Meios de cultura - apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Meios de cultura - apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos meios de cultura empregados nos exames de microbiologia, procedimentos, controle de qualidade, levedura.
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Microsoft Word - Mod IV 2004.doc

Mod IV - 21

Cultivo e crescimento de espécies de Candidas efungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais.

Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Sabouraud Dextrose Ágar.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar à +/- 50ºC e distribuir em placas de 90 mm de diâmetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinação em forma de bico de flauta (ângulo de

45º). pH: 5,6 +/- 0,1

CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 6 meses.

INOCULAÇÃO Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a técnica de semeadura quantitativa; Se em tubo: semear na superfície inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro à 37ºC; Observar diariamente a presença ou não de crescimento; Incubar 40 dias.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Após o crescimento, deve-se seguir a identificação do microrganismo que cresceu.

RECOMENDAÇÕES Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubação demorada resseca com facilidade o

meio contido em placas.

Não usar meios vencidos e/ou ressecados.

Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI ágar.

Mod IV - 22

4. MEIOS COMERCIAIS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO BASE DE NITROGÊNIO PARA LEVEDURAS – YEAST NITROGEN BASE PRINCÍPIO Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de nitrogênio livre de carboidratos e discos de papel impregnados com carboidratos, nos quais observa- se o crescimento ao redor, após um período de incubação. UTILIDADE Identificar as espécies de leveduras através da prova de assimilação de carboidratos. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrogênio para leveduras. Discos comerciais de carboidratos. Discos preparados no laboratório, impregnados com soluções de carboidratos a 1%:

- Carboidrato 1 g - Água destilada 100 ml

PROCEDIMENTOS Para os discos de carboidratos: Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de fazer o meio;

Usar discos estéreis disponíveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de diâmetro em autoclave;

Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar água, homogeneizar bem até completa dissolução - carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose, melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol;

Esterilizar por filtração (cada um em frasco separado); Impregnar os discos previamente estéreis (embeber totalmente os discos); Deixar os discos em estufa à 37ºC até secarem totalmente .

Para o meio base de nitrogênio: Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante; Fundir completamente; Distribuir 20 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.

CONTROLE DE QUALIDADE

CARBOIDRATOS POSITIVO NEGATIVO

Glicose

Maltose

Sacarose

Lactose

Galactose

Melibiose

Celobiose

Inositol

Xilose

Rafinose

Trealose

Dulcitol

Candida albicans

Candida albicans

Candida tropicalis

Candida kefyr

Candida albicans

Candida guilliermondii

Candida guilliermondii

Cryptococcus neoformans

Candida albicans

Candida guilliermondii

Candida albicans

Candida guilliermondii

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Candida krusei

Mod IV - 23

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Meio base: 4 a 10ºC por 6 meses. Discos: refrigerado e se possível em dessecador durante 1 ano ou mais.

INOCULAÇÃO Aquecer o tubo contendo 20 ml de meio base de nitrogênio até fundir totalmente; Resfriar a base à 47 - 48ºC; Fazer uma suspensão das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4 ml de água destilada

estéril, , usando um cultivo de leveduras de 24 a 72 horas; Despejar a suspensão de leveduras no tubo contendo a base de nitrogênio; Homogeneizar bem; Despejar o conteúdo homogeneizado (meio base + suspensão de leveduras) em placa de Petri de

estéril de 150 mm de diâmetro; Esperar solidificar em temperatura ambiente; Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxílio de uma pinça flambada; Incubar à 30ºC durante 18 a 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que significa a assimilação

do açúcar pela levedura. Negativo: Ausência de halo de crescimento. O meio permanece inalterado.

RECOMENDAÇÕES Não usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas;

Não usar inóculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova falso - negativa;

Não adicionar a suspensão de leveduras à base com temperatura superior a 48ºC, pois pode inativar as células e resultar em prova falso - negativa;

Após homogeneizar o meio base e suspensão de leveduras, despejar imediatamente na placa de Petri, pois solidifica rapidamente.

ÁGAR CITRATO SIMMONS PRINCÍPIO Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono,

juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio. UTILIDADE Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Citrato Simmons.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio segundo instruções do fabricante; Ajustar o pH para 6,9 ±0,2; Aquecer sob agitação até fundir o ágar; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfície

em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.

Mod IV - 24

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

INOCULAÇÃO Com o auxílio de um fio bacteriológico, inocular na superfície a colônia, não furar a base; Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: verde Positivo: cor azul ou crescimento no local do inóculo. Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada. Se houver crescimento visual na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser

considerado positivo, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá mudar a cor do meio para alcalino (azul).

