MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos meios de cultivo em bioprocessos industriais, necessidades nutricionais dos microrganismos, componentes do meio de cultivo.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

SETOR DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS

Trabalho acadêmico apresentado à

disciplina Processos Fermentativos

Industriais da Universidade Federal

do Paraná.

CURITIBA

2008

1

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 2

2.NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS........................... 6

2.1. BACTÉRIAS E FUNGOS .............................................................................. 8

2.2. ALGAS ........................................................................................................ 12

2.3. PROTOZOÁRIOS ....................................................................................... 13

2.4. CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS .............................................................. 14

3.COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO ........................................................ 15

3.1. FONTES DE CARBONO ............................................................................. 15

3.1.1.Bagaço de mandioca ........................................................................... 17

3.1.2.Bagaço e melaço de cana.................................................................... 19

3.1.3.Extrato de malte ................................................................................... 22

3.1.4.Melaço e vinhaça de soja..................................................................... 24

3.1.5.Casca e polpa de café ......................................................................... 25

3.1.6.Resíduos de frutas ............................................................................... 28

3.2. FONTES DE NITROGÊNIO ........................................................................ 29

3.2.1.Extrato de levedura .............................................................................. 30

3.2.2.Peptonas .............................................................................................. 31

3.2.3.Farelo de soja ...................................................................................... 32

3.2.4.Resíduos de extração de óleos ............................................................ 32

3.3. FONTES DE MINERAIS .............................................................................. 34

3.3.1.Vinhaça de cana .................................................................................. 36

3.4. SUBSTÂNCIAS QUELANTES .................................................................... 36

3.5. FATORES DE CRESCIMENTO .................................................................. 37

3.6. TAMPÕES................................................................................................... 38

3.7. ADIÇÃO DE PRECURSORES .................................................................... 39

3.8. ADIÇÃO DE INIBIDORES ........................................................................... 39

3.9. ADIÇÃO DE INDUTORES ........................................................................... 39

4.DESIGN DE MEIOS DE CULTIVO .................................................................... 40

5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 42

6. ANEXOS ............................................................................................................ 44

2

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de um processo biotecnológico requer o cultivo de células

microbianas em meio de cultivo adequado. Esse meio deve suprir todas as

necessidades nutritivas do microrganismo para a síntese do material celular e a

produção de metabólitos de interesse industrial.

Muitas vezes em escala laboratorial, utilizam-se meios de cultivo prontos

vendidos comercialmente. Esses meios são materiais nutrientes geralmente

sintéticos cuja utilização é importante para o crescimento, transporte e estocagem

de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes emprega-se o ambiente

natural como modelo de composição, pois os requerimentos nutricionais dos

microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele é encontrado (PRESCOTT,

HARLEY e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintéticos

(quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintéticos são aqueles em

que a composição química exata é conhecida. Alguns microrganismos necessitam

de um meio definido com muitos fatores necessário para o crescimento e são

denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios

quimicamente definidos são utilizados normalmente em trabalhos experimentais em

laboratórios ou para o crescimento de seres autotróficos (TORTORA et al., 2006).

Já os meios complexos são aqueles que apresentam algum componente que

tem uma composição variável. Nesse caso estão incluídos extratos de leveduras, de

carne, de plantas ou produtos da digestão protéica como peptonas. Quando o meio

complexo está na forma líquida é chamado de caldo nutriente e quando está na

forma solidificada é chamado de ágar nutriente. Esses meios são utilizados

normalmente para bactérias heterotróficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios

complexos também são usados quando não as necessidades nutricionais de um

microrganismo em particular não são conhecidas e, portanto, um meio definido não

pode ser construído (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002).

No caso de microrganismos anaeróbios deve-se utilizar um meio especial

denominado meio redutor. Eles contêm reagentes como o tioglicolato de sódio que é

capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido, eliminando-o da cultura

(TORTORA et al., 2006).

3

Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vários tipos de

microrganismos são chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth.

Quando esses meios são complementados com algumas substâncias de forma a

fortificá-lo, temos então um meio enriquecido.

Quando há substâncias que favorecem o crescimento de determinado

organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de

meios seletivos. Nesses meios há componentes como sais de bile e cristal violeta

(inibem o desenvolvimento de bactérias gram-positivas), substratos degradados

somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibióticos (PRESCOTT, HARLEY

e KLEIN, 2002).

