Meios de cultura - Apostilas - Biotecnologia_Parte3, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Meios de cultura - Apostilas - Biotecnologia_Parte3, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos meios de cultura empregados nos exames de microbiologia, prova de catalase, prova de coagulase.
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Microsoft Word - Mod IV 2004.doc

Mod IV - 43

5. FÓRMULAS E PRODUTOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO PARA PROVA DE CATALASE PRINCÍPIO A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio.

UTILIDADE Para Staphylococcus,Streptococcus,Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus,

Bacillus, Moraxella catarrhalis.FÓRMULA/ PRODUTO Peróxido de Hidrogênio (H2O2) 3%.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE peróxido de hidrogênio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor. Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% sobre uma lâmina; Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de hidrogênio.

INTERPRETAÇÃO Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão do

H2O2 em água e oxigênio gasoso. Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência.

RECOMENDAÇÕES Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos podem produzir reação fraca de

catalase.

Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, não usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois são catalase negativos.

PARA PROVA DE COAGULASE PRINCÍPIO Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, uma

vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protombrina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível.

Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre.

A coagulase conjugada (prova em lâmina), é também conhecida como fator de aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos.

Mod IV - 44

Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.

A coagulase livre (prova em tubo), é uma substância similar à trombina e está presente em filtrados de cultivos. É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos).

Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação.

UTILIDADE Separar as espécies de Staphylococcus de importância clínica, S. aureus – coagulase positiva, das

demais espécies – coagulase negativa. FÓRMULA / PRODUTO Plasma de coelho com EDTA liofilizado.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

CONSERVAÇÃO E VALIDADE plasma antes e depois de reconstituído, deve ser mantido refrigerado. Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO Coagulase conjugada: Traçar dois círculos com lápis de cera em uma lâmina de vidro;

Colocar duas gotas de água destilada ou solução fisiológica estéreis dentro de cada círculo;

Com auxílio de um fio bacteriológico agregar a colônia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada círculo;

Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos círculos;

No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução fisiológica estéreis, como controle;

Homogeneizar com palito de madeira;

Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e para trás;

Observar presença de aglutinação.

Coagulase livre: Com auxílio do fio bacteriológico, suspender colônias em estudo em caldo BHI e colocar em

estufa à 37ºC até que turve;

Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala de MacFarland;

Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 ml de plasma reconstituído e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento bacteriano recém turvado;

Incubar em estufa à 35ºC 4 horas;

Verificar se há presença de coágulo;

Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubação.

Mod IV - 45

INTERPRETAÇÃO Coagulase conjugada: Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos microrganismos da suspensão, após

15 segundos, no círculo que contém o plasma. Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma. Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem presença de precipitado ou aglutinação.

A presença de precipitado ou aglutinação, torna a prova inespecífica, devendo ser repetida a prova em tubo.

Coagulase livre: Positiva: presença de qualquer grau de coágulo. Negativa: ausência de coágulo.

RECOMENDAÇÕES Para a coagulase em tubo, as provas negativas após 4 horas a 37ºC, os tubos devem ser

mantidos em temperatura ambiente, pois a incubação prolongada a 37ºC podem produzir fibronolisinas, o que causa dissolução do coágulo durante a incubação.

Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e não agitar, pois a agitação pode desmanchar os coágulos parcialmente formados.

Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA.

Não utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), darão resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos.

Plasma humano não é recomendado, pois contém quantidades variadas de Fator de Reação com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/ negativa.

PARA PROVA DE GELATINASE PRINCÍPIO Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que

liquefaz/hidrolisa gelatina. UTILIDADE Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos

esporulados. FÓRMULA / PRODUTO Filme não revelado de Raio X. Salina 0,9 % estéril ou água destilada estéril.

PROCEDIMENTOS Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm; Armazenar em frasco estéril.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

INOCULAÇÃO Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 ml de salina 0,9% estéril ou água destilada estéril.; Com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazer um inóculo denso da bactéria a ser testada,

adicionar uma fita de raio x. Fazer o inóculo de colônias de crescimento de 18 a 24 horas;

Mod IV - 46

Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estéril ou água destilada estéril e a fita de Raio X, sem inóculo.

