MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAIS - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos meios de cultivo em bioprocessos industriais, Bagaço de mandioca, Bagaço e melaço de cana, Extrato de malte.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

16

como bagaço e melaço de cana, extrato de malte, casca e polpa de café e frutas, os

quais serão discutidos em mais detalhes a seguir. Além deles, há a possibilidade de

utilizar:

 Amido e dextrinas, os quais podem ser metabolizados diretamente por

organismos produtores de amilases. Além do xarope de glucose, o amido é

também muito importante na fermentação do etanol, que tem sido bastante

utilizada principalmente após a implementação do Programa Nacional do

Álcool pelo governo brasileiro em 1975.

 Líquidos sulfíticos da indústria papeleira, que são resíduos da indústria de

papel após a remoção da lignina. Eles contêm de 9 a 13% de açúcares e são

utilizados no cultivo de algumas leveduras. Os líquidos sulfíticos provenientes

do processamento de coníferas tem de 2 a 3% de açúcares, sendo que

desses, 80% são hexoses e o restante pentoses. Já os líquidos de árvores de

folhas caducas apresentam principalmente pentoses.

 Celulose, que é um dos substratos mais disponível na natureza, com

produção na indústria de 1011 toneladas métricas por ano. No entanto, poucos

microrganismos conseguem crescer em meio contendo somente celulose,

como macromicetos que crescem em madeira, Tricoderma e produtores de

celulases. A celulose pode as vezes necessitar de um tratamento de hidrólise

química ou enzimática, produzindo um xarope de açúcares que é utilizado na

fermentação do etanol, butanol, acetona e isopropanol. Existem estudos no

melhoramento de cepas de microrganismos que produzem celulases para

que a celulose possa ser utilizada diretamente.

 Azeites e óleos de soja, algodão e palma, os quais proporcionam carbono a

partir de suas cadeias de ácidos graxos.

 Metanol, o qual pode ser utilizado somente por poucas bactérias e leveduras.

O metanol é utilizado principalmente como substrato na produção de proteína

unicelular (single cell protein), que é toda biomassa microbiana utilizada como

alimento ou aditivo alimentar.

 Etanol, o qual é utilizado como substrato por vários microrganismos como

única fonte de carbono. A produção de ácido acético (vinagre) é feita através

da oxidação do etanol pela bactéria Acetobacter.

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 Alcanos de cadeia de 12 a 18 carbonos também são metabolizados

rapidamente por muitos microrganismos através de oxidações terminais ou

subterminais (CRUEGER & CRUEGER, 1993).

3.1.1. Bagaço de mandioca

A mandioca (Manihot esculenta Cranz) é plantada e consumida por

aproximadamente 700 milhões de pessoas no mundo, sendo que os maiores

produtores são a Nigéria, o Brasil, a Tailândia, o Zaire e a Indonésia. Ela é

consumida na forma natural ou processada, sendo que é a indústria de

processamento da mandioca que gera resíduos que podem ser utilizados como

fonte de nutrientes. Como é possível visualizar no esquema do processamento da

Figura 2, são gerados dois tipos de resíduos, um líquido e outro sólido (casca e

bagaço) (PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007).

Figura 2 – Processamento Industrial da mandioca

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

18

O bagaço de mandioca é um resíduo fibroso que contém aproximadamente

50% de sua composição em amido, como mostra a Tabela 3. Percebe-se que há

uma variação nas quantidades dos componentes químicos da amostra de bagaço, e

isso se deve a variações de terreno de plantio, condições climáticas, e diferentes

técnicas de processamento. Ao se utilizar um resíduo agroindustrial deve-se fazer

sempre um acompanhamento e análise de cada nova amostra desse material para

que a quantidade de determinado componente durante a fermentação esteja sempre

controlada. A composição do meio de cultivo deve ter uma composição

relativamente fixa, e quando há uma grande variação é necessário corrigir o balanço

de forma que os novos lotes de bagaço estejam em mesma concentração de

nutrientes que o meio utilizado no cultivo já otimizado (PANDEY, SOCCOL &

LARROCHE, 2007).

Tabela 3- Composição físico-química do bagaço de mandioca (g/100g de peso seco)

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

Como se pode observar na tabela acima, o bagaço de mandioca é uma

grande fonte de carboidratos, os quais se encontram principalmente na forma de

amido. Por isso, microrganismos degradadores de amido são preferencialmente

cultivados nesse substrato, mas alguns outros também crescem com sucesso nesse

resíduo, como mostra a Tabela 4. No entanto, o bagaço de mandioca tem pouca

quantidade de proteínas, e, portanto, um meio de cultivo que faça uso desse resíduo

provavelmente deverá ser suplementado com fontes de nitrogênio. Em comparação

com o bagaço de cana, a vantagem do bagaço de mandioca é que este não

necessita de tratamento prévio antes do consumo pelo microrganismo.