Os meios de cultivo também podem ser diferenciais quando é possível

distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no

ágar sangue é possível separar bactérias hemolíticas (que formam um halo ao seu

redor) de não-hemolíticas (que não formam halo), ou no ágar MRS com corante azul

de anilina, onde as bactérias lácteas irão ficar azuladas e outros microrganismos

não.

Também existem os meios de enriquecimento, que são utilizados no

isolamento de bactérias presentes em pequeno número junto com outras que estão

em grande quantidade. Ele é semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferença é

que o microrganismo a ser cultivado está em pequena quantidade e seu crescimento

deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). O tipo de meio selecionado para o

cultivo dependerá da finalidade do cultura, como resume a Tabela 1.

No entanto, na indústria deseja-se baratear o processo de cultivo do

microrganismo, e para que isso seja atingido, são realizados testes com outras

fontes de carbono e nitrogênio. Muitos resíduos agroindustriais conseguem suprir de

maneira satisfatória as necessidades nutricionais de alguns microrganismos e

podem ser utilizados como um componente meio de cultivo de forma econômica. O

seu uso também tem um papel ambiental, pois evita o desperdício de material

aproveitável e a poluição da natureza por eles.

4

Tabela 1- Seleção de meios dependendo do objetivo do cultivo.

Fonte: MOO-YOUNG, 1985.

Os resíduos provenientes do processamento de materiais agrícolas fornecem

grandes oportunidades econômicas para a biotecnologia. Entre esses resíduos

estão o bagaço de mandioca, o bagaço de cana, a polpa e a casca de café, a polpa

de frutas, o melaço, e o farelo de soja. Eles já são utilizados em muitos processos

com sucesso, possibilitando a produção de etanol, enzimas, cogumelos, ácidos

orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários, bioativos, entre outros produtos

(PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007). O artigo em ANEXO 1 mostra essa

busca de fontes de nutrientes econômicas através da utilização de um dos resíduos

mais abundantes na natureza, os resíduos celulósicos. Verificou-se a eficiência de

5

crescimento dos fungos Aspergillus niger e Penicillium chrysogenum nesses meios

alternativos, obtendo-se um bom crescimento em serragem e em polpa de cana-de-

açúcar, mas em material somente com celulose teve-se um menor crescimento.

Para que seja atingido um bom rendimento na fermentação industrial

utilizando resíduos agroindustriais, é necessário:

 Ter um meio de cultivo equilibrado em nutrientes. Quando isso não ocorre

somente com a adição do resíduo, deve-se suplementar o meio com outras

fontes para atender a todas as necessidades fisiológicas da célula.

 A composição do meio deve ser invariável. Lotes novos devem ser

constantemente vistoriados para evitar mudanças, as quais ocorrem

naturalmente dependo da origem do material, do tipo de processo pelo qual

ele passou, entre outros.

 Ele não deve interferir em grande parte na recuperação do produto, pois ao

se economizar na matéria prima com meios complexos com várias impurezas,

pode-se estar aumentando o custo nos processos downstream de purificação.

 Não deve ocorrer repressão catabólica ou repressão por fosfato devido a

componentes do resíduo. Para evitar isso se pode modificar a concentração

de alguns nutrientes ou utilizar cepas mutantes que não sofrem repressão.

 O material residual utilizado como substrato deve ser o mais econômico

possível. Deve-se considerar se o material é facilmente disponível em

quantidades suficientes sem altos custos de transporte.

 O resíduo deve auxiliar o controle do processo (como o controle do pH) ou

pelo menos não dificultá-lo.

 O resíduo não deve precisar de tratamentos dispendiosos de preparo

anteriores à fermentação, pois encarece o processo.

 Os componentes do resíduo devem permitir algum tipo de armazenamento

por um período de tempo. O problema encontra-se em substratos que

apresentam grande atividade de água (aw), pois pode ocorrer contaminação

da amostra mais facilmente.

 O resíduo não deve causar grandes problemas no tratamento de efluentes

para a empresa (CRUEGER & CRUEGER, 1993; STANBURY, WHITAKER &

HALL, 1995).