INTERPRETAÇÃO Positivo: emulsão de gelatina (cor verde) na porção submersa do filme torna-se transparente

(clara). Negativo: fita permanece verde, emulsão esverdeada permanece na porção submersa do filme.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Fitas: seguir instruções do fabricante.

RECOMENDAÇÕES Utilizar filme de Raio X não revelado.

PARA PROVA DE LECITINASE PRINCÍPIO Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inóculo.

UTILIDADE Diferenciação de espécies de Bacillus e Clostridium.

FÓRMULA / PRODUTO Fórmula - meio base: Gema de ovo de galinha depende do volume de meio base à ser utilizado Proteose de peptona nº 2 40 g Fosfato dissódico 5 g Fosfato de potássio 1 g Cloreto de sódio 2 g Sulfato de magnésio 0,1 g Glicose 2 g Solução de hemina (5 mg/ ml) 1 ml Ágar 20 g Água destilada 1000 ml pH: 7,6 Solução de gema de ovo à 50%: Gema de ovo 1 ml Solução fisiológica estéril 1 ml PROCEDIMENTOS Meio base: Pesar e hidratar todos os componentes, exceto a solução de gema de ovo; Aquecer em bico de Bunsen até fundir o ágar; Distribuir 20 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.

Meio para uso: Resfriar a 50ºC e adicionar 1 ml da solução de gema de ovo a 50%; Homogeneizar bem e distribuir em placas de Petri de 90 mm.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens ATCC 13124. Negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium difficile ATCC 9689.

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CONSERVAÇÃO E VALIDADE Meio base (para estoque): 4 a 8ºC fechado, durante 6 meses. Meio para uso: 4 a 8°C, embalado, durante 1 semana.

INOCULAÇÃO Com auxílio de um fio bacteriológico, tocar nas colônias em estudo e fazer um esfregaço circular e

denso sobre a superfície do meio. Incubar à 37ºC 24 horas em aerobiose - para cepas de Bacillus spp.; Incubar à 37ºC 48 horas em anaerobiose - para cepas de Clostridium spp.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo. Positivo: formação de halo branco ao redor das colônias. Negativo: ausência de halo, meio fica inalterado.

RECOMENDAÇÕES Não usar ovos velhos.

Não usar meio vencido. PARA PROVA DE OXIDASE

PRINCÍPIO O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria.

UTILIDADE Ajuda caracterizar espécies de Neisseria, distingui não fermentadores (oxidase positiva) de

enterobactérias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp.e Vibrio spp.

FÓRMULA / PRODUTO Reativo para teste de oxidade preparado no laboratório: N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato 1g ـ Água destilada 100 ml ـ

Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso). Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado em papel de filtro.

PROCEDIMENTOS Reativo para teste de oxidase: Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Becker e

adicionar 100 ml água destilada, vagarosamente para não oxidar a solução; Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Becker com o reativo; Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou; Colocar o papel na estufa a 35 ±1°C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Becker para

juntar o excesso de reativo; Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro.

Obs: Não utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das fitas. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (desenvolvimento de cor roxa). Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 (sem alteração da cor).

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INOCULAÇÃO Com auxílio de um palito de madeira ou plástico, espalhar a colônia a ser testada sobre a fita de

oxidase. Observar se há formação de cor roxa de imediato.

INTERPRETAÇÃO Cor original: branca ou levemente azulada Oxidase positiva: produção de cor roxa imediatamente no local da inoculação da bactéria. Oxidase negativa: não há mudança da cor do papel no local da inoculação da bactéria. Não considerar alteração de cor tardia.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8°C. Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas.

RECOMENDAÇÕES Não fazer o teste de colônias de crescimento de meios que contenham glicose, a fermentação

inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo.

Não fazer teste de oxidase de colônias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD, EMB).

Não usar alça ou agulha porque pode conter traços de ferro, podendo oxidar a fita e resultar em falso positivo.

Utilizar colônias de meios não seletivos tais como: ágar sangue e ágar chocolate.

Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade.

Não cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traços de ferro. PARA FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS PRINCÍPIO

A fermentação de carboidratos é amplamente utilizada para a diferenciação de gêneros e identificação de espécies bacterianas.

