MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

MELHORAMENTO DE MICRORGANISMOS - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de . Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo do melhoramento de microrganismos de interesse industrial, sobrevivência e seleção de mutantes, DNA recombinante.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

22

que une o dímero. Esse é o único mecanismo que necessita de luz, os outros três

podem ser realizados no escuro e podem ser aplicados em outros tipos de mutação,

não somente na induzida por UV.

A excisão de pares consiste no reconhecimento da área danificada, inserção

de endonucleases, excisão de pequenos pedaços do DNA danificados de somente

uma fita do DNA, nova síntese da seqüência retirada, e finalmente ligação da ponta

livre. Esse mecanismo envolve quatro genes, os quais foram identificados em E. coli

e denominados uvrA, uvrB, uvrC e uvrD (sendo que uvr significa resistência à

ultravioleta, devido ao estudo realizado em E. coli resistentes a essa radiação).

Esses genes produzem as endonucleases necessárias para a excisão do DNA

danificado.

Pode ocorrer a reparação por excisão de DNA alquilado e desaminado. No

caso da alquilação, uma N-glicosilase reconhece a presença de 3-metiladeninas no

DNA e é feito um corte entre a base nitrogenada e a desoxirribose, formando um

sítio apurínico. Esse local é então reconhecido por endonucleases AP especiais (AP:

sítio apurínico ou apirimidínico) que remove uma pequena seqüência e depois há

uma nova síntese desse trecho. A formação de 7-metilguaninas não é reparada, pois

essa alquilação é tolerada pela maioria das células, e essa alteração não é

mutagênica. No reparo de DNA desaminado, são encontradas em várias bactérias

enzimas como a uracil glicosilase e a hipoxantina glicosidase.

Os dois mecanismos apresentados são realizados antes da replicação do

material danificado. Os próximos mecanismos acontecem após ou durante a

duplicação do material danificado. No processo de reparação por recombinação, a

fita complementar não-danificada é utilizada como molde na substituição do

fragmento lesado.

O último mecanismo seria o reparo pelo mecanismo de SOS da célula.

Quando um defeito severo o bastante a ponto de impedir a síntese de DNA está

presente, são ativados os genes SOS e suas enzimas são sintetizadas como, por

exemplo, endonucleases de excisão e helicases. Os dímeros de pirimidinas

constituem um exemplo típico desse tipo de dano. Quando a forquilha de replicação

encontra um dímero, a síntese pára e só é reiniciada a alguma distância além do

dímero, ficando uma lacuna no DNA na qual a enzima de recombinação RecA se

liga. Essa ligação ativa em RecA uma atividade enzimática completamente

independente da recombinação: ela destrói o repressor dos genes SOS (repressor

23

LexA). Dessa maneira, a proteína RecA promove reparação do material genético de

duas formas: por recombinação, com troca das fitas, e por indução dos genes SOS.

3.4- SOBREVIVÊNCIA E SELEÇAO DE MUTANTES

As mutações são em sua maioria deletérias e não aumentam o rendimento de

produção de determinado produto, mas há também uma minoria que apresenta uma

produtividade muito maior que a parental. Essa minoria das células deve ser

separada daquelas que produzem em pequenas quantidades através de meios de

cultivo que promovam o enriquecimento do microrganismo dependendo de suas

características.

O agente mutagênico às vezes pode ser muito violento, e é necessário fazer

uma curva de sobrevivência dos mutantes em variadas doses do agente. Essa

relação é geralmente exponencial, e depende da quantidade de vezes em que o alvo

sofre ação do agente. Em melhoramentos realizados em indústrias deve-se escolher

uma condição que forneça alta freqüência de mutantes por células sobreviventes.

Para achar o ponto exato são construídas curvas de mutantes efetivos por total de

células sobreviventes. KAVA-CORDEIRO, LUNA-ALVES-LIMA e AZEVEDO (1995)

estudaram a taxa de sobrevivência de do fungo Metarhizium anisopliae quando

submetido a diferentes agentes mutagênicos, como a radiação gama, a luz

ultravioleta e o ácido nitroso. Após análise dos sobreviventes, buscou-se aqueles

que eram sobreviventes para determinar a taxa de mutação.

Tabela 4- Porcentagem de sobreviventes de Metarhizium anisopliae

Fonte: KAVA-CORDEIRO, LUNA-ALVES-LIMA e AZEVEDO, 1995.

24

O processo de seleção de mutantes é muito semelhante ao isolamento de

microrganismos do meio ambiente. Muitas vezes o tipo de mutação ocorrida

possibilita a visualização direta da característica, como, por exemplo, nas mutações

ocorridas na morfologia, que podem ser diferenciadas através de uma simples

observação das células ou do tipo de colônia. A detecção de mutantes auxotróficos

pode ser feita através da observação de não-crescimento em meio mínimo, mas

ocorre o crescimento em meio complementado.

Outras vezes é necessário conhecer o mecanismo de síntese e controle do

produto para poder-se elaborar um mecanismo de isolamento. Isso ocorre

geralmente com produtos metabólicos primários, e a seleção pode ser feita através

do ajuste das pressões seletivas.

4- TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Através da tecnologia do DNA recombinante foi possível aumentar a

quantidade de produtos resultantes da fermentação realizada por microrganismos.