6

2. NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS

Os componentes nutricionais do meio de cultivo dependerão do

microrganismo que está sendo cultivado. Cada organismo possui vias metabólicas

específicas para a obtenção de energia e produção de metabólitos, e elas devem ser

respeitadas. Não somente a diversidade de tipos de microrganismos (bactérias,

fungos, leveduras), mas também a variedade de espécies e cepas pode determinar

especificidades com relação às necessidades nutricionais (VOGEL & TODARO,

1997). A Figura 1 apresenta a divisão dos microrganismos com relação à fonte de

energia e de carbono utilizada.

Organismos fotoautótrofos são aqueles que absorvem energia luminosa e

utilizam dióxido de carbono como fonte de carbono. Essa categoria inclui as plantas

superiores, algas eucarióticas, algas azuis e verdes, e algumas bactérias

fotossintéticas (como as bactérias sulfúricas roxas e verdes). Já organismos

fotoheterótrofos absorvem energia na forma de luz, mas necessitam compostos

orgânicos como fonte de carbono. Eles não conseguem utilizar dióxido de carbono

como fonte primária e não produzem oxigênio. Nesse grupo estão bactérias

fotossintéticas conhecidas como bactérias não-sulfúricas roxas e algumas algas

eucarióticas (OGUNSEITAN, 2005; VOGEL & TODARO, 1997).

Os organismos fotossintéticos e os quimioautótrofos são os únicos reais

produtores de matéria orgânica no planeta, e eles propiciam, diretamente ou

indiretamente, as formas orgânicas de energia necessárias para os outros

microrganismos (VOGEL & TODARO, 1997).

Quimioautótrofos usam compostos químicos como doadores de elétrons para

a produção de energia, mas eles dependem da molécula de CO2 para a produção de

compostos com carbono presentes na biomassa. Esse grupo contém somente em

bactérias que podem reduzir compostos nitrogenados (NH3, NO2), íons de ferro,

compostos sulfúricos reduzidos (H2S, S, S2O3 2-), ou H2. Quimioheterótrofos utilizam

compostos químicos para a produção de energia e compostos orgânicos para a

biossíntese. Por exemplo, muitos organismos quimioheterótrofos utilizam a glucose

tanto como fonte de energia como fonte de carbono. Eles também conseguem

utilizar componentes mais complexos como lipídios, proteínas, carboidratos alifáticos

insaturados, e compostos aromáticos para a produção de energia. Esse grupo

7

compreende uma grande variedade de microrganismos, incluindo fungos e a maioria

das bactérias (OGUNSEITAN, 2005; VOGEL & TODARO, 1997).

Figura 1- Classificação de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Como os quimioheterótrofos são a grande maioria e tem grande importância

industrial, eles ainda podem ser divididos em organismos respiratórios, os quais

fazes a oxidação de substratos orgânicos e a redução de um agente inorgânico

oxidante que atua como aceptor de elétrons (usualmente o O2), e organismos

fermentadores, os quais utilizam compostos orgânicos na reoxidação de NADH

(VOGEL & TODARO, 1997).

Alguns organismos conhecidos como fastidiosos tem necessidades

nutricionais complexas, e não é possível cultivá-los em meios quimicamente

definidos. Como eles requerem muitos fatores de crescimento, é necessário usar

meios complexos para que ocorra o crescimento. A utilização de extrato de levedura

e outros resíduos agroindustriais pode suprir essas necessidades (OGUNSEITAN,

2005).

Além das fontes de energia e carbono, os microrganismos necessitam de

fontes de outros elementos como nitrogênio, minerais, oligoelementos e fatores de

8

crescimento, os quais são utilizados diferentes formas pela célula na formação de

biomassa e produtos metabólicos. A seguir serão discutidas as necessidades

nutricionais de alguns tipos de microrganismos de uma forma geral.

2.1. BACTÉRIAS E FUNGOS

Dos mais de 100 elementos presentes na tabela periódica, 35-40 são

nutrientes essenciais para microrganismos. No entanto, os mais importantes são

seis não-metais (C, H, O, N, P, S) e dois metais (K, Mg), compreendendo

aproximadamente 98% do peso seco de bactérias e fungos. A maior parte das

células (80-90%) é constituído de água, sendo esse outro fator importante para o

desenvolvimento do microrganismo. Os nutrientes citados acima são chamados de

macronutrientes, pois são utilizados em grande quantidade no cultivo de

microrganismos (Tabela 2).