A prova consiste em verificar a capacidade do microrganismo fermentar ou não um determinado

carboidrato, permitindo assim verificar as suas características que auxiliaram na identificação. UTILIDADE Identificar e separar espécies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus

coagulase negativa.FÓRMULA/ PRODUTO Produto: Caldo para fermentação de carboidratos. Carboidratos mais utilizados: arabinose, sorbitol, rafinose, trealose, manitol, entre outros. Fórmula (base):

BHI caldo 22,5 g Carboidrato 10 g Indicador * 1 ml Água destilada 200 ml Água destilada 900 ml * Indicador púrpura de bromocresol: Púrpura de bromocresol 1,6 g Etanol a 95% 100 ml

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PROCEDIMENTOS Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtração e reservar; Pesar o BHI em béquer, acrescentar a água e homogeneizar bem; Adicionar o indicador e homogeneizar novamente; Esterilizar em autoclave; Após esfriar a base, adicionar o carboidrato esterilizado por filtração; Distribuir 3 ml por tubo.

CONTROLE DE QUALIDADE

CARBOIDRATOS POSITIVO NEGATIVO

Arabinose Enterococcus faecium Enterococcus faecalis

Rafinose Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis

Sorbitol Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum

Maltose Staphylococcus epidermidis Staphylococcus schleiferi

Trealose Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus epidermidis

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar entre 4 a 10 ºC por 3 meses.

INOCULAÇÃO Dissolver as colônias no caldo; Incubar à 35ºC 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: púrpura Positivo: Crescimento bacteriano (turvação do meio) com viragem do indicador para amarelo; Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, púrpura e sem

turvação. RECOMENDAÇÕES Para provas negativas, incubar um período maior (48 horas);

Não autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato. PARA A PROVA DE HIDRÓLISEPRINCÍPIO A prova de hidrólise PYR é um teste enzimático que consiste na hidrólise do substrato L-

pyrrolidonyl-alfa-naftylamide por uma enzima bacteriana, a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A hidrólise do substrato libera β-naphtylamide, que é detectada com a adição do reagente, o N,N- dimetilaminocinamaldeído, que forma uma base de Schiff, de coloração vermelha.

UTILIDADE Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de

Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp. Identificação de algumas espécies Staphylococcus coagulase negativa. Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.

FÓRMULA / PRODUTO Teste comercial : PYR test Fórmula - Caldo base de PYR (caldo de Todd-Hewitt):

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BHI caldo 500 g ـ Neopeptona 20 g ـ Dextrose 2 g ـ Cloreto de sódio 2 g ـ Fosfato dissódico 0,4 g ـ Carbonato de sódio 2,5 g ـ Água destilada 1000 ml ـ Para cada 100 ml de caldo base, adicionar 0,01 ml de L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide. Reagente de PYR comercial: N,N-dimetilaminocinamaldeído a 0,01%

PROCEDIMENTOS Pesar os componentes em béquer; Adicionar a água e homogeneizar bem até completa dissolução; Adicionar o L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide e homogeneizar novamente; Distribuir 0,2 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de Lancefield (S. pyogenes ATCC

19615) ou Enterococcus faecalis ATCC 29212 . Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses. Comercial: ver instruções do fabricante

INOCULAÇÃO Dissolver as colônias no caldo OU; No caso de usar kits comerciais, com auxílio de uma pinça flambada, colocar um disco impregnado

com o substrato de PYR sobre as colônias em estudo recém isoladas; Incubar à 37ºC por 4 horas; Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU; Retirar o disco e colocar sobre uma lâmina e adicionar 1 gota do reagente PYR.

INTERPRETAÇÃO Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (após adicionar o reagente de

PYR). Negativo: Sem alteração de cor (permanece amarela ou alaranjada).

RECOMENDAÇÕES Para identificações presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se

realmente são cocos Gram positivos/ catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos

Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas (como bílis esculina) tratar de enterococo ou não;

Não utilizar colônias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado falso - negativo;

Não exceder o tempo de leitura. PARA CRESCIMENTO A 42 E 44°C

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PRINCÍPIO Verificar a capacidade do microrganismo crescer em altas temperaturas.

UTILIDADE Identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Caldo BHI (infusão de cérebro e coração). Indicador púrpura de bromotimol (1,6 g de do indicador em 100 ml de álcool etílico 95%).

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Acrescentar o indicador púrpura de bromotimol (1 ml de indicador em 1000 ml de meio); Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.