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Tabela 4- Microrganismos cultivados em bagaço de mandioca

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

O bagaço de mandioca também pode sofrer um tratamento de hidrólise antes

do cultivo através da ação de enzimas amilolíticas. O hidrolisado pode ser então

utilizado para o cultivo de vários microrganismos, inclusive aqueles que não se

adequavam ao bagaço por não poderem degradar o amido.

3.1.2. Bagaço e melaço de cana

Nas destilarias e indústrias alcooleiras são produzidos como resíduos o

bagaço, o melaço, e a vinhaça como mostra a Figura 3. O bagaço é provém da

moagem da cana-de-açúcar durante a produção do açúcar, sendo que cada 100

toneladas de cana geram 28 toneladas de bagaço. Ele é um resíduo fibroso que

contém aproximadamente 50% em celulose, 25% de hemicelulose e 25% de lignina,

sendo que seu conteúdo de cinzas é muito pouco. Um grande número de bactérias,

leveduras e fungos são cultivados em bagaço (Tabela 5), no entanto fungos

filamentosos, como basidiomicetos, são os mais utilizados (PANDEY et al., 2007).

O cultivo em bagaço tem sido bastante utilizado para a produção de enzimas

celulolíticas, uma vez que o principal constituinte do bagaço de cana é a celulose.

Essas enzimas podem ser recuperadas de forma razoavelmente fácil quando feito

uma fermentação em estado sólido com esse resíduo. Xilanases também são

produzidas em fermentação sólida em bagaço de cana, sendo que essas enzimas

irão atuar na degradação de xilanas da hemicelulose do bagaço.

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Figura 3- Processamento da cana-de-açúcar

FONTE: ROSSELL.

O bagaço de cana geralmente necessita de um pré-tratamento da matéria

antes da fermentação para facilitar a sua digestibilidade, o que algumas vezes pode

encarecer o processo. É feita uma degradação parcial e solubilização da

hemicelulose e da lignina, deixando a estrutura da celulose mais exposta. São

utilizados processos físicos e químicos como explosão a vapor, radiação gama,

tratamento alcalino, peróxido de hidrogênio, e solventes.

Outra aplicação do bagaço em um bioprocesso não envolve suas

propriedades químicas, mas sim sua estrutura física. Ele pode ser utilizado como

suporte inerte durante uma fermentação em estado sólido ou em suporte flutuando

em meio líquido, que consiste no crescimento do microrganismo sobre um suporte o

qual está acima de um meio de cultura líquido. Essa ultima técnica de cultivo

apresenta algumas vantagens como a facilidade de recuperação do produto, que irá

se difundir no meio líquido, e melhor controle do meio de cultivo (PANDEY, SOCCOL

& LARROCHE, 2007).

21

Tabela 5- Microrganismos cultivados em bagaço de cana

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

O melaço é um outro subproduto da produção de açúcar constituído de parte

dos açúcares que não se cristalizam durante o processo de cristalização do açúcar.

É uma das fontes mais baratas de carboidratos, e também contém uma quantidade

razoável de substâncias nitrogenadas, vitaminas e oligoelementos (ou elementos

traço). O melaço possui uma grande variação de composição dependendo da fonte

utilizada para a produção de açúcar, como a cana-de-açúcar e a beterraba (Tabela

22

6), da localidade do plantio, das condições climáticas e da qualidade do

processamento (CRUEGER & CRUEGER, 1993).

Tabela 6- Composição de melaço de cana-de-açúcar e de beterraba

FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993.

3.1.3. Extrato de malte

O extrato de malte é um meio aquoso da cevada malteada, que consiste em

grãos de cevada germinados que promovem a hidrólise do amido em sacarose e

maltose. Esse é um bom substrato para fungos, leveduras e actinomicetos. O extrato

seco de malte contém aproximadamente 90-92% de carboidratos como hexoses

(glucose e frutose), dissacarídeos (maltose e sacarose), trissacarídeos (maltotriose)

e dextrinas. Também se encontra uma pequena quantidade de compostos

nitrogenados como proteínas, peptídeos e aminoácidos, sendo que ocorre uma

23

variação desses compostos dependendo do grão utilizado (CRUEGER &

CRUEGER, 1993).

Tabela 7- Composição típica do extrato de malte.

FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993.

No entanto, ao preparar o meio de cultivo contendo extrato de malte é

necessário tomar algumas precauções na esterilização. Em altas temperaturas e pH

baixo pode ocorrer a reação de Maillard (Figura 4) nos açúcares redutores. Nessa

reação, o grupo amino de aminoácidos e proteínas interagem com o grupo carbonila

dos açúcares redutores, aldeídos e cetonas, causando uma condensação do açúcar

e escurecimento do meio de cultivo. Esses produtos de reação não podem ser

utilizados como substrato pelos microrganismos, reduzindo o rendimento da

fermentação. Ao se esterilizar o meio pode-se também formar compostos tóxicos

para algumas células (CRUEGER & CRUEGER, 1993).