Tabela 2- Macronutrientes, função fisiológica e concentração média em meios de

cultivo.

Fonte: MOO-YOUNG, 1985.

O carbono constitui aproximadamente 50% do peso seco de bactérias e

fungos. Alguns microrganismos como as Pseudomonas spp. podem utilizar mais de

9

90 tipos de compostos orgânicos como única fonte de carbono e energia, enquanto

outros, como bactérias metanogênicas, utilizam somente um número restrito de

substratos.

O nitrogênio contabiliza de 8 a 14% do peso seco de bactérias e fungos.

Existe uma variedade de compostos orgânicos e inorgânicos que podem ser

utilizados para suprir esse elemento em um meio de cultivo.

Praticamente todas as bactérias e fungos conseguem metabolizar a amônia

(NH4 +), pois é essa a forma na qual o nitrogênio é incorporado em compostos

orgânicos da célula. Ele é adicionado no meio de cultivo na forma de sais como

sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e cloreto de amônio (NH4Cl). O problema dessa fonte

encontra-se na diminuição do pH do meio durante a fermentação com íons amônio,

pois o sistema de transporte do íon para dentro da célula envolve a antitransporte de

íons hidrogênio para fora da célula (MOO-YOUNG, 1985).

Algumas bactérias conseguem utilizar o nitrogênio atmosférico (N2), fazendo

sua fixação no solo na forma de nitritos e nitratos e auxiliando a captação desse

nutriente pelas plantas. Organismos utilizados na produção de inoculantes agrícolas

devem apresentar essa característica. Apesar de o crescimento durante a fixação de

nitrogênio atmosférico ser lento devido às altas necessidades energéticas para o

processo, tem-se grande interesse nessa área de estudo para bactérias azuis e

verdes.

O nitrato também pode ser utilizado por muitos fungos filamentosos e

algumas bactérias e leveduras. Algumas bactérias também conseguem utilizar os

íons NO3 - como aceptor final de elétrons. Muitos fungos filamentosos e bactérias

também conseguem quebrar proteínas e peptídeos, sendo que este último também

pode ser quebrado por leveduras (MOO-YOUNG, 1985).

O hidrogênio e o oxigênio necessários para o crescimento já está presente na

maioria dos compostos orgânicos utilizados como fonte de carbono, e também em

moléculas de água presente na célula. Algumas bactérias conseguem utilizar H2

gasoso como fonte de energia, como as bactérias metanogênicas. O oxigênio,

diferente do hidrogênio, é necessário na forma de O2 para organismos aeróbicos.

O fósforo é necessário para várias reações e tem um grande efeito na

formação de metabólitos secundários. A forma mais utilizada é o fósforo inorgânico

(PO4 3-), sendo que soluções de fosfato também servem como tampões, auxiliando

no controle do pH. Outra fonte de fósforo é materiais orgânicos como glicerofosfato.

10

O enxofre é melhor assimilado por fungos e bactérias na forma de sulfato

inorgânico (SO4 2-). Ela pode ser obtida através da utilização de sais como o sulfato

de amônio, o qual serve simultaneamente como fonte de enxofre e nitrogênio. As

bactérias metanogênicas não conseguem utilizar os íons sulfato, e em alguns casos

esse composto é um inibidor, sendo necessário utilizar a forma mais reduzida (S2-).

No entanto o sulfeto é tóxico em altas concentrações e também causa a precipitação

de vários íons metálicos, causando uma deficiência em metais traço (MOO-YOUNG,

1985).

O potássio é o cátion inorgânico mais presente no interior da célula, ligando-

se nos ribossomos de procariotos, sendo cofator de várias enzimas, e estando

envolvido em vários sistemas de transporte. O magnésio é outro íon necessário para

bactérias e fungos, pois seus ribossomos necessitam dessa molécula. Ele também

atua como cofator enzimático e está presente em paredes e membranas celulares.

Com relação aos oligoelementos (também chamados de elementos traço ou

micronutrientes), é mais complicado definir as necessidades dos microrganismos,

pois as concentrações são muito baixas, como 10-9 mol/L. A determinação das

necessidades de elementos traço segue duas linhas de investigação.