Leitura inicial com 24 horas: Se resultado positivo: encerrar o teste. Se resultado negativo ou houver dúvida: reincubar por mais 24/48 horas.

Leitura com 48 horas: Se houver crescimento visível na área do inóculo sem mudança de cor, o teste pode ser

considerado positivo, (encerrar o teste). Se resultado negativo ou houver dúvida, reincubar por 24 até 72 horas, a incubação poderá

mudar a cor do meio para alcalino(azul). CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas; Após este período realizar controles negativo e positivo semanalmente.

RECOMENDAÇÕES Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxigênio.

Não se devem transportar colônias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo.

Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25°C) por até 7 dias.

Não usar repiques de caldo.

Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactéria.

Para fazer o inóculo flambar o fio bacteriológico.

Não fazer inóculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo). ÁGAR BÍLIS-ESCULINA PRINCÍPIO

A prova de Bile-Esculina é baseada na capacidade de algumas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bílis. A esculina é um derivado glicosídico da cumarina. As duas moléculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) estão unidas por uma ligação éster através do oxigênio. Aa esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares.

As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS, são capazes de crescer em presença de sais biliares. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina. A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro.

Mod IV - 25

UTILIDADE Separação dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa. Identificação dos Enterococcus spp., que são Bile-Esculina positiva. Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores e enterobactérias, usar o meio sem

bílis (vide prova de esculina). FÓRMULA/ PRODUTO Meio comercial: Ágar Bílis-Esculina

Fórmula: Peptona 5 g

Extrato de carne 3 g Bílis 40 g Esculina 1 g Citrato férrico 0,5 g Ágar 15 g Água destilada 1000 ml pH = 7,0

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Fundir o meio; Distribuir 2,5 ml por tubo; Esterilizar em autoclave; Após retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície

em forma de "bico de flauta" (ângulo de 45º). CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.

INOCULAÇÃO Estriar a superfície inclinada do meio; Incubar a 35ºC 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: acinzentado Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio. Negativo: Ausência de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio após 72 horas

de incubação. RECOMENDAÇÕES Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48

horas).

Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolizar a esculina em presença de bílis se incubados em atmosfera de CO2.

ÁGAR SANGUE - CAMP

Mod IV - 26

PRINCÍPIO Consiste na interação da beta hemólise secretada pelo Staphylococcus aureus com o

microrganismo em estudo, que secreta uma proteína, denominada "fator CAMP", produzindo aumento de hemólise no local da inoculação.

UTILIDADE Separação do Streptococcus beta hemolíticopresumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e

da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolíticos e espécies de Listeria.

FÓRMULA/ PRODUTO Para esta prova utiliza-se: Placa de meio Ágar Sangue. Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

INOCULAÇÃO Com auxílio do fio bacteriológico, semear na superfície de meio Ágar Sangue a cepa de

Staphylococcus aureus com uma única linha reta; Novamente com o fio bacteriológico (flambado), tocar nas colônias em estudo; Semear uma única linha reta na superfície do meio Ágar Sangue, perpendicularmente à linha de

semeadura do S. aureus, sem tocar no inóculo do S. aureus; Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio Ágar Sangue duas vezes, uma de cada lado da

semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inóculo já feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo);

Incubar à 35ºC 24 horas. (a) Inóculo do S. aureus (b) Inóculo da cepa em estudo INTERPRETAÇÃO Positivo: Aumento da área de hemólise em forma de flecha no local onde estão mais próximas as

duas estrias de crescimento. Negativo: Ausência de aumento da hemólise. Observa-se nitidamente a hemólise do S. aureus e

da cepa em estudo, inalteradas. RECOMENDAÇÃO Não utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem não produzir beta hemolisina.

Não tocar as estrias da semeadura das cepas, para não dar um resultado falso – negativo.

Não utilizar placas de Ágar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, já que é baseada na hemólise das cepas.

CALDO BASE DE MOELLER PRINCÍPIO As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com o

grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Essa reação, conhecida como descarboxilação, origina dióxido de carbono como produto secundário.

Emprega-se normalmente três aminoácidos para identificação dos microrganismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller é a mais utilizada. Os produtos aminados específicos, são:

Mod IV - 27

- Lisina: Cadaverina;

- Ornitina: Putrescina;

- Arginina: Citrulina.

