MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAISBiotecnologia - Apostilas - Biotecnologia_Parte3, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

MEIOS DE CULTIVO EM BIOPROCESSOS INDUSTRIAISBiotecnologia - Apostilas - Biotecnologia_Parte3, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos meios de cultivo em bioprocessos industriais, Farelo de soja, Resíduos de extração de óleos, fontes de minerais.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

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3.2.3. Farelo de soja

A soja possui um alto teor protéico, embora também possua em sua

composição compostos polifenólicos como, por exemplo, os isoflavonóides. No

oriente, em países como Japão e China, a soja já é bastante utilizada e, atualmente,

houve um crescimento do seu consumo e de seus derivados em países europeus e

nos Estados Unidos (PARK et al., 2001).

O farelo de proteína de soja é obtido após a extração do óleo do grão e

constitui um resíduo industrial que muitas vezes não é aproveitado por algumas

empresas. No entanto, ele pode ser utilizado em outros processos industriais,

diminuindo assim o impacto ambiental causado pelo descarte desses resíduos.

Análises mostram um conteúdo de 50% de proteínas, 30% de carboidratos

(sacarose, estaquiose, rafinose, arabinoglucanas, arabinano e polissacarídeos

ácidos), 1% de gorduras residuais e 1% de lecitina (CRUEGER & CRUEGER, 1993).

O farelo de soja é utilizado freqüentemente na fermentação de antibióticos, pois não

produz regulação catabólica devido ao lento catabolismo dessa mistura de

nutrientes. Como já foi citado anteriormente, pode-se fazer uma hidrólise do farelo

de soja, liberando os aminoácidos das proteínas e facilitar a captação desses

compostos por microrganismos.

3.2.4. Resíduos de extração de óleos

Os resíduos de extração do óleo são ricos em nitrogênio orgânico, fósforo e

potássio. A composição nutricional depende da variedade e da qualidade do grão ou

noz, do método de extração do óleo, dos parâmetros de armazenamento, entre

outros. O farelo de soja, que já foi discutido, é um dos principais resíduos de

extração de óleo. Outros como o resíduo de girassol apresentam 27% de proteína

bruta, contendo grandes quantidades de metionina, mas pouca lisina e treonina.

Esses resíduos podem ser utilizados na produção de enzimas industriais,

antibióticos, antimicrobianos, biopesticidas, vitaminas, e outros produtos. Eles

também podem ser utilizados como complementos alimentares. Alguns exemplos de

substratos, microrganismos cultivados e produtos estão na Tabela 14.

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Tabela 14- Produtos obtidos de microrganismos cultivados em resíduos de extração

de óleos

34

FONTE: PANDEY, SOCCOL & LARROCHE, 2007.

3.3. FONTES DE MINERAIS

Os microrganismos necessitam de certos minerais para o seu crescimento e

metabolismo. Em muitos meios, magnésio, fósforo, potássio, enxofre, cálcio e cloro

são componentes essenciais. A Tabela 15 mostra as quantidades usuais mais

utilizas desses compostos. O potássio é necessário para a manutenção do balanço

iônico entre as membranas celulares, e como componente estabilizante do RNA. O

magnésio é um ativador essencial de enzimas e componente da membrana celular.

O enxofre é um importante componente de aminoácidos e coenzimas.

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Tabela 15- Quantidades mais usuais de alguns sais.

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

O cloro não é utilizado no metabolismo de fungos, porém possui papel

importante no de algumas bactéria halofílicas. Um ponto a ser destacado é que se

deve assegurar que, em fermentações onde um metabólito com cloro em sua

composição é formado, a síntese de produtos sem cloro na composição deve ser

evitada. Os principais compostos formados com o cloro são: clorotetraciclina e a

griseofulvina.

O fósforo merece um destaque especial, pois constitui cerca de 1,5% do

peso seco celular e está presente na célula na forma de açúcares fosfatados, ácidos

nucléicos e nucleotídeos. A quantidade presente varia na proporção do conteúdo de

ácido nucléico da célula, que é dependente da taxa de crescimento. Torna-se

disponível para os microrganismos na forma de íons de fosfato-desidrogenado ou

orto-fosfato. A concentração do fosfato em um meio, particularmente em meios de

laboratório colocados em frascos de agitação, é geralmente mais alta que a de

outros componentes minerais. Parte deste fosfato está sendo usada como tampão

para minimizar as alterações de pH quando o controle externo do pH não está sendo

utilizado.

Outro caso é a influência dos sais de cálcio presentes no meio na

precipitação o excesso de fosfato inorgânico, além de ser sugerido que o cálcio

aumenta o rendimento da estreptomicina.

O cloro não é utilizado no metabolismo de fungos, porém possui papel

importante no de algumas bactéria halofílicas. Um ponto a ser destacado é que se

deve assegurar que, em fermentações onde um metabólito com cloro em sua

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composição é formado, a síntese de produtos sem cloro na composição deve ser

evitada.