Primeiramente remove-se totalmente o elemento do meio de cultivo. Se não

houver crescimento, faz-se uma adição gradual do elemento e observa-se a

resposta do crescimento. No entanto, a remoção total do elemento é difícil devido à

pureza dos outros componentes. Por exemplo, ao se analisar a grade analítica do

(NH4)2SO4, verifica-se que já estão presentes micronutrientes em quantidades

satisfatórias, como o Cu2+ e o Na+. Nos processos industriais, onde geralmente são

utilizadas fontes naturais como bagaço, melaço e farelo, esses oligoelementos

também já estão presentes em concentrações satisfatórias. Os materiais

constituintes dos frascos de cultivo e de biorreatores também podem fornecer esses

micronutrientes, como o Zn2+, o Co2+, e o Ni2+. Outra forma de se determinar a

concentração de micronutrientes é fazendo a composição básica da célula,

determinando a quantidade de cinzas da biomassa celular. No entanto, é possível

encontrar já trabalhos publicados que já estudaram quais os elementos necessários

para determinados microrganismos (MOO-YOUNG, 1985).

Algumas vezes a falta do elemento traço não causará a falta de crescimento

do microrganismo, mais sim num aumento da fase de adaptação (fase lag) e

diminuição na taxa de crescimento e no rendimento de produção de metabólito de

11

interesses. Isso pode ocorrer devido à substituição da função parcial do elemento

por outro elemento traço. A seguir serão mostrados alguns dos elementos traço com

relação a sua necessidade pelas células bacterianas e fúngicas e suas funções

biológicas para o desenvolvimento da biomassa:

 Elementos traços necessários por todas as bactérias e fungos (Mn, Zn, Fe): O

ferro está presente nos citocromos e nas ferrodoxinas, sendo que seus três

íons são cofatores enzimáticos. O ferro e o manganês são elementos traço

importantes na regulação do metabolismo secundário e na excreção de

metabólitos primários. Por exemplo, o fungo Aspergillus niger requer uma

deficiência desses dois íons para a excreção de ácido cítrico; o fungo

Penicillium chrysogenum necessita de deficiência em ferro para excretar

roboflavina. O zinco pode atuar em muitos casos como inibidor.

 Elementos traço necessários por muitas bactérias e fungos sob condições

específicas de crescimento (Cu, Co, Mo, Ca): Cobre é necessário para certos

componentes da cadeia respiratória e para algumas enzimas. Provavelmente

ele é necessário para todos os anaeróbios. Sua deficiência estimula a

produção de penicilina e ácido cítrico em alguns fungos. O cobalto está

presente em compostos corrinóidicos como a vitamina B12 sintetizada por

muitos procariotos. Molibdênio é um cofator da nitrato redutase e da

nitrogenase, sendo esse elemento necessário para o cultivo em meio

contendo somente NO3 - ou N2 como fontes de nitrogênio e também para

bactérias metanogênicas. O cálcio está presente em esporos de bactérias e é

cofator da α-amilase e de algumas proteases. Ele é geralmente transportado

para o exterior da célula, podendo ter um papel importante na estrutura de

proteínas da parede celular e em polímeros extracelulares.

 Elementos traço necessários para algumas bactérias e fungos sob condições

específicas de crescimento (Na, Cl, Ni, Se): O sódio é necessário para

algumas bactérias, sendo que nas metanogênicas sua função é mais

importante, pois aumenta o crescimento e a formação de metano. Ele já é

adicionado freqüentemente nos meios de cultivo nas formas de sais de

amônio e fosfato e na forma de hidróxido de sódio durante o ajuste do pH. O

transporte de Na também requer energia e uma maior quantidade de

potássio, pois ocorre um cotransporte. Cloro é necessário para halobactérias

e alguns microrganismos marinhos. Sua adição é precisa em meios

12

destinados a produção de antibióticos fúngicos contendo esse elemento,

como griseofulvina e cloro-tetraciclinas. Íons Cl-, Na+ e Ca2+ são geralmente

expelidos do citoplasma. O níquel é necessário para bactérias metanogênicas

e o selênio é necessário no metabolismo do formiato em alguns

microrganismos.

