MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo do melhoramento de microrganismos de interesse industrial, genética microbiana, mutação, tecnologia do DNA recombinante.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

SETOR DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE INDUSTRIAL

Trabalho acadêmico apresentado à

disciplina Processos Fermentativos

Industriais da Universidade Federal

do Paraná.

CURITIBA

2008

1

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO................................................................................................ 2

2- GENÉTICA MICROBIANA.............................................................................. 3

2.1- BACTÉRIAS............................................................................................. 4

2.2- FUNGOS.................................................................................................. 8

3- MUTAÇÃO...................................................................................................... 12

3.1- MUTAÇÃO ESPONTÂNEA...................................................................... 13

3.2- MUTAÇÃO INDUZIDA.............................................................................. 14

3.2.1- Agentes físicos............................................................................... 15

3.2.2- Agentes químicos........................................................................... 17

3.3- MECANISMOS DE REPARO................................................................... 21

3.4- SOBREVIVÊNCIA E SELEÇÃO DE MUTANTES.................................... 23

4- TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE................................................... 24

4.1- PROBLEMAS........................................................................................... 24

4.2- VETORES................................................................................................ 27

4.3- PRODUÇÃO E DETECÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES.............. 29

4.4- REGULAMENTAÇÃO SOBRE OGM.......................................................32

5- EXEMPLOS DE MICRORGANISMOS MELHORADOS................................ 37

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 38

7- ANEXOS....................................................................................................... 40

2

1- INTRODUÇÃO

A utilização de um microrganismo em um processo biotecnológico envolve

geralmente a produção de algum composto de interesse. No entanto, as espécies

que são encontradas na natureza normalmente não produzem grandes quantidades

de metabólitos, somente o necessário para a sobrevivência. Por isso, cabe ao

biotecnologista melhorar essa produção para poder aplicá-la em escala industrial.

Para atingir esse objetivo, podem-se utilizar dois métodos. O primeiro seria

definido como a biotecnologia convencional, ou seja, a otimização das condições

fisiológicas e nutricionais do meio de cultivo onde o microrganismo cresce. Essa

técnica pode apresentar bons resultados, mas às vezes não é suficiente, pois há a

limitação da capacidade máxima de síntese do microrganismo.

Poucas indústrias utilizam cepas silvestres nos seus processos de produção.

A produção de mutantes mais adaptados para processos é uma busca constante na

pesquisa de melhoramento de microrganismos. Isso se deve principalmente ao valor

econômico de aumento da produção, chegando às vezes até a 100 vezes mais.

Processos que envolvem produtos oriundos de um ou poucos genes, como a

produção de enzimas, podem ser incrementados somente com o aumento da dose

gênica, ou seja, aumento da quantidade do mesmo gene presente na célula e

aumento do seu nível de expressão. Já para metabólitos secundários, o processo de

melhoramento já é mais complicado, pois, como são produtos finais de vias

biossintéticas, envolve várias etapas reacionais, e a modificação delas é mais

trabalhosa.

Algumas vezes o objetivo desejado não é o melhoramento do produto, mas

sim a capacidade de desenvolvimento do microrganismo em determinadas

condições ambientais. Pode-se melhorar cepas de forma a obter microrganismos

que necessitam tempos de fermentação mais curtos, que não produzam metabólitos

indesejáveis (barateando o custo de recuperação do produto), que necessitam de

menos oxigênio ou que são capazes de utilizar determinados substratos como

resíduos agroindustriais.

A manipulação genética pode ser muito utilizada pela biotecnologia, pois é

uma ferramenta muito útil para aumentar o rendimento da produção, melhorar a

qualidade do processo de produção, melhorar as características do produto (como

na melhoria de enzimas conferindo maior especificidade e termoestabilidade),

3

produzir produtos já existentes por outras vias alternativas, e produtos novos

produtos não encontrados na natureza.

