sua solidificação,

como pode ser verificado na Figura 9, onde há a comparação do crescimento após a

semeadura por pour plate e por espalhamento (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN,

2002).

A maioria dos fungos e bactérias não é morta pela breve exposição ao ágar

quente, mas microrganismos sensíveis ao calor certamente podem ser danificados

pelo ágar fundido e ficarem impossibilitados de formarem colônias. Além disso,

quando se deseja identificar microrganismos através da morfologia da colônia, esse

método não é muito indicado, pois as colônias presentes dentro do ágar não

fornecerão dados corretos. (TORTORA et al., 2006)

3.4- TÉCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE

Faz-se a utilização da agulha de platina e semea-se o material contido nela

picando um ágar sólido contido num tubo (Figura 10). Com isso haverá o

crescimento de microrganismos em anaeróbio-se no fundo e aerobiose perto da

superfície do ágar.

Figura 10- Semeadura em profundidade

Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001.

4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LÍQUIDO

Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de

determinada população microbiana são geralmente líquidos. Após o crescimento

avantajado então ocorre o isolamento de determinadas células. Isso pode ser feito

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como mostrado nas técnicas em estado sólido ou através de uma série de diluições

em meio líquido.

Fazendo uma diluição em novo meio estéril, como na figura 11, espera-se que

em certo momento se obterá culturas provenientes de somente uma única célula. É

dessa forma que é feita o isolamento e a contagem de células de Escherichia coli

em águas ou alimentos, por exemplo (LECLERC et al., 1983).

Figura 11- Série de diluição para isolamento de um microrganismo

Fonte: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTÍNUO

Métodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento de

um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele deverá produzir

um número muito maior de células do que em relação aos outros.

Cultivo em meio de enriquecimento é geralmente feito em Erlenmeyers. No

entanto, o crescimento de um determinado organismos oriundo de uma amostra

variada na forma de batelada pode resultar numa mudança das condições do meio,

e, portanto, ocorre uma variação nas pressões seletivas. Isso pode ser reajustado

inoculando uma parcela desse meio de enriquecimento em um novo meio idêntico

ao inicial. Após um bom desenvolvimento do microrganismo desejado, semea -se

uma alíquota em meio sólido (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

A prevalência do microrganismo desejado com relação aos outros dependerá

da taxa máxima de crescimento dele com relação aos outros organismos capazes

de também crescer no meio. Portanto, aquele capaz de crescer mais rapidamente

com os substratos disponíveis poderá ter um número maior de células.

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No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento é o

desejável, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato

limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contínuo, onde novo meio de cultivo é

adicionado de tempos em tempos e as pressões seletivas são restauradas

(STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

Em um cultivo contínuo, a taxa de crescimento depende da taxa de diluição e

da concentração do substrato limitante. Para definir isso, deve-se partir da equação

de Monod, mostrada na fórmula 1:

(1)

onde μ é a taxa de crescimento , s é a concentração do substrato residual, Ks é a

constante de utilização do substrato (que expressa a afinidade do microrganismo

para o consumo do substrato).

No estado estacionário, temos que μ é igual a taxa de diluição (D),

transformando a fórmula em:

(2)

onde é a concentração do substrato no reator, que será constante no estado

estacionário.

Como mostrado pela fórmula 2, se o substrato estiver abaixo do nível da taxa

de crescimento predita pela taxa de diluição, pode ocorrer que a taxa de crescimento

será menor que a taxa de diluição e as células serão eluídas do reator (wash out)

numa taxa maior do que a taxa de sua produção, resultando na diminuição na

concentração de biomassa desse microrganismo (STANBURY, WHITAKER E HALL,

1995).

Como exemplo genérico de um processo de isolamento usando cultivo

contínuo temos a Figura 12, em que temos dois microrganismos em cultivo contínuo,

onde, se a taxa de diluição for menor do que a do ponto Y, o organismo B se

desenvolverá mais, mas quando a taxa de diluição é maior, temos o organismo A se

desenvolvendo preferencialmente. Portanto, o cultivo será limitado pelo substrato,

podendo ser obtidos microrganismos que não seriam detectados durante o cultivo

em batelada.

Os organismos obtidos através do cultivo em batelada ou em placas de Petri

podem muitas vezes não se adaptar ao cultivo contínuo, sendo mais vantajoso fazer

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o isolamento diretamente através do cultivo contínuo para selecionar aqueles já

adaptados para essa condição quando deseja-se desenvolver um processo em

sistema contínuo.