CONTROLE DE QUALIDADE Temperatura 42°C: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Temperatura 44°C: Acinetobacter baumannii.

INOCULAÇÃO Com o auxílio de uma alça ou fio bacteriológico, inocular a colônia a ser testada; Realizar o teste com colônias puras de 18 a 24 horas; Incubar em banho Maria na temperatura a ser testada, 42°C ou 44°C.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: púrpura. Positivo: presença de turvação e viragem do indicador de cor púrpura para amarelo = crescimento

bacteriano. Negativo: ausência de turvação e permanência da cor púrpura = ausência de crescimento

bacteriano. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar por até 6 meses de 2 a 8°C.

RECOMENDAÇÕES Não fazer inóculo muito denso, pode resultar em falsa turvação.

Importante o controle da temperatura do banho, com termômetro de máxima e mínima. PARA TESTE DE MOTILIDADE PRINCÍPIO A bactéria é móvel através do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas

formas de cocos são móveis. A bactéria pode conter um ou muitos flagelos e sua localização varia com a espécie da bactéria e as condições de cultura.

UTILIDADE Determinar se o microrganismo é o não móvel; Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade), MILI (Motilidade, Indol,

Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias;

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Meio motilidade em caldo utilizado para não fermentadores e Enterobacter cloacae (em casos de dúvidas).

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Motilidade Meio comercial: SIM Meio comercial: MILI Meio comercial: MIO Meio Comercial: BHI (brain heart infusion) Meio Comercial: Triptona Solução de Vermelho de Tetrazólio.

PROCEDIMENTOS Meio Motilidade: Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação, até fundir o meio; Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posição vertical.

Meio Motilidade com adição da solução de Vermelho de Tetrazólio: Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação, até fundir o meio; Adicionar 0,1 ml para cada 100 ml de base de solução de vermelho de tetrazólio 0,1% e

homogeneizar bem; Distribuir aproximadamente 2,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar solidificar em temperatura ambiente na posição vertical.

Meio SIM /Meio MILI/Meio MIO Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação, até fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posição vertical.

Caldo BHI (motilidade em caldo) Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente.

Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instruções do fabricante; Aquecer sob agitação, até fundir o meio; Distribuir aproximadamente 3,0 ml em tubos com tampas de rosca; Esterilizar em autoclave; Retirar os tubos da autoclave; Deixar esfriar em temperatura ambiente.

CONTROLE DE QUALIDADE Meio Motilidade: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Meio SIM:

Mod IV - 53

Microrganismo H²S Indol Motilidade

Proteus vulgaris

Shigella sonnei

Escherichia coli

+

neg

neg

+

neg

+

+

neg

+

Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922 Meio MIO:

Microrganismo Motilidade Indol Ornitina

Escherichia coli

Enterobacter aerogenes

Klebsiella pneumoniae

+

neg

neg

+

neg

+

+

neg

+

Eschericha coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Meio MILI:

Microrganismo Crescimento Lisina Motilidade Indol

E. colidenso + + neg

K. pneum.denso + negneg

P. alcalifaciensdensoneg + neg

S. enteritidisdenso + + neg

S. flexneridensonegnegneg

E.coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Providencia alcalifaciens ATCC 9886, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella flexneri ATCC 12022 Meio BHI/Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Negativo: meio sem inocular.

INOCULAÇÃO Meio Motilidade / Meio SIM / Meio MILI / Meio MIO Com o auxílio de um fio bacteriológico inocular uma colônia pura de 18 – 24 horas, no meio na

posição vertical, lentamente até a base; Afastar a agulha seguindo a linha inicial da incubação; Incubar a 35°C por 18-24 horas.

MeioCaldoBHI/MeioCaldoTriptona Com o auxílio de uma alça ou fio bacteriológico, inocular colônia pura de 18 a 24 horas; Incubar a 35±2°C por 24 a 48 horas.

INTERPRETAÇÃO Meio de Motilidade: Motilidade positiva: organismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no meio,

causando turbidez. Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha de inóculo, em

volta continua límpido. Meio de Motilidade com Tetrazólio: Motilidade positiva: organismos móveis produzem uma nuvem cor pink e difundem-se

completamente no meio. Motilidade negativa: há crescimento da bactéria e produção de cor vermelho claro na linha do

inóculo e em volta do meio continua límpido. Se resultado for negativo incubar a 21-25°C por até 5 dias.