A modificação do material genético pode ser feita de duas formas: ação de

agentes mutagênicos ou a produção de DNA recombinante. A mutagênese de

microrganismos permite a criação de genótipos diferentes da célula original através

da alteração aleatória dos genes. Já a recombinação permite um rearranjo de genes

que permite a inserção de material genético de várias fontes em um só

microrganismo. A mudança química no DNA, independente de ser por mutagênese

ou recombinação, é um fator necessário, mas muitas vezes insuficiente para a

produção de um mutante, pois antes de se observar uma população de células

modificadas capazes de passar o novo material genético para as futuras gerações é

necessário lidar com os mecanismos de reparo da célula, a transcrição e tradução

da informação, e também o enriquecimento do meio de cultura com os mutantes

desejados.

Mutações favoráveis para a produção de determinado produto muitas vezes

podem acarretar na modificação das necessidades ambientais da célula. Portanto,

após a seleção de um mutante é necessário determinar os novos parâmetros de

cultivo necessários para o melhor aproveitamento das potencialidades do

microrganismo através da biotecnologia básica. Ao mesmo tempo pode-se tentar

melhorar ainda mais a cepa mutante através do outras mutações, ou seja, o

processo de melhoramento de uma cepa envolve a modificação genética contínua

da cultura e determinação dos novos parâmetros operacionais.

Esse trabalho visa mostrar em mais detalhes a utilização de técnicas de

melhoramento genético de cepas de microrganismos. Para ilustrar melhor esses

princípios, estão em anexo dois artigo mostrando a aplicação dos conceitos.

2- GENÉTICA MICROBIANA

A genética microbiana começou a ser elucidada com Fred Griffith em 1928,

quando se observou a transferência da virulência de cepas de Streptococcus

pneumoniae. Ele percebeu que quando uma cepa não virulenta da bactéria entrava

em contato com constituintes da célula inativada de uma cepa virulenta, havia a

transformação da cepa não-virulenta, e esta passava também a causar a doença.

Oswald T. Avery foi quem descobriu que a cepa se transformava devido à

4

incorporação de material genético da bactéria inativada, provando que o DNA

carregava a informação genética.

Em 1952, Alfred D. Hershey e Martha Chase mostraram que o DNA é o

material genético de bacteriófagos T2. Eles utilizaram fósforo radioativo para

observar se era o material do DNA que penetrava na célula bacteriana e transferia

as informações do fago.

Após esses estudos, vários outros foram feitos, o que contribuiu muito para o

desenvolvimento da biologia molecular, propiciando a obtenção de organismos

mutantes e de recombinantes.

2.1- BACTÉRIAS

A principal fonte de material genético nas bactérias é o cromossomo

bacteriano, que consiste um uma dupla fita de DNA geralmente circular e contém

todos os genes essenciais para a sobrevivência em condições normais. As bases

nucléicas podem apresentar ou não algumas metilações que servem para identificar

material genético velho durante a replicação, proteger o DNA da ação de nucleases,

e cronometrar certos eventos celulares.

A maioria dos genes presentes no cromossomo das bactérias apresenta uma

única cópia, exceto os genes que codificam para RNA ribossomal.

Aproximadamente 90% do DNA presente codifica para proteínas e polipetídeos, e os

10% servem para o controle da expressão gênica. Não há a presença de DNA sem

função aparente como acontece nas células eucarióticas.

Uma parte do DNA bacteriano está organizada na forma de operons, ou

unidades transcricionais, que apresentam seqüências codificadoras para produtos

correlatos e mesmo sítio de regulação, como mostra a Figura 1. As seqüências

ativadoras e repressoras controlam a síntese e a freqüência da transcrição.

5

Figura 1- Transcrição e tradução de um operon

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Além do cromossomo, a bactéria pode apresentar outros tipos de fontes de

informações genéticas, como mostra a Tabela 1. Os plasmídeos são elementos

circulares de DNA extra-cromossômico que geralmente contém gene de resistência

a algum antibiótico. Os transpossons são seqüências de DNA capazes de se

movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Já os profagos são

seqüências gênicas provenientes de bacteriófagos e foram incorporadas no

cromossomo da bactéria.