 Elementos raramente necessários (B, Al, Si, Cr, As, V, Sn, be, F, Sc, Ti, Ga,

Ge, Br, Zr, W, Li, I): esses elementos são especificações de determinados

microrganismos.

2.2. ALGAS

Os elementos necessários para algas são em geral os mesmos que para

fungos e bactérias. Os elementos traço necessários para algas eucarióticas são

praticamente os meios que os de plantas superiores.

Com relação às fontes de carbono, as algas fotossintéticas crescem em sua

maioria em ambientes aquáticos e utilizam o CO2 ou alguma de suas formas

ionizantes (H2CO3) como fonte de carbono. Quando utiliza-se a forma ácida em

solução, dependendo do pH do meio, o dióxido de carbono estará presente de uma

forma diferente. Em pH abaixo de 6,37, tem-se a forma H2CO3, em pH entre 6,37 e

10,25 predomina a forma HCO3 -, e em pH acima de 10,25 tem-se na maioria a forma

CO3 2-.

As algas heterotróficas podem utilizar com sucesso como fonte de carbono

acetato ou glucose. Eles crescem sem a presença de luz, mas algumas espécies

podem fotoassimilar carbono orgânico em condições de limitação de CO2.

O oxigênio presente na biomassa é obtido do dióxido de carbono e da água, a

qual também fornece hidrogênio. As algas utilizam a própria água do meio de cultivo

também como doador de elétrons.

Os íons amônio e NO3 - são utilizadas pela maioria das algas e bactérias

fotossintéticas, sendo que quando os dois são fornecidos ao mesmo tempo no meio

de cultivo, há uma preferência das células por utilizar o NH4 +. As algas procarióticas

também conseguem fazer fixação do nitrogênio atmosférico. As fontes orgânicas de

nitrogênio como a uréia, amidas e aminoácidos não são muito utilizadas devido à

dificuldade de permeabilidade desses componentes pela membrana de algas

procarióticas.

13

Com relação ao fosfato, ele é geralmente adicionado ao meio de cultivo na

forma inorgânica, mas alguns grupos de algas conseguem metabolizar fosfato

orgânico. O enxofre é fornecido na forma de SO4 2-, e algumas bactérias

fotossintéticas necessitam de formas mais reduzidas de enxofre como doadores de

elétrons.

Íons metálicos como magnésio e potássio são necessários assim como para

bactérias e fungos. O magnésio apresenta um papel essencial na produção de

clorofenil. As algas marinhas necessitam de uma variedade maior de íons

inorgânicos, e para isso são utilizadas formulações de meios artificiais de água

marinha.

Os micronutrientes necessários para o crescimento de algas são praticamente

os mesmos que para fungos e bactérias, com a exceção do selênio. Algumas algas

procarióticas necessitam de I, V, B e Si (no caso de diatomáceas). O sódio é

necessário para certas algas procarióticas e todas as algas marinhas.

Com relação aos fatores de crescimento, muitas algas necessitam de biotina,

tiamina, e cianocobalina (B12), sendo que essas três vitaminas são as únicas de

maior importância para as algas. Bactérias roxas não-sulfúricas apresentam um

requerimento de nutrientes mais complexo, mas ele pode ser suprido com fontes

como extrato de levedura.

2.3. PROTOZOÁRIOS

As necessidades nutricionais de protozoários ainda são pouco conhecidas em

comparação com outros microrganismos devido às suas capacidades biossintéticas

específicas. Protozoários fotossintéticos de vida livre se nutrem através da ingestão

de outros microrganismos e detritos orgânicos, dificultando o estudo de suas

necessidades nutricionais. Protozoários parasíticos apresentam necessidades muito

mais complexas, pois os meios devem conter várias substâncias metabólicas pré-

formadas e intermediários biossintéticos.

As fontes de carbono utilizadas incluem carboidratos, principalmente a

glucose, ácidos orgânicos, acetato e citrato, aminas e glicerofosfato. Com relação às

fontes de nitrogênio, somente os fitoflagelados conseguem absorver nitrogênio

inorgânico, sendo que todos os outros grupos necessitam de nitrogênio orgânico. É

necessário adicionar ao meio de cultivo vários aminoácidos, como, por exemplo,

14

para ciliados deve-se adicionar pelo menos 10 aminoácidos mais algumas outras

necessidades específicas de cada espécie.