Revelação com reativo de Kovacs no meio SIM: Realizar a leitura da motilidade e do H2S.

Mod IV - 54

Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar otubo suavemente e proceder a leitura do indol.

Motilidade positiva: microrganismos móveis migram pela linha do inóculo e difundem-se no ـ meio causando turbidez;

Motilidade negativa: bactéria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inóculo, em ـ volta continua límpido;

;H²S positivo: ao longo da linha de inoculação aparecerá a cor negra ـ ;H²S negativo: linha ao longo da inoculação inalterada ـ ;Indol positivo aparecerá um anel vermelho ـ ;(Indol negativo permanecerá um anel amarelo (cor original do reativo de Kovacs ـ

Meio MILI Interpretar as reações da motilidade e lisina antes da adição do reagente de Kovacs para detecção

do indol.

.Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inóculo ـ .Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inóculo ـ Lisina decarboxilase positiva: indicado pela cor púrpura no meio (essa cor pode variar de ـ

intensa ou mais leve, de acordo com a redução do indicador). .Lisina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela do meio ـ Indol positivo: indicado pela formação de cor pink/vermelho, após a adição de 3 a 4 gotas de ـ

reagente de Kovacs na superfície do meio e agitação suave no tubo. .Indol negativo: reação negativa é indicada pelo desenvolvimento de cor amarela ـ

Meio MIO Interpretar as reações da motilidade e ornitina antes da adição do reagente de Kovacs para

detecção do indol.

.Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inóculo ـ .Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inóculo ـ .Ornitina decarboxilase positiva: indicado pela cor púrpura no meio ـ .Ornitina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela no meio ـ Indol positivo: indicado pela formação de cor pink/vermelho, após a adição de 3 a 4 gotas de ـ

reagente de Kovacs na superfície do meio e agitação suave no tubo. .Indol negativo: reação negativa é indicada pelo aparecimento da cor amarela ـ

Meio caldo BHI/ Meio Caldo Triptona Colocar uma gota do meio entre lâmina e lamínula e observar ao microscópio com objetiva de 40

X. A motilidade verdadeira deve ser diferenciada do movimento “browniano”, verificando que o microrganismo se desloca em várias direções. .Motilidade positiva: bactérias se movendo de um lado para outro ـ .”Motilidade negativa: bactéria apresenta somente movimento “browniano ـ

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Meios motilidade, SIM, MILI, MIO e BHI: conservar de 4 a 8° C por até 6 meses.

RECOMENDAÇÕES A temperatura de incubação é extremamente crítica, porque muitos microrganismos são móveis a

15-25°C e não móveis a 37°C. Se houver suspeita que o microrganismo pode exibir motilidade em baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, incubando um a 35°C e outro a temperatura ambiente 22-25°C.

Uso do sal de tetrazólio no meio de motilidade é desejável, mas pode inibir certos microrganismos fastidiosos.

Mod IV - 55

Flagelo é o órgão locomotor e é composto de proteína, essa proteína pode se desnaturar com excesso de calor. Por isso cultura testada em temperaturas acima do indicado para o teste de motilidade pode fornecer um resultado falso negativo.

Flagelo pode ser destruído também sob agitação violenta do tubo de cultura da bactéria, podendo produzir um resultado de motilidade fraco positivo ou falso negativo.

Microrganismos mantidos em estoques de cultura em meios artificiais por longos períodos tendem a perdem sua motilidade.

Os testes de motilidade em aneróbios são difíceis de serem interpretados, sendo significativos apenas os resultados positivos.

PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5% PRINCÍPIO A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns

microrganismos crescerem em presença do sal. Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo

de muitas bactérias. Este meio normalmente contém 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentração para 6,5 %, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos.

UTILIDADE Separa Enterococcus spp., que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são

NaCl 6,5% negativos. Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.

FÓRMULA / PRODUTO Não há meio pronto para uso. Fórmula:

BHI caldo 25 g NaCl 60 g Indicador * 1 ml Glicose 1 g Água destilada 1000 ml

* Indicador púrpura de bromocresol: Púrpura de bromocresol 1,6 g Etanol a 95% 100 ml Observação: o uso de indicador é opcional.