Tabela 1- Tamanho médio dos elementos genéticos encontrados em bactéria

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

6

Para entender como modificar geneticamente uma bactéria, primeiramente é

necessário conhecer os mecanismos de transferência do material genético. O mais

essencial é a transferência do DNA para as células filhas durante a divisão celular.

Para isso ocorre uma duplicação do DNA circular a partir da origem de replicação

oriC. Na forquilha de replicação formada, a duplicação ocorre nas duas direções ao

mesmo tempo (Figura 2, esquerda). Como a replicação em bactérias ocorre muito

rapidamente e muitas vezes inicia-se uma replicação sem que a anterior tenha

terminado, acontece a formação de inúmeras cópias durante a divisão, como mostra

a Figura 1 à direita. O cromossomo bacteriano está aderido a uma invaginação da

membrana celular chamada mesossomo, e esse fato é importante para que a cópia

formada após a replicação vá para a célula filha.

Figura 2- Replicação bacteriana

Fonte: Ratledge & Kristiansen, 2006.

Outro processo de transferência de material genético é a conjugação, que

consiste na transferência de DNA plasmidial diretamente de uma célula doadora de

material genético para uma célula receptora desse material através de uma fímbria.

O plasmídeo possui uma região codificante para a fímbria. Logo, as células

doadoras foram chamadas de células F+, e o receptor F-. Existem também as

células que têm plasmídeo ligado ao cromossoma bacteriano, são as chamadas de

Hfr (High Frequency of Recombination) e são elas que transferem genes

cromossômicos de células doadoras para células receptoras. Na natureza a

conjugação dá-se entre espécies e, raramente ocorrem cruzamentos inespecíficos

entre gêneros aparentados, como Escherichia e Shigella.

7

O processo de transformação é aquele que foi observado por Griffit em 1928

durante o experimento com pneumococos. O fenômeno foi chamado de

transformação, pois não requer um contato entre duas células, mas sim a

incorporação de um DNA exógeno no cromossomo da bactéria e que sa pareia

numa região homóloga do cromossomo da mesma. Há a formação de

recombinantes nas próximas duplicações, pois, o seguimento incorporado vai

também sofrer duplicação. Desta forma, pode haver modificação em uma ou mais

características genéticas de células descendentes.

A transformação é um ótimo sistema genético para estudos. Por meio dela

pode-se combinar genes de diferentes linhagens em uma mesma, fazer

mapeamento genético e construir mapas bastante detalhados de regiões do genoma

das espécies estudadas. A descoberta da transformação em outros organismos,

como fungos filamentosos e leveduras e a utilização em larga escala do mecanismo

de tecnologia do DNA recombinante, faz com que esse sistema de recombinação

tenha grande importância econômica e biotecnológica.

O último processo seria a transdução, que é uma outra forma alternativa de

recombinação usando bacteriófagos. Pode também ser considerado um refinado

processo de transformação. Foi descrito pela primeira vez em 1952 na bactéria

Salmonella typhimurium. Nesse caso, os fagos infectam as bactérias, lisam-na e

podem ter um seguimento do DNA bacteriano substituído pelo seu próprio DNA, ou

mesmo ter alguns genes da bactéria inserido no seu próprio genoma. Assim, ao

infectar uma outra célula e injetar nela seu material genético, é desencadeado a

transdução.

Existem basicamente três tipos distintos de transdução: a generalizada

(ocorre quando uma célula, depois de infectada é lisada e um ou poucos fagos

contém no interior de sua capa protéica DNA da bactéria, não impedindo que o fago

alterado infecte outra bactéria), a específica (ocorre com um tipo de fago de ciclo

lisogênico -fago λ- que não lisa a célula, mas picota o seu material genético e o

encapsula como se fosse seu), e a abortiva (quando o fago vetor carreia penetra na

célula bacteriana receptora mas, por razões ainda não conhecidas, não é integrado

ao cromossomo bacteriano e, não tendo duplicação autônoma, também não se

duplica dentro dela).