2.4. CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS

As células animais e vegetais requerem meios de cultivo mais complexos. Os

meios utilizados para o cultivo de células animais eram originalmente oriundos em

fluidos biológicos. Devido à falta de uniformidade, começou-se a formulação de

meios semi-sintéticos. Cada tipo de linhagem celular requer um tipo diferente de

meio, mas a maioria deles apresenta característica como:

 Glucose e glutamina como fontes de carbono para o catabolismo.

 Sais que garantem a isotonicidade do meio, evitando a desregulação

osmótica.

 Sistemas de tampão bicarbonato/CO2, succinato de sódio/ácido succínico,

e de tampões orgânicos do tipo HERPES (ácido 4-(2 hidroxietil)-1-

piperazina-N’-2 etanossulfônico) e do tipo TRIS (2-amino-2-hidroximetil-1,3

propanodiol).

 Suplementação com soro sangüíneo (complexo de proteínas para a

nutrição, adesão e crescimento celular, para a proteção biológica –

antioxidantes e antitoxinas – e para proteção mecânica durante a agitação

e aeração). Como os soros utilizados são geralmente de origem bovina ou

eqüina, ele também pode ser fonte de contaminação por parasitas,

bactérias, fungos ou vírus. Para evitar isso, tenta-se substituí-lo por outras

composições, o que pode encarecer o processo.

 Antibióticos como penicilina (100UI/mL), estreptomicina (50 μg/mL) e

anfotericina B (25 μg/mL).

 Água desmineralizada, destilada e isenta de pirogênio. (LIMA et al., 2001)

A maioria das células animais se desenvolve bem entre 35 e 37ºC, podendo

tolerar temperaturas mais baixas, mas morrem em temperaturas mais altas. O pH

ótimo se encontra entre 7,2 e 7,4, sendo que algumas linhagem podem suportar

extremos como 6,8 e 7,8 (LIMA et al., 2001).

15

O cultivo de células vegetais é feito em meios estéreis, contendo sais,

vitaminas, fontes de carbono e reguladores de crescimento vegetal. Através do

cultivo in vitro de plantas é possível obter condições ambientais específicas, as quais

são livres de enfermidades e pragas, e o cultivo pode ser realizado continuamente. A

produção pode ocorrer em fermentadores, onde o crescimento celular ocorre até a

fase estacionária, e depois ocorre extração do produto; ou ainda em biorreatores de

leito fixo, onde as células são imobilizadas na forma de agregados celulares em

matrizes inertes como géis, espumas ou fibras ocas, e o produto é coletado de forma

contínua ou semicontínua.

3. COMPONENTES DO MEIO DE CULTIVO

3.1. FONTES DE CARBONO

Os carboidratos são um dos compostos mais importantes do meio de cultivo,

pois além de serem uma fonte de energia para a fermentação, participam da

produção de alguns metabólitos secundários.

Carboidratos como a glucose é uma boa opção para o crescimento em

condições laboratoriais. No entanto, dependendo das necessidades particulares do

microrganismo é necessário utilizar alguns derivados, como lipídeos, álcoois, ácidos

orgânicos, hidrocarbonetos e compostos nitrogenados orgânicos. Autótrofos

necessitam de CO2 como fonte de carbono, não necessitando outros compostos que

o contenham. Apesar de não aparente, todos os organismos necessitam de CO2,

pois ele é um intermediário metabólico essencial. Muitas vezes não é necessário

adicioná-lo ao meio de cultivo porque durante o crescimento as células produzem

naturalmente grandes quantidades de CO2. O problema se encontra em culturas

anaeróbias, pois a fase gasosa é substituída com gás inerte (N2) para remover o

oxigênio, mas, ao mesmo tempo ocorre a remoção do CO2. A simples introdução de

um pouco de gás CO2 ou íons carbonato resolvem esse problema (MOO-YOUNG,

1985).

Por razões econômicas, a glucose e a sacarose não são utilizadas não são

utilizadas na indústria como única fonte de carbono, exceto em processos que

exigem um controle exato da fermentação (como na indústria farmacêutica). Por isso

são utilizados resíduos agroindustriais com grandes quantidades de carboidratos

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