A conversão da arginina em citrulina é uma atividade de diidrolase, e não descarboxilase, na qual o grupo NH2 é retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina é convertida em ornitina, que sofre descarboxilação para formar putrescina.

A incubação deve ser em anaerobiose e para isso, é adicionado 1 ml de óleo mineral estéril após a inoculação. No início da incubação, a glicose contida no meio é fermentada e ocorre viragem de cor púrpura para o amarelo. Quando o aminoácido é descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para púrpura original.

UTILIDADE Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na identificação. Utilizado principalmente para identificações de enterobactérias, bacilos Gram negativos não

fermentadores, estafilococos. FÓRMULA / PRODUTO Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase. Aminoácidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou DL arginina.

PROCEDIMENTOS Preparar os meios com a Base de Moeller e aminoácidos; Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminoácidos, que será usada como controle; Seguir as recomendações do fabricante para pesar o meio Base de Moeller; Se usar aminoácido L (levógiro),adicionar 1 grama do aminoácido para cada 100 ml de meio

base; Se usar aminoácido DL (dextrógiro),adicionar 2 gramas do aminoácido para cada 100 ml de

meio base; Homogeneizar bem o meio; Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N ; Distribuir 2 ml por tubo (usar tubos de rosca); Esterilizar em autoclave.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: .Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883ou Enterobacter aerogenes ATCC 13047 ـ .Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047ou Serratia marcescens ATCC 13880 ـ .Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047ou Enterobacter sakazakiiـ

Negativo: .Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC 8454 ـ .Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883ou Citrobacter freundii ATCC 8454 ـ .Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047ou Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ـ

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar entre 4 a 10 ºC por 3 meses.

INOCULAÇÃO A partir de crescimento recente, inocular a colônia em estudo no tubo contendo o aminoácido e

no tubo controle; Colocar aproximadamente 1 ml de óleo mineral estéril em cada tubo; Incubar à 35 +/- 1ºC em aerobiose.

INTERPRETAÇÃO

Mod IV - 28

Cor original do meio: púrpura

Positivo:

Tubo controle (sem aminoácido) : amarelo e turvo - indica que o microrganismo é viável e o ـ pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase.

Tubo com aminoácido: púrpura e turvo- indica a formação de aminas a partir da reação de ـ descarboxilação.

Negativo: .Tubos controle e com aminoácido: púrpura ـ

RECOMENDAÇÕES Verificar se o inóculo foi satisfatório para o crescimento, pois a cor original do meio - púrpura, sem

apresentar turvação não significa positividade e sim, ausência de crescimento bacteriano.

Como a reação ocorre em anaerobiose, é imprescindível a adição de óleo mineral.

Pode-se autoclavar o meio já com o óleo mineral ou adicionar após a inoculação do microrganismo.

Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos não fermentadores, é necessário um período de incubação prolongado (24 a 72 horas).

ÁGAR DNASE PRINCÍPIO Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestável. Estas enzimas

hidrolisam ácido desoxirribonucléico (DNA) contido no meio de cultura após um período de incubação. Posteriormente este meio é acidificado com HCl 1N para a revelação da prova.

UTILIDADE Prova de identificação que separa os principais microrganismos de importância clínica, entre eles: DNase positivos: Staphylococcus aureus , Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas

maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis.

DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactérias, demais bacilos Gram negativos não fermentadores.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: DNase Ágar.

PROCEDIMENTOS Pode-se revelar a prova de duas maneiras: Com uma solução de ácido clorídrico 1 N Adicionando à base do meio de cultura azul de Toluidina O.

Para a revelação com ácido clorídrico 1N:

;Preparar e esterilizar o meio conforme instruções do fabricante ـ ;Esfriar o meio à aproximadamente 50ºC ـ .Distribuir em placas de petri de 50 mm de diâmetro ـ

Preparar uma solução de HCl 1N, seguindo a fórmula abaixo:

N= C1 (número de equivalentes grama de soluto)

V (volume da solução)

Mod IV - 29

C1 = M1 (peso molecular do soluto) E (volume da solução)

E = M x → x: para bases: OH desprendido na reação para ácidos: H+ ionizáveis para oxidantes / redutores: variação do NOX para sais normais: valência do cátion ou ânion

Para a revelação com azul de Toluidina O:

;Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante ـ ;Acrescentar para cada 1000 ml de base 0,1g de azul de Toluidina O ـ ;Esterilizar em autoclave ـ ;Esfriar o meio à aproximadamente 50ºC ـ .Distribuir em placas de petri de 50 mm de diâmetro ـ