8

Assim como a conjugação e a transformação, a transdução também pode ser

usada para mapeamento de genes ao longo do cromossomo. Uma co-transdução,

isto é, duas características freqüentemente sendo transduzidas, indicam ligação de

genes.

2.2- FUNGOS

A transferência do material genético nos fungos pode ocorrer de forma

sexuada ou assexuada. A reprodução assexuada pode ser feita na forma de divisão

binária da célula parental em duas células filhas, por brotamento (principalmente em

leveduras), e pela produção de esporos assexuados. Os esporos assexuais podem

ser formados por:

 Fragmentação da hifa formando células que se comportam com esporos,

chamadas artroconidia ou artroesporos.

 Envolvimento da célula por uma espessa parede antes da separação,

formando clamidoesporos.

 Formação de esporos dentro de um saco na ponta ponta da hifa, gerando

esporangioesporos.

 Formação de esporos fora de um saco nos lados ou ponta da hifa, chamados

conidioesporos.

 Produção de esporos durante o processo de brotamento, chamados

blastoesporos.

Alguns fungos que apresentam compatibilidade nucléica têm reprodução

sexuada. Fungos haplóides sofrem fusão das hifas e formação de uma célula

dicariótica, onde há dois núcleos haplóides separados. Em seguida ocorre a da

fusão nuclear (cariogamia). Isso produz um estágio diplóide, o zigoesporo, que

sofrerá várias meioses e processos de recombinação para gerar esporos com

combinações dos genótipos parentais.

Nos fungos existe também a reprodução parassexual, que pode ocorrer tanto

em espécies que fazem reprodução sexuada como assexuada. Na reprodução

parassexual há a fusão de hifas de igual ou diferente número de núcleos, formando

um micélio heterocarioto de com núcleos de ambas as cepas parentais. O

9

heterocarioto é normalmente estável pode ocorrer também a fusão dos núcleos.

Para se obter recombinação dos genes é necessário produzir células haplóides ou

esporos. A haploidização nesse caso pode ser induzida com a utilização de p-

fluorofenilalanina. A formação dos haplóides não acontece devido à meiose, mas

devido à distribuição aleatória dos cromossomos às células filhas (Figura 3).

Figura 3- Ciclo parassexual

Fonte: < http://www2.mcdaniel.edu/Biology/botf99/fungifromweb/fungiintro.html >

O melhoramento genético de fungos de importância industrial aconteceu

primeiramente através de técnicas genéticas clássicas, a qual buscava espécies

naturais com as melhores qualidades e cruzava-se essas linhagens para obter uma

nova cepa melhorada. Após, surgiu também outras tecnologias de mutação, fusão

de protoplastos e do DNA recombinante, as quais permitiram uma maior

manipulação genética dos fungos, resultando em novas características de valor

biotecnológico adicionadas às espécies. A Figura 4 mostra o aumento do rendimento

na produção de penicilina utilizando mutação das cepas.

10

Figura 4- Melhoramento genético para a produção de penicilina pelo fungo

filamentoso Penicillium chrysogenum

Fonte: < http://www.ufv.br/dbg/trab2002/MELHOR/MHR004.htm >

A fusão de protoplastos é usada geralmente em leveduras e bolores.

Protoplastos são células desprovidas de parede celular que podem ser obtidas em

laboratório e que permitem uma maior manipulação. A formação dos protoplastos é

realizada crescendo células em uma solução isotônica contendo estabilizadores

osmóticos (como a sacarose) para evitar o rompimento da membrana e tratando as

células com enzimas que degradam a parede celular. Após a remoção da parede, a

fusão de protoplastos pode ser então realizada através da adição de agentes

fusogênicos como polietilenoglicol (PEG). Além do PEG, pode ser utilizado o

processo de fusão induzida por campo elétrico. Quando as células se encontram em

um campo elétrico de corrente alternada aparecem orifícios na membrana

plasmática, os quais facilitam o processo de fusão celular. Os protoplastos

fusionados não necessariamente são da mesma espécie, e essa é uma das

11

vantagens da técnica. Por exemplo, protoplastos de Penicillium roquefortii podem

ser fusionados com protoplastos de P. chrysogenum, e protoplastos de leveduras

podem ser fusionados até com eritrócitos.