PROCEDIMENTOS Pesar o BHI, o NaCl e a glicose em um béquer; Adicionar a água e homogeneizar bem até completa dissolução; Adicionar o indicador e homogeneizar novamente; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Enterococcus faecium Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.

Mod IV - 56

INOCULAÇÃO Dissolver as colônias no caldo; Incubar.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo. Positivo: Crescimento bacteriano (turvação do meio) com ou sem viragem do indicador. Negativo: Ausência de crescimento. O meio permanece com a cor original, púrpura e sem

turvação. RECOMENDAÇÕES Provas negativas com 24 horas de incubação, recomenda-se período de incubação maior (48

horas);

Verificar a quantidade de NaCl contido na fórmula do meio de BHI, pois a concentração poderá ser outra, dependendo do fabricante do meio, e a concentração final do meio de NaCl a 6,5 % poderá ser superior ou inferior à concentração desejada;

Não carregar no inóculo, pois o excesso poderá ser interpretado como crescimento e dar resultados falso - positivos (para os meios utilizados sem o indicador);

Antes da leitura, agitar delicadamente o tubo, pois pode haver sedimentação das células bacterianas formadas;

Os Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e ocasionalmente os Streptococcus beta hemolítico presumível do grupo A de Lancefield (S. pyogenes)podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificação destas espécies.

Mod IV - 57

6. DISCOS PARA IDENTIFICAÇÃO BACITRACINA PRINCÍPIO Streptococcus beta hemolítico do grupo A são sensíveis a concentrações baixas de bacitracina.

UTILIDADE Identificação presuntiva de Streptococcus beta hemolítico do grupo A (S. pyogenes).

PRODUTO Discos de bacitracina de 0,04 unidades/ disco.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo (Sensível): Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Manter à 4ºC. Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO À partir de caldo BHI ou TSB recém turvado, semear na superfície do meio Mueller hinton sangue,

com auxílio do "swab"; Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente; Incubar à 35ºC 18 a 24 horas.

INTERPRETAÇÃO Positivo (Sensível): Presença de qualquer halo ao redor do disco. Negativo (Resistente): ausência de halo ao redor do disco.

RECOMENDAÇÕES Streptococcus alfa hemolíticos são sensíveis a baixas concentrações de bacitracina.

Não existem dados disponíveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibição.

O inóculo bacteriano deve ser confluente, inóculo muito diluído pode permitir que os Streptococcus não pertencentes ao grupo A pareçam sensíveis à bacitracina.

NOVOBIOCINA PRINCÍPIO Separa espécies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensíveis ou não a

Novobiocina. UTILIDADE Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente) das demais cepas de

Staphylococcus coagulase negativa de importância clínica; Staphylococcus saprophyticcus é a única espécie isolada em humanos como causadora de infecções urinárias.

Mod IV - 58

FÓRMULA / PRODUTO Discos de Novobiocina de 5 µg.

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Refrigerado. Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO Preparar uma suspensão do microrganismo em estudo com crescimento recente (até 24 horas)

em caldo BHI, TSA ou solução fisiológica estéril, acertando a turvação na escala 0,5 de MacFarland;

Com auxílio de um "swab", semear na superfície de uma placa de Ágar Mueller Hinton; Com uma pinça previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina na superfície do meio e

pressionar delicadamente; Incubar.

INTERPRETAÇÃO Resistente: Ausência de halo de inibição ou halos <= 15 mm. Sensível: Presença de halo de inibição igual ou superior a 16 mm.

RECOMENDAÇÕES Não usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas) para fazer a suspensão;

Se necessário usar cepas velhas, semear em caldo BHI ou TSA e incubar à 37ºC até turvar, acertar a turvação na escala 0,5 de MacFarland para fazer o teste;

Cepas isoladas de outros materiais biológicos que não urina, fazer identificação complementar com fermentação de açúcares para confirmar espécie.

OPTOQUINA PRINCÍPIO Cloridrato de etil-hidroxicupreína (optoquina), um derivado da quinina, inibe de forma seletiva o

crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentrações muito baixas (5 µg/ ml ou menores).

As células do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido à variação da

tensão superficial, e é produzida uma área de inibição.