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228ou Escherichia coli ATCC 25922.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Meio: 4 a 10 ºC por 3 meses. Ácido Clorídrico 1N: .Guardar em frasco âmbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, calor e umidade ـ .Validade: 6 meses ـ

INOCULAÇÃO Para as duas técnicas de preparação, a inoculação é a mesma: Com auxílio de um fio bacteriológico, tocar nas colônias em estudo e fazer um esfregaço circular e

denso na placa de DNase ; Incubar à 35 +/- 1ºC 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Revelação com HCl 1 N: Cor original do meio: amarelo claro Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N até banhar totalmente a superfície do meio; Aguardar aproximadamente 3 minutos ou até que o meio fique opaco. Positivo: Presença nítida de halo claro na parte inferior e em volta da colônia. Negativo: Ausência de halo claro em volta da colônia.

revelação com azul de toluidina o: Cor original do meio: azul claro Positivo: Presença de coloração rosa na parte inferior e em volta da colônia. Negativo: Ausência de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.

RECOMENDAÇÕES Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova;

Em uma mesma placa, pode-se fazer até 4 testes (placas de 50 mm de diâmetro);

armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N pode dar leituras falso negativas;

Para a detecção da atividade de DNase não é necessário que haja crescimento, por isso é que a semeadura deve ser de forma circular densa e não de estria;

Mod IV - 30

Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um período maior de incubação (até 48 horas) para produzirem DNase;

Usar cultura jovem (até 24 horas). ÁGAR ESCULINA PRINCÍPIO Verifica se a bactéria é capaz de hidrolisar a esculina. A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto.

UTILIDADE Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores; Para identificação de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com bílis, vide prova de Bile-

Esculina. FÓRMULA /PRODUTO Ágar tríptico de soja (TSA) ou base de ágar sangue 4 g Citrato férrico 0,05 g Esculina 0,1 g Água destilada 100 ml

PROCEDIMENTOS Pesar o TSA ou a base de ágar sangue, o citrato férrico e a esculina e colocar tudo no mesmo

Erlenmeyer; Colocar água destilada; Ajustar o pH para 7,0; Aquecer lentamente até fundir o ágar e dissolver o citrato férrico (lentamente porque o citrato

férrico demora a dissolver); Distribuir 3 ml do meio em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfície

em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

INOCULAÇÃO Inocular colônias de crescimento recente (18 – 24 hs); Picar o meio e semear na superfície do ágar; Incubar a 35 °C por 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: palha. Positivo: marrom escuro ou preto. Negativo: inalterado (palha).

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C, de 6 a 8 semanas. Após este período realizar controle negativo e positivo semanalmente.

RECOMENDAÇÕES

Mod IV - 31

A enzima glicosidase é responsável pela hidrólise da esculina em todas as enterobactérias exceto a Escherichia coli. A Escherichia coli não possue a enzima glicosidase sendo necessário usar a lactose, outro dissacarídeo ou outra fonte de carbono. Fazer um inóculo leve com agulha bacteriológica e interpretar após 18-24 horas.

A produção de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o meio, isso não é uma reação positiva.

Resultado falso positivo pode ocorrer pela produção de H²S em não fermentadores, semelhante ao bacilo da bactéria Shewanella putrefaciens.

ÁGAR FENILALANINA PRINCÍPIO Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação

enzimática. UTILIDADE Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Ágar Fenilalanina

Solução de cloreto férrico: Cloreto férrico 10 g Adicionar 100 ml de água destilada Colocar em frasco âmbar. Validade: 6 meses A solução de cloreto férrico 10% é utilizada para revelar a atividade da enzima fenilalanina desaminase no meio de fenilalanina.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer sob constante agitação até fundir o meio; Ajustar o pH para 7,3 ±0,2; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfície

em forma de bico de flauta (ângulo 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Proteus vulgaris ATCC 8427ou Proteus mirabilis ATCC 12453. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

INOCULAÇÃO Fazer um inóculo denso; Inocular colônia pura de 18 a 24 horas; Incubar a 35°C por 18 a 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Adicionar diretamente o cloreto férrico no tubo inoculado, antes da interpretação do resultado e distribuir o reagente sobre a superfície do meio. Cor original do meio: amarelo palha.

Mod IV - 32

Positivo: formação de uma coloração esverdeada na superfície do meio após a adição do cloreto férrico.