MARTINS, HORII e PIZZIRANI-KLEINER (1998) estudaram a fusão de

protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae com o objetivo de obter

linhagens de leveduras com características importantes na indústria vinícula.

Primeiramente as células foram cultivadas em meio YEPD líquido e após

crescimento foram lavadas várias vezes de forma a separar os pellets. Uma das

alíquotas retiradas recebeu o tratamento da enzima lítica Novozym 234 e foi

incubada à 28ºC.

O grau de formação de protoplastos foi feito como proposto por Gunge e

Tamaru (1978), comparando o número de colônias produzidas pelo cultivo em meio

sólido YEPD das células que sofreram ação da enzima com o número de colônias

formadas pelo cultivo sem a presença da enzima. Observou-se que em 30 minutos

de exposição à enzima já era suficiente para se ter praticamente 100% das células

transformadas em protoplastos.

Para a análise da fusão dos protoplastos, utilizou-se duas linhagens com

auxotrofias contrastantes (uma tinha deficiência para arginina e a outra para

piridoxina). Fez-se uma mistura das duas linhagens, adicionou-se a solução de 40%

de PEG e incubou-se a mistura a 30ºC por 30 minutos. Depois de decorrido o tempo,

lavou-se as células três vezes com solução tampão e semeou-as por pour-plate em

três meios para permitir a regeneração da parede celular: meio mínimo para

regeneração (MM), YEPD e YEPD-sorbitol. Após crescimento nas placas, contou-se

o número de colônias formadas nas placas. A freqüência de fusão citoplasmática foi

estimada como sendo: (nº de colônias em MM)/[(nº de colônias em YEPD-sorbitol)-

(nº de colônias em YEPD)].

A técnica de protoplastos pode ser utilizada tanto para bactérias como para

fungos, diferenciando que para o primeiro grupo serão utilizadas enzimas como a

lisozima, enquanto que para o segundo seriam utilizadas quitinases e celulases.

12

3- MUTAÇÃO

A informação genética dos microrganismos depende da ordem precisa dos

nucleotídeos presentes no DNA, e essa ordem não deve ser muito alterada num

indivíduo para se manter a estabilidade. No entanto, muitas vezes ocorrem

mudanças, as quais podem gerar fenótipos variados, contribuindo para o processo

evolutivo. A mutação em microrganismos é de extrema importância em pesquisa,

pois permite a obtenção de espécies variadas, as quais podem apresentar

características desejadas.

Pode haver mutações condicionais em que o fenótipo só é expresso quando

há uma determinada condição ambiental. Por exemplo, uma mutação letal em

Escherichia coli pode não ser expressa em baixas temperaturas, mas em elevadas

temperaturas observa-se a expressão do fenótipo.

As mutações bioquímicas acarretam na mudança da bioquímica da célula,

geralmente inativando uma via metabólica ou favorecendo outra. A inativação de

uma via pode formar um mutante auxotrófico, ou seja, o microrganismo não

consegue crescer em meios mínimos e necessita de complementação nutricional.

Alterações bioquímicas também podem gerar mutantes resistentes, os quais não

são inibidos pelos antibióticos usuais e possuem mecanismos de escape. Esses

tipos de mutantes são bem fáceis de isolar, e essa propriedade é bastante usada

pelos microbiologistas.

As mutações ocorridas podem envolver um cromossomo inteiro ou grande

parte dele, constituindo uma mutação cromossomal, ou pode ser também a nível de

DNA, sendo uma mutação de ácidos nucléicos.