Figura 4- Reação de Maillard

FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993.

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3.1.4. Melaço e vinhaça de soja

Com relação à soja (Glycine Max L.), O Brasil é o segundo maior exportador

de grãos e o principal exportador de farelo de soja, com 32% do mercado mundial

(ROESSING, 1995). A Tabela 8 mostra a produção nacional no ano de 2006. A

produção de soja no Brasil continua a crescer e seu cultivo ocorre principalmente no

centro-oeste (29.209 milhões de toneladas) e no sul (19.668 milhões de toneladas).

Um importante fornecedor é o estado do Mato Grosso, onde a área plantada era 5,8

milhões de hectares e a produção de 17 milhões de toneladas de grão em 2006

(IBGE).

Tabela 8- Produção e área de soja plantada e derivados em 2006.

FONTE: ZANETTE, 2007.

A soja possui um alto teor protéico, embora também possua em sua

composição compostos polifenólicos como, por exemplo, os isoflavonóides. No

oriente, em países como Japão e China, a soja já é bastante utilizada e, atualmente,

houve um crescimento do seu consumo e de seus derivados em países europeus e

nos Estados Unidos (PARK et al., 2001).

A industria de processamento da soja produz como resíduo o farelo, o

melaço, e a vinhaça de soja (Figura 5). O melaço é um produzido junto com a

proteína de soja concentrada, e possui uma alta concentração de açúcares,

nitrogênio e outros macro-nutrientes. No Brasil são produzidos aproximadamente

100000 toneladas de melaço de soja por ano (SIQUEIRA et al., 2007).

25

Figura 5- Processamento da soja.

FONTE: SIQUEIRA et al., 2007.

O artigo em ANEXO 2 mostra a utilização do melaço de soja para a produção

de etanol e ampliar a escala de produção em laboratório para uma indústria.

3.1.5. Casca e polpa de café

Atualmente são produzidas aproximadamente 1 milhão de toneladas de café

por ano no mundo, sendo o Brasil o seu maior produtor. Durante os vários processos

de plantio e processamento são produzidos vários resíduos como polpa, casca,

folhas (sendo essa última geralmente não considerada como resíduo). A Figura 6

mostra o processamento das cerejas de café colhidas, o qual pode ser de dois tipos:

seco ou úmido. No Brasil, as cerejas passagem geralmente pelo processo seco,

resultando na casca do café, que é rico em componentes orgânicos, cafeína, taninos

e polifenóis. Quando se utiliza o método úmido, obtém-se a polpa, que tem uma

composição diferente da casa. Devido à grande quantidade de compostos como

cafeína, taninos e polifenóis, os resíduos do café podem apresentar grande

toxicidade para o ambiente, sendo necessária uma forma de tratar esse resíduo ou

utilizá-lo em outra indústria.

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Figura 6- Processamento das cerejas de café.

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

A Tabela 9 mostra a composição da polpa e da casca do café. Observa-se

uma diferenças entre as composições, mesmo eles sendo de natureza semelhante

nos dois casos, devido ao tipo de processamento, variedade do plantio, condições

de solo e climáticas, entre outros fatores. No entanto, percebe-se em todos os casos

uma grande quantidade de carboidratos, sendo uma boa fonte de carbono.

Vários microrganismos como bactérias, fungos e leveduras podem ser

cultivados em casca e polpa de café, mas os fungos filamentosos, especialmente os

basidiomicetos são os mais cultivados nesses substratos. A polpa e a casca já

apresentam uma microflora natural de bactérias, fungos e leveduras, sendo que na

casca predominam fungos, mas na polpa há uma distribuição equilibrada dos três

tipos de microrganismos. Devido à presença desses organismos contaminantes, ao

se utilizar esse substrato na fermentação é necessário autoclavar adequadamente o

27

meio de cultivo. A Tabela 10 mostra alguns exemplos de microrganismos cultivados

nessa fonte de nutrientes e mostra alguns dos produtos obtidos dessa fermentação.

Tabela 9- Composição da polpa de café e da casca do café.

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

Tabela 10- Microrganismos cultivados em polpa e casca de café.

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

28

3.1.6. Resíduos de frutas

Algumas frutas geram grandes quantidades de resíduos, como, por exemplo,

a manga (30-50%), a banana (20%), a abacaxi (40-50%) e a laranja (30-50%). As

polpas de frutas são um dos resíduos mais produzidos durante a fabricação de

sucos. O processamento das frutas pode gerae dois tipos de resíduos: um sólido,

contendo a pele ou casca, as sementes, a castanha, e a polpa; e outro líquido,

contendo a água de lavagem, e espirros de suco. A polpa é rica em açúcares,

vitaminas, e minerais, os quais, devido a sua natureza orgânica, são facilmente

assimiláveis pelos microrganismos. A composição desses elementos dependerá do

tipo de fruta que está sendo processada. Esses resíduos são bons materiais

nutritivos para o processo de metabólitos secundários de interesse industrial.