Negativo: o meio permanece inalterado. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C, de seis a oito semanas.

RECOMENDAÇÕES

Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente após a adição do reagente, pois a cor verde desbota rapidamente. A interpretação deve ser feita em até 5 minutos.

CTA – CYSTINE TRYTICASE AGAR PRINCÍPIO CTA é um meio semi-sólido, recomendado para o estudo de fermentação de carboidratos de

microrganismos exigentes. UTILIDADE Usado para diferenciar espécies de Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e

Corynebacterium spp. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial Cystine Tryticase agar Medium. Carboidratos mais utilizados: glicose, maltose, lactose, sacarose, frutose, mannose.

Carboidrato 10 g Água destilada 100 ml

pH: 7,3 +/- 0,2

PROCEDIMENTOS Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtração e reservar; Pesar o CTA conforme instruções do fabricante, acrescentar 900 ml de água e homogeneizar bem; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base a aproximadamente 50ºC; Adicionar o carboidrato esterilizado por filtração; Distribuir em 3 ml por tubo; Deixar os tubos esfriar na posição vertical.

CONTROLE DE QUALIDADE

POSITIVO NEGATIVO

Glicose

Maltose

Lactose

Sacarose

Frutose

Manose

Neisseria sicca

Neisseria sicca

Neisseria lactamica

Neisseria sicca

Neisseria sicca

Haemophilus parainfluenzae

Branhamella catarrhalis

Branhamella catarrhalis

Neisseria sicca

Branhamella catarrhalis

Branhamella catarrhalis

Haemophilus influenzae

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Temperatura ambiente por 3 meses.

Mod IV - 33

INOCULAÇÃO Fazer um inóculo bem denso, no centro do meio; Incubar à 35ºC em jarra com vela acesa e gaze embebida em água de torneira para manter a

umidade da atmosfera. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: alaranjado Positivo: cor amarela, indicando acidificação (fermentação) do meio e turvação. Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem

turvação. RECOMENDAÇÕES Para provas negativas, incubar um período maior (72 horas);

Não autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato;

Fazer inóculo denso, pois inóculos fracos podem dar resultado falso negativo. CALDO TRIPTONA E SIM PRINCÍPIO Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano é um

aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias resultando na produção de indol, após a adição de reagentes de Erlich ou Kovacs.

UTILIDADE Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.

FÓRMULA /PRODUTO Meio comercial: Caldo Triptona. Meio comercial: SIM (sulfato/indol/motilidade ágar).

Reativo Erlich Paradimetilaminobenzaldeído 1 g Álcool etílico (95%) 95 ml Ácido clorídrico concentrado 20 ml Guardar em frasco âmbar em temperatura ambiente (22-25°C). Cor original do reativo de Erlich: amarelo

Ou Reativo de Kovacs (pode ser adquirido comercialmente pronto para uso) ou ser preparado no laboratório: Álcool isoamílico 150 ml Paradimetilaminobenzaldeído 10,0 g Ácido clorídrico concentrado 50 ml Dissolver o aldeído em álcool e adicionar lentamente o ácido clorídrico; Guardar em frasco âmbar e no refrigerador quando não estiver em uso.

Obs: Não conservar em temperatura ambiente por longo período a cor pode ser alterada de amarelo palha para marrom, perdendo assim a sensibilidade.

Xilol : pode ser adquirido comercialmente pronto para uso.

Mod IV - 34

PROCEDIMENTOS Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação, até fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente na posição vertical.

Meio SIM Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação, até fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar solidificar em temperatura ambiente na posição vertical.

CONTROLE DE QUALIDADE Controle qualidade para meio Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Controle qualidade para meio SIM:

Microrganismo H2S INDOL MOTILIDADE

Proteus vulgaris + + +

Shigella sonnei neg neg neg

Escherichia coli neg + +

Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922 INOCULAÇÃO Meio Caldo Triptona Fazer um inóculo leve com colônia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactérias, bacilos

Gram negativos não fermentadores ou anaeróbios); Fazer um inóculo denso com colônia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus); Incubar a 35°C por 24 horas (enterobactérias) ou até 48 horas (bacilos Gram negativos não

fermentadores ou anaeróbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente. Meio SIM Com o auxílio da agulha, inocular uma colônia no meio na posição vertical, lentamente até a base; Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inóculo; Incubar a 35°C por 18-24 horas.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: Após incubação, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs. A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferência dos Gram negativos

não fermentadores ou anaeróbios, que podem produzir mínima quantidade de indol. Revelação com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e

aguardar 1 minuto; Adicionar pela parede do tubo 0,5 ml do reativo de Erlich e realizar a leitura.