Mutações que envolvem o rearranjo de grades porções do cromossomo são

chamadas de mutações cromossômicas (ou macrolesões), e podem ser deleções,

adições, inversões e substituições. Em eucariotos essas modificações podem ser

analisadas citologicamente fazendo um mapeamento do cromossomo. Já em

procariotos a percepção dessas modificações é mais complicada. As deleções

geralmente são irreversíveis, exceto em regiões que apresentam várias cópias. As

adições, que podem ser tanto duplicações de seqüências já existentes ou a inserção

de uma seqüência nova (mas geralmente sem sentido), podem ser revertidas no

processo de recombinação. As inversões e substituições são raras em procariotos,

sendo processos mais freqüentes em eucariotos.

13

As mutações que afetam somente pequenas porções de nucleotídeos são

chamadas de mutações de ponto (ou microlesões). Tem-se a substituição de pares,

a deleção de pequenas porções de pares de bases (causando uma mudança no

quadro de leitura dos codons).

A mudança do quadro de leitura para a esquerda ocorre quando há uma

adição de (3n+1) ou a deleção de (3n+2) pares de base, sendo que n=0,1,2,...

Mudanças de leitura para direita são resultados de deleções de (3n+1) ou adições

de (3n+2) pares de base. A adição ou deleção de exatamente 3n pares de base não

irá alterar o quadro de leitura, mas pode produzir um fenótipo alterado.

3.1- MUTAÇÃO ESPONTÂNEA

Antigamente acreditava-se que as mutações eram originadas como processo

de adaptação ao ambiente, como, por exemplo, na presença de antibiótico

aparecem organismos resistentes a ele. Mas eles não sofreram mutação devido ao

antibiótico, mas sim organismos já mutados foram somente selecionados. Hoje em

dia sabe-se que os mutantes podem ser gerados aleatoriante na natureza e são

selecionados através das pressões ambientais presentes.

Tabela 2- Taxa de mutação espontânea em locus específicos para diferentes

espécies

Fonte: REHM & REED, 1993.

14

Todos os organismos sofrem mutações espontâneas através de vários

mecanismos. Isso ocorre devido a agentes físicos e químicos o ambiente em que as

células geralmente se encontram. Elas também podem ocorrer devido à erros de

reparos do DNA após a replicação. Por exemplo, a taxa de erro de reparo após a

replicação do cromossomo de E. coli é de 1 a cada 1010. A taxa de mutação

espontânea dependerá do locus do gene e da espécie, como mostra a Tabela 2.

3.2- MUTAÇÃO INDUZIDA

A demonstração da mutação induzida foi feita pela primeira vez em moscas

do gênero Drosophila por Muller (1927) usando raios-X. A partir desse fato, vários

estudos começaram a ser feitos para demonstrar o efeito mutagênico de radiações

ionizantes. A primeira indução de mutação com agentes químicos foi feita em 1946

por Auerbach e Robson, que utilizaram mostarda nitrogenada em Drosophila. A

partir e então vários estudos foram feitos para detectar agentes físicos e químicos

com ação mutagênica.

Dependendo do agente mutagênico utilizado obtém-se um tipo de mutação

em maior quantidade. A dose do agente também influencia o aparecimento de

determinadas mutações. Através da combinação desses dois fatores pode-se fazer

uma mutação dirigida no microrganismo (Tabela 3). No entanto, a determinação

deles é difícil e seu estudo é inviável na procura de determinado mutante.

Tabela 3- Freqüência de mutação em Neurospora obtida com vários agentes

mutagênicos

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

15

O estudo dos agentes mutagenicos pode ser feito em cultivo de células

humanas observando a substituição de aminoácidos, estrutura terciária, e dano

funcional em algumas das proteínas mais estudadas, como a hemoglobina e outras

proteínas do sangue. No entanto, hoje em dia existe um grande número de modelos

em bactérias e vírus disponíveis.

3.2.1- Agentes físicos

Um dos agentes físicos que provocam mutações é a radiação, a qual pode

ser de duas formas: ionizante e excitante. A radiação ionizante consiste nos raios-X,

alfa, beta e gama. Eles atuam na valência química, retirando elétrons. A taxa de

mutação é geralmente proporcional à dosagem de irradiação (Figura 5). As

radiações ionizantes são conhecidas por produzirem macrolesões em cromossomos

de eucariotos.