UTILIDADE

Separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolíticos. FÓRMULA / PRODUTO Discos de optoquina de 5 µg

CONTROLE DE QUALIDADE Positivo (Sensível): Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Negativo(Resistente): Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Mod IV - 59

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Manter à 4ºC. Validade: ver recomendações do fabricante.

INOCULAÇÃO À partir de caldo BHI ou TSB recém turvado, semear na superfície do meio Mueller hinton sangue,

com auxílio do "swab"; Colocar um disco de optoquina e pressionar levemente; Incubar à 35ºC 18 a 24 horas em jarra com vela acesa ou estufa com 5 a 7 de CO2.

INTERPRETAÇÃO Positivo (Sensível): Disco de 6 mm: halo de inibição de 14 mm ou mais. Disco de 10 mm: halo de inibição de 16 mm ou mais.

Negativo (Resistente): Disco de 6 mm: halo de inibição inferior à 14 mm ou ausência de halo. Disco de 10 mm: halo de inibição inferior à 16 mm ouausência de halo.

RECOMENDAÇÕES A optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentrações muito elevadas.

Mod IV - 60

7. MEIOS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS HTM – HAEMOPHILUS TEST MÉDIUM PRINCÍPIO É um meio suplementado que permite o crescimento das espécies mais exigentes de

Haemophilus, pois contém em sua fórmula suplementos à base de NAD e cisteína. UTILIDADE Meio padronizado pelo NCCLS para realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos de

Haemophilus influenzae. FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial HTM Suplemento VX: NAD (Coenzima I) e cisteína.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante em um balão de fundo chato; Esterilizar em autoclave; Resfriar o meio a 50°C e adicionar o suplemento previamente reidratado; Distribuir 50 a 60 ml em placas estéreis de 150 mm (o meio deve ficar com uma espessura

homogênea de 3 a 4 mm); Deixar esfriar à temperatura ambiente.

CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento: Preparar uma suspensão de Haemophilus influenzae ATCC 10211 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de solução fisiológica); Semear 0,01 ml da suspensão na placa; Incubar a placa 35 ±2°C por 24 horas em estufa com 5% de CO². Se a bactéria crescer em 24 horas, liberar o lote para uso.

Obs: A aprovação final do meio deve ser feita após os testes com antibióticos, uma vez que inúmeras variáveis como níveis de timina, timidina só podem ser verificadas após o teste com os antibióticos ter sido realizado. INOCULAÇÃO Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac

Farland; Embeber o “swab” na suspensão, comprimí-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e

semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instruções do NCCLS para a bactéria a ser testada.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: castanho escuro. A zona do diâmetro é particular para cada droga e organismo, sendo comparado com diâmetros

padronizados pelo NCCLS, que determina cada organismo sendo sensível, intermediário ou resistente.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.

Mod IV - 61

ÁGAR MUELLER HINTON PRINCÍPIO Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das

principais bactérias. UTILIDADE Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos

métodos de difusão em disco e E-test para enterobactérias, não fermentadores, Staphylococcus, Enterococcus sp.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Ágar Muller Hinton.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Acertar o pH (7,2 – 7,4); Retirar da autoclave e medir novamente o pH; Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm;. Deixar esfriar em temperatura ambiente; Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira (4 a 8°C).

Obs: É extremamente importante que o meio tenha espessura homogênea de 3 a 4 mm. CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento: Preparar uma suspensão de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1mL em 9,9 ml de solução fisiológica); Semear 0,01 ml da suspensão na placa. Incubar a placa 35°C por 24 horas.

Obs: A aprovação final do meio deve ser feita após os testes com antibióticos, uma vez que inúmeras variáveis como níveis de timina, timidina, de cálcio e magnésio só podem ser verificadas após o teste com os antibióticos ter sido realizado. INOCULAÇÃO Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala

0,5 Mac Farland; Embeber o “swab” na suspensão, comprimí-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e

semear na placa; Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instruções do NCCLS para a bactéria a ser testada.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: amarelo palha. A zona do diâmetro é particular para cada droga e organismo, sendo comparado com diâmetros

padronizados pelo NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensível, intermediário ou resistente.

CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.

RECOMENDAÇÕES Principais variáveis que podem interferir no resultado do antibiograma:

Mod IV - 62

Níveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentrações levam a diminuição na atividade de aminoglicosídeos diante de Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactérias. Concentrações diminuídas levam a resultados contrários.