Alguns minerais são necessários em quantidades muito pequenas, sendo

chamados de micronutrientes ou elementos traço, e incluem o cobalto, cobre, ferro,

manganês, molibdato e zinco. Eles são importantes como indutores de enzimas e

coenzimas. Estão normalmente presentes em meios complexos e em água

encanada em diversas concentrações.

3.3.1. Vinhaça de cana

A vinhaça, como já foi mostrado anteriormente (Figura 3), é resultante do

processo de produção de álcool, sendo que cada litro de álcool produzido gera 13 a

16 litros de vinhaça. Ela não apresenta muita matéria orgânica (M.O.), não sendo

uma fonte de carbono, mas é rica principalmente em fontes minerais como mostra a

Tabela 16. A vinhaça pode ser utilizada na lavoura canavieira para melhoramento do

solo e para suplementação de meios de cultivo (de MATOS, 2005).

Tabela 16- Composição da vinhaça.

FONTE: AZANIA et al., 2003.

3.4. SUBSTÂNCIAS QUELANTES

Durante a preparação ou autoclavação de alguns meios pode ocorrer a

formação de precipitados de metais insolúveis fosfatados, como, por exemplo, a

formação de um precipitado branco de íons metálicos quando o meio de Mandels e

Weber é autoclavado, o qual é formado principalmente por todo ferro e grande parte

do cálcio, manganês e zinco presentes no meio. A Tabela 17 mostra algumas

combinações de íons que formam sais insolúveis.

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Tabela 17- Sais solúveis e insolúveis

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

Este problema pode ser resolvido através da adição em baixas concentrações

de agentes quelantes no meio, como o EDTA, ácido cítrico e polifosfatos. A ação

destes quelantes é a de formar complexos com os íons metálicos do meio, que

poderão ser gradualmente utilizados pelo microrganismo. É importante lembrar que

o agente quelante não causa a inibição do crescimento do microrganismo que está

sendo cultivado no meio.

Em meios de processos em larga escala, pode não ser necessária a adição

do agente quelante, pois os meios complexos, que podem conter extrato de

leveduras ou peptonas, irão se complexar com os íons metálicos e garantir a sua

liberação gradual durante o crescimento do microorganismo.

3.5. FATORES DE CRESCIMENTO

Alguns microrganismos não são capazes de sintetizar todos os componentes

essenciais para o seu crescimento e necessitam de compostos precursores

chamados fatores de crescimento.

Esses fatores de crescimento são compostos orgânicos necessários em

pequenas dosagens para crescimento e obtenção de produto ótimo, como vitaminas,

aminoácidos, ácidos graxos saturados e insaturados e esteróis. Estes atuam como

precursores ou como constituintes dos fatores de crescimento. A Tabela 18 mostra

os principais fatores de crescimento para alguns microrganismos.

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Tabela 18- Fatores de crescimento de alguns microrganismos

FONTE: MEYER, DEIANA & LECLERC, 1984.

3.6. TAMPÕES

O controle do pH é extremamente importante para alcançar uma alta

produtividade de um processo fermentativo. Em processos realizados em

biorreatores é possível controlar o pH do meio através da adição de soluções de

ácidos ou bases, mas em processos realizados em frascos em Erlenmeyers é

necessária algumas vezes a utilização de sistemas tamponantes. Um composto

pode ser adicionado ao meio para servir especificamente como tampão ou também

ser utilizado como fonte de nutriente. Muitos meios são tamponados em cerca de pH

7,0 através da incorporação de carbonato de cálcio ao meio. Se o pH diminui, o

carbonato foi decomposto. Os fosfatos fazem parte de muitos meios e também

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possuem atuam como agente tamponante. Contudo, altas concentrações de fosfatos

são críticas na produção de metabólitos secundários.

O uso balanceado de fonte de carbono e nitrogênio também forma bases para

o controle do pH com capacidade tamponante, pode ser fornecido por proteínas,

peptídeos e aminoácidos, bem como em extrato de milho. O pH pode também ser

controlado externamente pela adição de amônia (NH3) e hidróxido de sódio (NaOH)

e ácido sulfúrico (H2SO4).

3.7. ADIÇÃO DE PRECURSORES

Alguns compostos químicos quando adicionados no meio de cultivo já são

assimilados diretamente pelas células e incorporados no produto. Isso pode

melhorar o rendimento de produção como ocorreu no caso da produção da

penicilina. Uma variedade de cadeias laterais pode ser adicionada à molécula de

penicilina. O aumento de sua produção foi observado no cultivo em meio contendo

líquido de maceração do milho, que continha um composto que era facilmente

adicionado à molécula de penicilina. O ANEXO 3 mostra em um pouco mais de

detalhes a produção de penicilina a partir desse substrato.