O processamento da maçã produz grandes quantidades de água de lavagem,

bagaço e polpa como resíduo. O bagaço da maçã é constituído da pele e de partes

sólidas obtidas após a extração do suco. Ele tem um alto valor nutritivo, e pode ser

utilizado em fermentações em estado sólido como uma fonte economicamente viável

de nutrientes. A polpa da maçã é rica em açúcares, aminoácidos, ácidos orgânicos,

polifenóis, entre outros compostos. Os polifenóis são compostos importantes, pois

podem exercer um controle no metabolismo de alguns microrganismos.

O bagaço de uva é um dos principais resíduos da indústria produtora de

vinhos. Ele já foi utilizado como único nutriente na fermentação em estado sólido

para a produção de celulases, xilanases e pectinases pelo fungo Aspergillus

awamori. Ele também pode ser empregado na produção de ácido cítrico por

Aspergillus niger.

A casca e a polpa da laranja podem ser utilizadas na produção de pectin-

liase, paectinases e poligalacturanases por diferentes microrganismos. O ácido

cítrico pode ser mais uma vez produzido por A. niger nesse substrato. Os resíduos

do processamento do abacaxi são utilizados na produção de etanol e ácido cítrico. O

kiwi possui uma quantidade considerável de celulose, e já foi utilizado para a

produção de lacase por Trametes hirsuta. A tabela 11 mostra uma lista de alguns

microrganismos e produtos produzidos em fermentações com resíduos de frutas.

29

Tabela 11- Microrganismos cultivados em diferentes resíduos de frutas para a

produção de diferentes compostos

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

3.2. FONTES DE NITROGÊNIO

O nitrogênio é outro composto de extrema importância na célula, pois para a

realização da tradução do RNA é necessário haver aminoácidos, os quais são

compostos nitrogenados.

Ele está disponível na forma de amônia gasosa, sais de amônio, uréia, ou

compostos nitrogenados orgânicos.

Uma fonte de nitrogênio que é metabolizada eficientemente pelos

microrganismos é o líquido de maceração do milho, que é um resultado da produção

de amido a partir do milho. O extrato concentrado contém aproximadamente 4% de

nitrogênio, contendo uma grande variedade de aminoácidos (alanina, arginina, ácido

glutâmico, isoleucina, isoleucina, treonina, valina, fenilalanina, metionina e cisteína).

O açúcar presente no líquido é em sua maior parte convertido em ácido láctico pelas

bactérias lácticas. O ANEXO 3 presente nesse trabalho apresenta alguns detalhes

adicionais sobre o líquido de maceração do milho e a sua aplicação no cultivo de

microrganismos e produção de metabólitos.

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3.2.1. Extrato de levedura

Os extratos de levedura são excelentes substratos para muitos

microrganismos. Ele é produzido a partir da plasmólise de células de levedura de

panificação com altas concentrações de NaCl ou mediante autólise a 50-55ºC. O

extrato contém aminoácidos, peptídeos, proteínas, vitaminas solúveis em água e

carboidratos. O glicogênio e a treolose das células da levedura se hidrolisam com a

glucose durante a produção do extrato. As composições mais detalhadas do extrato

de levedura produzido por autólise e plasmólise estão na Tabela 12. Ocorre também

uma variação de na composição devido ao substratos que foram utilizados no

crescimento da biomassa das leveduras (CRUEGER & CRUEGER, 1993).

Tabela 12- Composição do extrato de levedura.

FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993.

31

3.2.2. Peptonas

As peptonas são hidrolisados de proteínas e podem ter diferentes fontes

como peptona de carne, de caseína, de gelatina, de queratina, de semente de

amendoim, de farelo de soja, de semente de algodão, de semente de girassol, entre

outras. Elas podem ser utilizadas por muitos microrganismos, mas são relativamente

caras para a sua aplicação industrial.

A composição das peptonas (Tabela 13) pode variar dependendo da sua

fonte de origem. Por exemplo, a peptona de gelatina é rica em prolina e

hidroxiprolina e carecendo em aminoácidos que contêm enxofre, já a peptona de

queratina tem uma grande proporção de prolina e cistina, carecendo em lisina. As

peptonas de origem vegetal também contêm uma grande proporção de carboidratos.

O tipo de hidrólise do material também irá interferir na sua composição, se ela foi

ácida ou enzimática, principalmente com relação à quantidade de triptofano.

Tabela 13- Composição de algumas peptonas típicas de diferentes origens.

FONTE: CRUEGER & CRUEGER, 1993.

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