Mod IV - 35

Indol positivo: aparecerá um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol. Indol negativo: permanecerá um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol. Revelação com reativo de Kovacs no meio SIM Realizar a leitura da motilidade e do H²S. Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o

crescimento bacteriano. Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.

Motilidade positiva: microrganismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no meio ـ

causando turbidez.

Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inóculo, em ـ volta continua límpido.

.H²S positivo: ao longo da linha de inoculação aparecerá a cor negra ـ .H²S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada ـ .Indol positivo aparecerá um anel vermelho ـ .Indol for negativo aparecerá um anel amarelo ـ CONSERVAÇÃO E VALIDADE Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8°C. Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8°C em tubos com tampas de rosca, tubos com tampão

de algodão o meio pode ressecar antes deste prazo. RECOMENDAÇÕES Um ótimo pH para triptofanase é levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH ácido pode baixar a

produção do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco.

Cultura para ser testada produção de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tensão de oxigênio baixa a produção de indol.

Indol positivo se perde após 96 horas de incubação.

Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produção, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espécies de Clostridium spp.

Pequenas modificações podem ser necessárias para testar a produção de indol em não fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilização de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extração com xilol e revelação com reagente de Ehrlich.

Na extração de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a diluição do indol tornando-o fraco positivo ou negativo.

Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inóculo denso no caldo de triptona, incubação de 48 horas, extração com xilol e revelação com reagente de Ehrlich.

CALDO MALONATO PRINCÍPIO Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sódio como única fonte de

carbono, resultando em alcalinização do meio. UTILIDADE Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores.

Mod IV - 36

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Caldo Malonato.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Ajustar o pH 6,7 ± 0,2; Distribuir 1,5 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

INOCULAÇÃO Inocular colônias puras de 18 a 24 horas; Inóculo leve; Incubar a 35°C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: verde. Positivo: azul. Negativo: inalterado (verde).

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas. Após este período realizar controle positivo e negativo semanalmente.

RECOMENDAÇÕES Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentação da glicose aumenta

a acidez.

Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinização, dificultando a interpretação. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inóculo para comparação, junto com o teste em questão, se não aparecer nenhum traço azul, incubar por mais 24 horas, liberando o resultado negativo após incubação de 48 horas.

Cuidado ao interpretar resultados após incubação prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reação fraca positivo podendo ser ignorado.

CALDO NITRATO

PRINCÍPIO Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO³) a nitrito (NO²) ou gás

nitrogênio (N²) (denitrificação). UTILIDADE Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores, anaeróbios, Haemophilus,

Neisseria e Mycobacterium. FÓRMULA /PRODUTO Meio comercial: Caldo Nitrato. Reagentes para revelação da reação.

Mod IV - 37

Solução A Ácido sulfanílico 0,8 g Ácido acético 5N 100 ml Solução B N,N-dimetil-l-naftilamina 0,6 g Ácido acético 5N* 100 ml * Ácido acético 5N

Ácido acético glacial 40 ml Água destilada 100 ml Zinco em pó (pronto para uso)

PROCEDIMENTOS Caldo nitrato Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Acertar o pH 7,0; Distribuir 3 ml do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido; Esterilizar em autoclave; Deixar o tubo esfriar na posição vertical

Reagentes para revelação da reação. Solução A Dissolver o ácido sulfanílico em uma parte do ácido e depois completar com o restante do ـ

ácido acético q.s.p. 100 ml. Solução B Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do ácido e completar o restante do ácido ـ

acético q.s.p. 100 ml. CONTROLE DE QUALIDADE

ResultadoCepa Resultado esperado

Nitrato reduzido a nitrito Enterobactérias Coloração vermelha

Nitrato a gás Pseudomonas aeruginosa Bolhas no tubo de Durhan

Nitrato não reduzido Acinetobacter baumannii Coloração vermelha somente após adição de pó de zinco

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ATCC INOCULAÇÃO Fazer um inóculo denso, com colônias recentes (18 – 24 horas) no meio com alça bacteriológica; Não agitar o tubo após inoculação; Incubar 35±1°C por 24 a 48 horas, sendo necessário algumas vezes até 5 dias; Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os reagentes para revelar a

reação; Verificar a presença de bolhas dentro do tubo de Durhan.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: incolor a palha.