Figura 1- Efeito da concentração do substrato na taxa de crescimento de dois

microrganismos.

Fonte: STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995.

Essa técnica é bastante utilizada na seleção de microrganismos para a

produção de biomassa, mas também já foi usada para o isolamento de bactérias

produtoras de enzimas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

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6- CULTURAS PURAS DE BACTÉRIAS

Ao fazer o isolamento das culturas, não só de bactérias, mas também de

outros microrganismos, deve-se fazer uma coleta de material ambiental com

instrumentos estéreis.

Bactérias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo necessita de

um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam ágar suplementado com

extratos na concentração de 10 a 50% do volume total, outras necessitam de

infusões feitas do material da onde foram coletadas (solo, lama, folhas, pedras,

troncos, detritos). Podem ser usados também alguns meios seletivos como ágar

sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey (DEMAIN and DAVIES, 1999).

7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS

Actinomicetos são bactérias filamentosas que fazem parte da maioria dos

substratos naturais. Não é difícil isolar actinomicetos de amostras que também

contém fungos devido às suas propriedades fisiológicas distintas. O uso de

antibióticos e antifúngicos também auxilia no isolamento, como mostra a tabela 4.

Tabela 4- Antibióticos usados e microrganismos alvo que são inibidos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20 dias

para formarem colônias definidas quando incubadas à temperatura de 65-80ºC

(DEMAIN and DAVIES, 1999). O crescimento desses microrganismos também é

favorecido quando há no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 5:

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Tabela 5- Substâncias que estimulam o desenvolvimento de actinomicetos em geral

e actinomicetos produtores de antibióticos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

El-Nakeeb e Lechevalier compararam meios de cultivo no isolamento de

actinomicentos. Pela tabela 6 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos

variando a fonte de carbono e nitrogênio e o tipo de meio utilizado.

Tabela 6- Comparação de meio AGS com meio de chitin e efeito das fontes de

carbono e nitrogênio no meio*

Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.

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8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS

Fungos podem ser isolados de diversos materiais. Devido à sua preferência

por substratos que também forneçam suporte para o seu crescimento, eles são

freqüentemente encontrados em matéria em decomposição, plantas, rochas e solo.

Em uma planta, por exemplo, dependendo do tecido que for coletado, pode-se

encontrar diferentes tipos de fungos.

Esses microrganismos também são bastante variados, e a mudança de

somente um dos constituintes de um meio de cultivo pode resultar no isolamento de

um fungo diferente. Para a seleção de um meio, deve-se considerar as condições

físicas do meio de origem e o tipo de fungo que se deseja. A luminosidade também é

um fator importante às vezes, pois alguns fungos necessitam de luz para frutificarem

(DEMAIN and DAVIES, 1999).

Macrofungos tem o isolamento facilitado, pois é possível isolá-los do ambiente

através da coleta de tecidos, esporos ou estruturas vegetativas.

9- CULTURAS PURAS DE ALGAS

Para isolar eficientemente algas, é necessário simular em parte o ambiente

onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade, luminosidade.

Métodos de diluição são bastante indicados nesse caso, uma vez que algas e

microalgas são normalmente encontradas em meio líquido. A filtragem de amostras

e posterior inoculação do filtro em novo meio estéril também é um método utilizado.

10- OUTRAS TÉCNICAS

O avanço da biologia molecular, da genética e da imunologia permitiu o

desenvolvimento de novos métodos de isolamento com o uso de detectores,

enzimas e receptores de determinados microrganismos. Abaixo estão listados

alguns exemplos:

 A utilização de organismos testes com sensitividade elevada para

determinado antibiótico podem indicar onde estão os microrganismos

produtores.

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 A clonagem de genes codificantes para enzimas ou receptores usados na

detecção de microrganismos pode fazer com que eles estejam mais

acessíveis em grande escala para a realização dos testes.

 O uso de genes repórteres, que codificam substâncias facilmente detectáveis

e que são fusionados com uma seqüência que produz a substância de

interesse.

 Sondas moleculares para seqüências de genes particulares podem detectar

microrganismos capazes de produzir certos produtos.

 O desenvolvimento de testes imunológicos como a captura por ELISA.