Concentração de timidina ou timina: concentrações em excesso levam à falsa resistência para sulfonamidas e trimetropima.

pH: em pH baixo vamos observar halos de inibição reduzidos para aminoglicosídeos, quinolonas, macrolídeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibióticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores.

Espessura do meio: < de 3 mm leva à falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva à falsa resistência. ÁGAR MUELLER HINTON SANGUE PRINCÍPIO Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das

principais bactérias. UTILIDADE Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos

métodos de difusão em disco e E-test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos beta-hemolíticos dos grupos A,B,C e G conforme instruções do NCCLS.

FÓRMULA / PRODUTO Meio comercial: Ágar Muller Hinton. Sangue de carneiro desfibrinado.

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instruções do fabricante; Acertar o pH (7,2 – 7,4); Retirar da autoclave e resfriar a 50°C; Adicionar 50 ml de sangue de carneiro desfibrinado por litro de meio de cultura de forma

asséptica; Homogeneizar bem sem formar espuma; Distribuir 50 a 60 ml em cada placa de 150 mm; Deixar esfriar em temperatura ambiente; Embalar as placas com plástico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8°C.

Obs: É extremamente importante que o meio tenha espessura homogênea de 3 a 4 mm. CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento: Preparar uma suspensão de Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 na escala 0,5 de Mac Farland; Diluir 1:100 (0,1 ml em 9,9 ml de solução fisiológica); Semear 0,01 ml da suspensão na placa; Incubar a placa 35°C por 20 a 24 horas com 5% de CO². Se a bactéria crescer em 24 horas, o lote está pronto para uso.

Obs: A aprovação final do meio deve ser feita após os testes com antibióticos, uma vez que inúmeras variáveis como níveis de timina, timidina, de cálcio e magnésio só podem ser verificadas após o teste com os antibióticos ter sido realizado. INOCULAÇÃO Preparar uma suspensão da bactéria a ser testada em salina 0,9% ou caldo TSB na escala 0,5 Mac

Farland; Embeber o “swab” na suspensão, comprimí-lo na parede do tubo (para eliminar o excesso) e

semear na placa;

Mod IV - 63

Acrescentar os discos a serem testados; Incubar a placa de acordo com instruções do NCCLS para a bactéria a ser testada.

INTERPRETAÇÃO Cor original do meio: vermelho. A zona do diâmetro é particular para cada droga e organismo, sendo comparado com diâmetros

do NCCLS, que determina cada microrganismo sendo sensível, intermediário ou resistente. CONSERVAÇÃO E VALIDADE Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses.

RECOMENDAÇÕES Principais variáveis que podem interferir no resultado do antibiograma: Níveis de Ca2+, Mg2+ : altas concentrações levam a diminuição na atividade de tetraciclinas para

todas as bactérias. Concentrações diminuídas levam a resultados contrários.

Concentração de timidina ou timina: concentrações em excesso levam à falsa resistência para sulfonamidas e trimetropima.

pH: em pH baixo vamos observar halos de inibição reduzidos para quinolonas, macrolídeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibióticos (penicilina e tetraciclinas). O aumento do pH leva a resultados opostos aos anteriores.

Espessura do meio: < de 3 mm leva à falsa sensibilidade geral e > 4 mm leva à falsa resistência.

Mod IV - 64

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Balows A., Hausler, W.J. Jr., Herrmann, K.L., Isenberg, H.D. and Shadomy, H.J. Manual of

clinical microbiology. 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991.

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3. Becton Dickinson and Company. Product catalog for microbiology1996/ 1997, Canada, 1997.

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5. Konemen, E.W. Trad. Cury, A.E. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 5a. Ed., MEDSI, Rio de Janeiro, 2001.

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10. Murray, P.R., Baron, J.E., Pfaller, A.M., Tenover, C.F. and Yolken, H.R. Manual of clinical microbiology. American Society for Microbiology, 7th ed., Washington. DC, 1999.

11. Oplustil, C.P., Zoccoli, C.M., Tobouti, N.R., e Sinto, S.I. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica, Sarvier, São Paulo, 2000.

12. Oxoid. Manual Oxoid. Espanã, Unipath España, 1995.

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