Verificar se há bolhas de gás dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactéria reduziu nitrato a gás = denitrificação.

Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactéria reduziu nitrato a nitrito.

Se após a adição dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar uma pitada de pó de zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactéria não reduziu nitrato a nitrito e o nitrato ainda permanece no meio.

Mod IV - 38

IMPORTANTE: algumas bactérias não conseguem reduzir nitrato a nitrito e só conseguem reduzir nitrito, como por exemplo alcaligenes faecalis e oligella uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para este fim.

RESULTADO REAGENTES A e B PÓ DE ZINCO GÁS NO TUBO DE DURHAN

reduziu + não houve reação não houve reação nitrato a nitrito não reduziu neg pos neg nitrato a nitrito nitrato neg neg + reduzido a gás

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Caldo nitrato: conservar o meio de 4 a 8°C por até 6 meses. Soluções A e B: guardar em frasco escuro na geladeira (4 a 8°C) por até 12 meses. Ácido acético 5N: Conservar de 4 a 8°C por até 12 meses.

RECOMENDAÇÕES Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar resultado falso positivo,

devido à alta sensibilidade do teste.

Quando for adicionado o pó de zinco, não colocar em excesso, pode resultar em falso negativo (incolor).

MEIO BASE PARA OXIDAÇÃO E FERMENTAÇÃO - OF PRINCÍPIO Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou

fermentativa. UTILIDADE Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar

carboidratos. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Meio base de OF Carboidratos (dextrose ou glicose, lactose, sacarose, xilose, maltose, manitol etc). Vaselina líquida estéril.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer o meio até dissolver todo o ágar; Separar volumes iguais em diferentes Beckers, dependendo do número de carboidratos que serão

preparados; Adicionar 1g do carboidrato para cada 100 ml de meio base e homogeneizar; Distribuir 2 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em vapor fluente por 20 minutos (deixar a válvula de pressão da autoclave aberta e,

quando estiver saindo bastante vapor, começar marcar o tempo. Vapor fluente só pode ser feito

Mod IV - 39

em autoclave com tampas reguláveis para saída de vapor. Autoclaves horizontais não possuem controle de saída de vapor, são automáticas);

Pode-se também esterilizar a base e adicionar os açúcares esterilizados por filtração em filtros Millipore 0,45 µm (90 ml de base autoclavada e 10 ml de açúcar (esterilizado por filtração);

Deixar esfriar a temperatura ambiente na posição vertical. CONTROLE DE QUALIDADE

Resultado Cepa Resultado esperado

OF-GLICOSE Oxidador Pseudomonas aeruginosa A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F- amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F- inalterado

OF-FRUTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F- amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F-inalterado

OF-LACTOSE Oxidador Burkolderia cepacia A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F-amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F- inalterado

OF-MALTOSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F-amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F- inalterado

OF-MANITOL Oxidador Burkolderia cepacia A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F-amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F- inalterado

OF-SACAROSE Oxidador Stenotrophomonas maltophilia A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F- amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F-inalterado

OF-XILOSE Oxidador Burkolderia cepacia A-amarelo, F-inalterado Fermentador Klebsiella pneumoniae A/F-amarelo Inalterado Alcaligenes faecalis* A/F- inalterado

A= tubo aberto; F= tubo fechado com vaselina líquida Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 * Alcaligenes faecalisATCC 8750 ou Moraxella catarrhalis ATCC 25238 INOCULAÇÃO Inocular densamente até o fundo do tubo com a agulha bacteriológica, colônias provenientes de

uma placa de crescimento de 18 a 24 hs.; Inocular dois tubos, em um dos tubos acrescentar 1,0 ml de vaselina líquida estéril, no outro tubo

não colocar vaselina; Incubar á temperatura de 35°C por 48 horas ou mais; Se resultado negativo, pode ser necessário até 4 dias, excepcionalmente 14 dias, observando

diariamente. INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: verde Oxidador: tubo aberto - desenvolvimento de cor amarela

tubo fechado - inalterado (verde) Fermentador: tubo aberto e fechado - desenvolvimento de cor amarela Assacarolítico: tubo aberto e fechado - inalterado (verde)

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C por até 6 meses.

RECOMENDAÇÕES Sempre antes de interpretar a reação verificar se há crescimento nos tubos, porque algumas

bactérias não crescem no meio OF, sendo necessário enriquecimento do meio, acrescentando 2 % de soro de coelho ou cavalo.

Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto.

Mod IV - 40

ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO

PRINCÍPIO Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol

para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo).

A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada.

Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo. A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia.

Quando se prepara o meio, é importante que o bico e a profundidade tenham o comprimento igual ao redor de 3 cm cada um, de modo que o efeito das duas câmaras seja conservado.

UTILIDADE Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato

de hidrogênio e gás. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: TSI (tríplice açúcar ferro).

PROCEDIMENTOS Pesar o TSI conforme instruções do fabricante; Ajustar o pH para 7,3 ±0,2; Distribuir em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e incliná-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfície

em forma de bico de flauta (ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente.

CONTROLE DE QUALIDADE

Microrganismo ATCC Superfície Base H²S

Escherichia coli 25922 Ácido Ácido, gás neg Shigella flexneri 12022 Alcalino Ácido neg Edwardsiella tarda 15947 Alcalino Ácido + Pseudomonas aeruginosa 27853 Alcalino Alcalino +

INOCULAÇÃO Inocular colônia pura de 18 a 24 horas; Semear por picada até o fundo e na superfície do meio; Incubar 24 hs a 35°C, com a tampa semi aberta.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente. Leitura: entre 18 e 24hs. Cor púrpura = alcalino. Cor amarelo = ácido.

Reações ápice/base: Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos). Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares).

Mod IV - 41

Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado. H²S positivo = presença de precipitado negro.

ÁPICE BASE H²S GÁS INTERPRETAÇÃO MAIS PROVÁVEL

Vermelho Vermelho neg neg Sem crescimento = bactéria exigente Vermelho Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Não fermentador ou Gram (+) Amarelo Vermelho neg neg Crescimento na superfície = Gram (+) ou esquecimento de picar a base Amarelo Amarelo neg varia Enterobactérias ou Aeromonas Lac (neg) Amarelo Amarelo + varia Samonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar por até 6 meses de 2 a 8°C.

RECOMENDAÇÕES Quando há produção de H²S significa que a base é sempre ácida.

Não realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas, podendo resultar em falsas reações.

Não utilizar alças bacteriológicas para não fragmentar o meio, ocasionando falsa reação de gás, utilizar fio bacteriológico.

Qualquer traço de escurecimento no meio deve ser indicado com H²S positivo. ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN) PRINCÍPIO Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela

ação da enzima urease, resultando na alcalinização do meio. UTILIDADE Bacilos Gram negativos fermentadores e não fermentadores, Staphylococcus e Haemophilus.

FÓRMULA /PRODUTO Meio comercial: Uréia. Solução de uréia a 40% (40 g uréia + 100 ml de água destilada).

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio de uréia conforme instruções do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar até 50°C e adicionar assepticamente 5 ml da solução de uréia a 40% em 95 ml do meio base; Homogeneizar e distribuir 3 ml do meio assepticamente em tubos estéreis com tampa de rosca; Inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfície em forma de bico de flauta

(ângulo de 45°). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Obs: A solução de uréia a 40% é uma solução hipertônica e o risco de contaminação é baixo,

porém, pode-se esterilizar a solução por filtração (filtro Millipore de 0,45 µm). CONTROLE DE QUALIDADE Esterilidade: colocar 100% do lote preparado na estufa 35 ±1°C por 24 horas. Se não houver mudança de cor liberar para uso.

Mod IV - 42

Positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315 Negativo: Escherichia coli ATCC 25922

INOCULAÇÃO Inocular colônia pura de 18 a 24 horas; Fazer um inóculo denso; Semear na superfície do meio, não picar a base, pois a base pode servir como controle; Incubar 35°C de 6 a 24 horas, podendo ser necessário até 6 dias.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: alteração do meio para cor de rosa, pink. Negativo: sem alteração de cor do meio.

Diferentes graus de hidrólise da uréia podem ocorrer: Tubo inteiro cor pink. Superfície do tubo cor pink, base não muda de cor. Fracamente positivo: ápice cor pink, restante do tubo não muda de cor. Positivo rápido: 1 – 6 horas para Proteus spp. Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubação. Ex: algumas cepas de Klebsiella,

Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus.CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C por até 6 meses. Após este período realizar controle negativo e positivo semanalmente.

RECOMENDAÇÕES Não aquecer a solução base da uréia, pois a uréia pode se decompor se aquecida.

Não utilizar a uréia de Stuart porque é menos sensível para detectar a presença de urease.

Não deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrólise.

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