(STANBURY, WHITAKER e HALL, 1995)

Com relação a esse último, a técnica de imunocaptura pode ser utilizada no

isolamento de bactérias. SANTOS e REIS (artigo em anexo 1) utilizaram essa

metodologia para isolar Gluconacetobacter diazotropicus e de bactérias fixadoras de

nitrogênio proveniente do solo. Para o isolamento de G. diazotropicus fez-se uso de

anticorpos anti-Gluconacetobacter diazotropicus fixados em uma microplaca de

poliestireno de 96 poços, onde é colocada a amostra de solo. Após as etapas de

incubação e lavagem, a ligação da bactéria com o anticorpo foi quebrada com a

adição de KCl 0,1M. A desvantagem dessa técnica é que é necessário o

conhecimento prévio do microrganismo que se deseja isolar e deve-se fazer o

inóculo de suas células mortas em cobaias como coelhos para a produção de

anticorpos.

As técnicas de micromanipulação também podem ser utilizadas para o

isolamento, apesar de serem mais caras devido aos equipamentos. Com o uso de

objetivas de longa distância com uma grande magnificação, é possível coletar uma

única célula microbiana através de tubos microcapilares, que irão aspirar a bactéria

e depois depositá-la em uma outra superfície de ágar ou em um meio líquido (para

mais, ver artigo em anexo 2).

Existe também a possibilidade de utilizar a citometria de fluxo para separar

células de microrganismos. Essa técnica utiliza anticorpos marcados, sondas de

nucleotídeos marcadas fluorescentemente ou constituentes celulares que

naturalmente refratam a luz ou emitem fluorescência. A Tabela 1 presente no anexo

3, mostra propriedades de certos microrganismos que podem ser diferenciadas

através da citometria de fluxo, podendo-se então isolar essas células.

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11- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and

Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p.

DROVAL, A. A.; LIMA, D. P.; HABU, S. Manual Prático de Microbiologia de

Alimentos. Curso de Microbiologia de Alimentos, Manual do Participante.

CEFET/PR – Unidade de Medianeira, 2001.

EL-NAKEEB, M. A.; LECHEVALIER, H. A. Selective isolation of aerobic

actinomycetes. Appl. Microbiol., Vol. 11, p. 75-77, 1963.

FRÖHLICH, J.; KÖNIG, H. New techniques for isolation of single prokaryotic

cells. FEMS Microbiology Reviews, 24, p. 567-572, 2000.

GREENE, V. W.; VERSLEY, D.; KEENAN, K. M. New Method for Microbiological

Sampling of Surfaces. J. Bacteriol., Vol. 84, p.188-189, 1962.

KATSURAGI, T.; TANI, Y. Screening for Microorganisms with Specific

Characteristics by Flow Cytometry and single-Cell Sorting. Journal of bioscience

and Bioengineering, Vol. 89, No. 3, p. 217-222, 2000.

LECLERC, H.; IZARD, D.; HUSSON, M.-O.; WATTRE, P.; JAKUBCZAK, E.

Microbiologie Générale. Doin Éditeurs, Paris, 1983. 369 p.

OGUNSEITAN, O. Microbial Diversity – Form and Function in Prokaryotes.

Blackwell Publishing, Oxford, 2005, 292 p.

PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5th edition. The

McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.

ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L. R.; AZEVEDO, J. L. Tratado de Microbiologia –

Volume 1. Editora Manole Ltda., São Paulo, 1988, 186p.

26

SANTOS, C. C. R.; REIS, V. M. Desenvolvimento do Método de Imunocaptura de

Bactérias para Aplicação em Solo Argiloso. EMBRAPA, Comunicado Técnico 64,

ISSN 1517-8862, Março 2004, Seropédica, RJ.

STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation

Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357

p.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8ª edição, 1ª

reimpressão, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.

27

12- ANEXOS

ANEXO 1

DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO DE IMUNOCAPTURA DE BACTÉRIAS PARA

APLICAÇÃO EM SOLO ARGILOSO

CARLA CRISTIANE ROCHA DOS SANTOS e VERÔNICA MASSENA REIS

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ANEXO 2

NEW TECHNIQUES FOR ISOLATION OF SINGLE PROKARYOTIC CELLS

JÜRGEN FRÖHLICH and HELMUT KÖNIG

29

ANEXO 3

SCREENING FOR MICRORGANISMS WITH SPECIFIC CHARACTERISTICS BY

FLOW CYTOMETRY AND SINGLE-CELL SORTING

TOHORU KATSURAGI and YOSHIKI TANI

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