Figura 5- Aumento da mutação com o aumento da dose de raios-X

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

16

A outra forma de radiação é a excitantes, que consiste no aumento do nível

de energia do átomo, tornando-o menos estável. O exemplo típico é a ultravioleta

que provoca dímeros de pirimidina através de ligações covalentes. Os estudos da

mutagenses por ultravioleta também revelaram que a luz também tem um papel no

reparo de algumas lesões, como será discutido mais adiante.

A luz ultravioleta (UV) induz mutações de mudança de quadro e leitura e

substituição de pares de bases (comumente GCAT ou transições CT) em vários

microrganismos como bacteriófogos T4 e S1, E. coli e Neurospora. Deleções

também são induzidas por essa forma em bactérias, mas não em bacteriófagos T4.

Essa radiação produz dímeros de ciclobutano de pirimidina, o fotoproduto 6-4,

alguns outros tipos de dímeros de pirimidina, dihidrotimina, hidrato de citosina,

ligação cruzada entre cadeias complementares, ligação cruzada entre DNA-proteína

mediada por cisteína, entre outros produtos. Os dímeros de pirimidina são

responsáveis principalmente nas mutações de mudança no quadro de leitura,

enquanto o hitrato de citosina gera mais transições de CT. O único desses danos

que pode ser reparado é o dímero de pirimidina através da fotoreativação.

Figura 6- Anel ciclobutano de pirimidina e o fotoproduto 6-4

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

Não só a radiação UV pode causar danos, mas também a luz visível pode ser

mutagênica, chamada mutagenese fotodinâmica. A luz visível pode geral vários

fotoprodutos, mas a sua ação pode ser potencializada com a utilização de corantes

como azul de metileno, tiopironina, e psoraleno. Nesse método há a formação de

duas classes de produtos. Os corantes azul de metileno e tiopironina irão fazer uma

17

degradação oxidativa da guanina, podem raramente reagir também com a timina. Já

o psoraleno irá reagir com nucleotídeos sem a necessidade do oxigênio, formando

dímeros de ciclobutano de pirimindina.

Outro fator físico capaz de gerar mutações é o calor. Elevadas temperaturas e

temperaturas amenas em pH baixo podem ser altamente mutagênicos. Há a

substituição de pares de base, mas o mecanismo de ação específico é

desconhecido.

3.2.2- Agentes químicos

Muitos agentes químicos são capazes de induzir transição de bases, como as

bases análogas: 5-bromouracil e 2-aminopurina. O 5-fluoruracil pode ser utilizado na

substituição de bases em RNA de vírus.

A substituição de bases pode gerar transições ou transversões. As transições

consistem na mudança de uma base por outra da mesma categoria química, ou

seja, uma purina é substituída por outra purina ou uma pirimidina é substituída por

outra pirimidina. Já na transversão acontece o oposto, ou seja, a pirimidina é

substituída por purina e vice-versa (Figura7).

Figura 7- Transições e transversões

Fonte: figura do autor.

Cada uma das bases nitrogenadas presentes no DNA pode se apresentar de

diferentes formas isômeras chamadas de tautômeros. A diferença entre as formas

tautoméricas keto, imino ou enol são somente a posição dos átomos e a ligação

entre eles. A forma keto é a que predomina no DNA normalmente e com ela

acontece o pareamento adequado das bases. Já as formas imino e enol promovem

um pareamento errôneo das bases, como mostra a Figura 8.

18

Figura 8- Pareamento correto das formas keto e incorreto das formas imino e enol

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

Outra forma de ocorrer mal pareamento das bases é com a utilização de 5-

bromouracil, que é um análogo da timina (Figura 9). Seu princípio de ação

mutagenico é através da enolização e ionização. O átomo de bromo presente no

lugar do grupo CH3 da timina não consegue formar pontes de hidrogênio durante o

pareamento, portanto a forma keto do 5-bromouracil irá parear normalmente com a

adenina. No entanto a presença do bromo altera a distribuição dos elétrons no anel

da base, provocando uma mudança para a forma enol ou a forma ionizada. Essas

duas formas pareiam com a guanina, causando uma transição durante a replicação.