3.8. ADIÇÃO DE INIBIDORES

A adição de certos inibidores à fermentação pode resultar na formação de

mais de um componente específico, ou de um metabólito intermediário o qual é

normalmente acumulado. Como exemplo, tem-se a produção de glicerol, a qual

depende de uma modificação na fermentação do etanol pela remoção de

acetaldeído, que é um inibidor da formação de glicerol. Isto é realizado

acrescentando bissulfito de sódio, pois assim, o acetaldeído torna-se inviável para a

re-oxidação de NADH2. Porém, a diidrodiacetona fosfato torna-se um aceptor de

hidrogênio do NADH2, formando o glicerol-3-fosfato, o qual é convertido em glicerol.

3.9. ADIÇÃO DE INDUTORES

A produção de enzimas na indústria é feita na maioria das vezes com a

utilização de indutores. Estas enzimas são, portanto, produzidas somente como

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resposta à presença deste indutor no meio. Eles são freqüentemente substratos

como amido ou dextrinas, os quais podem ser degradados somente por amilases,

maltose, para a produção de pululanase, e pectina para a produção de pectinase. A

Tabela 19 mostra alguns dos indutores utilizados para a produção de algumas

enzimas.

Tabela 19- Exemplos de indutores de enzimas

Fonte: STANBURY, WHITAKER & HALL, 1995.

4. DESIGN DE MEIOS DE CULTIVO

O design de um meio de cultura é uma etapa essencial no desenvolvimento

de experimentos em escala laboratorial, piloto ou industrial. Os constituintes de um

meio devem satisfazer as exigências básicas para a geração de biomassa celular e

a produção dos metabólitos. Além disso, o meio irá influenciar na variação do pH, na

formação de espuma, no potencial de oxi–redução e na forma morfológica do

microrganismo. O tipo de meio formulado também irá influenciar a facilidade ou não

de recuperação do produto e o de tratamento de efluentes.

O balanço de massa do processo de produção de biomassa e produto é um

passo inicial que pode ser tomado como referência. A reação baseada na

estequiometria para o crescimento e formação do produto em uma fermentação

aerobiótica:

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CwHxOyNz + aO2 + bHgOhNi  cCHαOβNδ + dCO2 + eH2O + fCjHkOlNm

onde CwHxOyNz é a fonte de carbono, HgOhNi é a fonte de nitrogênio, é a fórmula

química da biomassa seca, e CjHkOlNm é a composição química do produto celular

desejado. A composição química da biomassa do microrganismo pode ser

encontrada em estudos já previamente realizados, como o da Tabela 20. A equação

do balanço de massa deve ser expressa em termos quantitativos, o que é importante

no desenvolvimento econômico do meio se a perda é mínima (DORAN, 1995).

Deve ser possível também se calcular as quantidades mínimas de nutrientes

que serão exigidos para produzir uma quantidade específica de biomassa.

Conhecendo-se que uma certa quantidade de biomassa é necessária para produzir

uma quantidade definida de produto, é possível calcular-se a concentração de

substrato necessária para produzir as taxas exigidas de produto. Podem existir

componentes do meio que são necessários para a formação de produto, mas que

não são necessários para a formação da biomassa. Nessa fórmula não estão

presentes elementos necessários como sais minerais e a formação de energia

durante a reação, a qual é importante no balanço energético do processo.

Tabela 20- Composição elementar da biomassa de alguns microrganismos.

Fonte: DORAN, 1995.

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É mais fácil estipular um meio de cultivo para o crescimento do que para a

otimização da produção de um metabólito. No caso de metabólitos secundários, eles

são produzidos preferencialmente quando a taxa de crescimento cai e o meio se

torna deficiente em um ou mais compostos após um rápido crescimento inicial.

Podem ser utilizadas ferramentas estatísticas e modelagem computacional

para prever o crescimento de alguns microrganismos. Essas duas ferramentas são

muito importantes na otimização de meios de cultivo e na definição de um

planejamento experimental adequado para a análise dos melhores componentes

para um meio de cultivo.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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In: XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos, Anais Sinaferm 2007, GRAFFIT, v. CD. p. 1-6, Curitiba, 2007.

6. ANEXOS

ANEXO 1

POTENTIALS OF CELLULOSIC WASTES IN MEDIA FORMULATION

NWODO-CHINEDU, OKOCHI, OMIDIJI, OMOWAYE, ADENIJI, OLUKOJU &

CHIDOZIE

45

ANEXO 2

PRODUCTION OF BIO-ETHANOL FROM SOYBEAN MOLASSES BY

Saccharomyces cerevisiae: PROCESS SCALE-UP

SIQUEIRA, KARP, IGASHIYAMA, WIETZIKOSKI, MEDEIROS & SOCCOL

46

ANEXO 3

CORN STEEP LIQUOR IN MICROBIOLOGY

LIGGETTT & KOFFLER

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