Figura 9- Ação do 5-bromouracil

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

19

Outro agente mutagênico é a 2-aminopurina, que é análogo da adenina que

em estado normal pareia com timina (Figura 10). No entanto, quando a 2-

aminopurina sofre uma protonação ela pareia com citosina, gerando na replicação

transições de bases.

Figura 10- Ação da 2-aminopurina

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

Outros agentes não causam mutação através de sua inserção no DNA, mas

sim através da modificação da base já presente. Esse é o mecanismo de ação de

agentes alquilantes como o etilmetanosulfonato (EMS) e a nitrosoguanidina (NG),

que adicionam um grupo alquil (um grupo etil no caso do EMS e um grupo metil no

caso da NG) a qualquer uma das quatro bases nitrogenadas. No entanto, é mais

provável que ocorra uma mutação quando o grupo alquil é adicionado no oxigênio

da posição 6 da guanina, formando a O-6-alquilguanina que irá parear com a timina,

causando uma transição (Figura 11). Já a alquilação de uma timina resultará no mal

pareamento de com uma guanina.

Figura 11- Mal pareamentos devido à alquilação

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

Existem também agentes que atuam intercalando-se no DNA, como a

proflavina, e acridina alaranjada. Esses compostos são achatados de modo que

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podem se intercalar entre duas bases na dupla hélice, como mostra a Figura 12.

Isso causará a inserção de um par de nucleotídeos ou uma deleção.

Figura 12- Ação de agentes intercalantes

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

A aflotoxina também são mutagenicas, pois ela une-se à guanina na posição

N-7, gerando uma quebra da ligação entre a base nitrogenada e o açúcar e um sítio

apurínico, como mostra a Figura 13. O mecanismo de reparo muitas vezes inserem

um resíduo de adenina na fita complementar do sítio apurínico, gerando futuramente

uma transversão G-CT-A.

Figura 13- Ação da aflotoxina

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

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Espécies reativas de oxigênio chamadas de radicais livres, como os radicais

superóxidos, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas, podem causar danos

oxidativos no DNA, resultando em mutação. A Figura 14 mostra dois produtos da

oxidação do DNA, a timidina glicol e a 8-oxo-7-hidrodeoxiguanosina (8-oxo-dG). A 8-

oxo-dG geralmente pareia com adenina, causando uma transversão.

Figura 14- Bases nitrogenadas que sofreram oxidação

Fonte: GRIFFITHS et al., 2004.

Outros dois agentes químicos mutagênicos são o ácido nitroso (HNO2) e a

hidroxilamina ((NH4)OH) atuam provocando substituição de bases. O ácido nitroso é

principalmente indicado para indução de mutação em leveduras.

3.3- MECANISMOS DE REPARO

Um fator importante para a propagação de uma mutação são os mecanismos

de reparo do DNA presentes na célula, os quais podem ser de dois tipos: aqueles

que restauram a seqüência de bases do DNA com fidelidade e aqueles que corrigem

o dano, mas ao fazer isso podem gerar mudanças na seqüência de bases.

Dependendo da célula será utilizado um mecanismo ou outro, e isso irá afetar o

rendimento da produção de mutantes durante a ação de um agente mutagênico. Os

mecanismos de reparo têm sido estudados principalmente em E. coli, a qual

apresenta mecanismos similares a de outros organismos.

O reparo de dímeros de timinas formados após a irradiação de luz ultravioleta

pode envolver quatro processos enzimáticos diferentes. O primeiro deles é a

fotoreativação, que consiste na quebra dos dímeros pela enzima fotoliase na

presença de luz. A enzima reconhece o local de dano e forma um complexo enzima-

DNA que absorve luz visível e utiliza essa energia para quebrar a ligação covalente

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