Por essa técnica consegue-se induzir em um microrganismo a produção de uma

proteína heteróloga que originalmente pertencia a outro organismo. Alguns

exemplos bem sucedidos são a produção de insulina humana, de hormônio do

crescimento e de interferon pela bactéria Escherichia coli.

4.1- PROBLEMAS

Tenta-se geralmente introduzir em bactérias como E. coli DNA de organismos

taxonomicamente distantes, fazendo plasmídeos híbridos, mas geralmente a sua

expressão não se dá de forma adequada. Isso acontece porque existem algumas

barreiras para a replicação de material genético proveniente de outras fontes, as

quais podem ser divididas em seis grupos: barreiras de nucleases, barreira da

unidade de replicação, barreira da transcrição, barreira da tradução, e barreira de

proteinases. A Tabela 5 mostra alguns trabalhos publicados que evidenciam as

barreiras de utilização de material genético exógeno por um microrganismo.

25

Tabela 5- Barreiras entre as espécies

Fonte: SAKAGUCHI & OKANISHI, 1980.

As barreiras de nuclease envolvem a degradação do material genético

introduzido no citoplasma bacteriano, no meio de cultivo ou na superfície da célula.

Bactérias como B. subtilis, Actinomycetales e Clostridium, e também muitos fungos

excretam nucleases no meio de cultivo, portanto, não é possível fazer uma

transformação desses organismos sem algum ajuste prévio. Algumas células

também apresentam nucleases em sua membrana, como a DNAse I em E. coli, para

impedir a entrada de material genético estranho a célula.

Uma vez que se consegue introduzir o material genético dentro da célula,

ainda há o problema da degradação por nucleases intracelulares. Endonucleases de

26

restrição previnem a invasão de DNA exógeno, permitindo somente a propagação

do material original da célula.

Para contornar esse problema pode-se utilizar cepas mutantes de bactéria

deficientes em algumas enzimas de restrição, como por exemplo a E. coli mutante

para recB e C, que são dois genes essenciais para a produção de exonucleases.

A barreira de replicação consiste no complexo mecanismo de duplicação do

material genético. Conseguindo-se introduzir o material na célula, é necessário fazer

com que ele se propague para as outras células filhas. No entanto, a maquinaria de

replicação envolve várias enzimas, e é necessário que elas reconheçam regiões

específicas da seqüência genética. Isso inclui seqüências na origem de replicação

do DNA que devem interagir com enzimas como DNA polimerases e girases.

Com relação à barreira de transcrição, existe a especificidade de promotores

e regiões operadoras. Essas seqüências podem variar de um organismo para outro,

afetando a força com que as RNA polimerases e outras proteínas regulatórias

interagem com o DNA. Por exemplo, o DNA de fago T7 possui uma seqüência

gênica que só é reconhecida pela sua própria RNA polimerase. Quando se compara

o sistema de atuação de RNA polimerases de microrganismos com o de eucariotos

superiores, as barreiras são bem maiores, pois a forma com que a RNA polimerase

une-se ao DNA varia, e a inserção do material genético de um em outro podem

gerar somente interações fracas. Também existe o problema do reconhecimento do

códon de terminação, o qual quando não reconhecido irá gerar proteínas inativas.

A barreira de tradução é provavelmente um dos maiores. Primeiramente tem-

se a diferença de eucariotos possuírem seqüências de íntrons e éxons e sistemas

específicos de modificação do RNA pós-transcricional, enquanto os procariotos não

possuem íntrons e, portanto, não fazem modificações pós-trancricionais no RNA. As

enzimas do spliceossomo não estão presentes em procariotos, e a introdução direta

de genes eucarióticos irá gerar proteínas não-funcionais Outro obstáculo seria a

necessidade da subunidade ribossomal 16S interagir com uma seqüência específica

do mRNA para que a tradução se inicie. Os fatores de iniciação também variam de

procariotos para eucariotos, e essas diferenças podem prejudicar o correto

funcionamento da maquinaria de tradução. Deve-se lembrar também que há uma

preferência de utilização de determinados codons dependendo do organismo

(fenômeno chamado também de codon usage bias). Como o código genético é

degenerado e um mesmo aminoácido pode corresponder até a três codons

27

diferentes, os organismos se desenvolveram utilizando preferencialmente alguns

deles. O codon usage reflete o pool de tRNA disponíveis no citoplasma da célula,

pois assim obtêm-se uma maior velocidade e precisão durante a tradução.

Após da tradução, as proteinases tornam-se uma outra barreira. Existem

várias proteinases intracelulares que são inativas para proteínas na conformação

correta, mas ativas para conformações incorretas ou estranhas à célula. Isso pode

ocorrer freqüentemente com proteínas oriundas de DNA exógeno, pois muitas vezes

ocorre um dobramento incorreto devido à falta de mecanismos pós-traducionais

(como glicosilação) nas células bacterianas. A falta desses mecanismos pode gerar

também proteínas não-funcionais.

4.2- VETORES

A introdução do material exógeno numa célula hospedeira é feita através de

vetores de expressão, ou vetores de clonagem. Ele pode ser de vários tipos, como

plasmídeos, fagos, cosmídeos, cromossomos artificiais de leveduras, entre outros.

Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA dupla fita extra-

cromossomais que variam de 5 a 400 kilobases. Um bom plasmídeo deve possuir

uma origem de replicação (que é a seqüência de DNA que permite a replicação do

vetor seja na célula hospedeira), apresentar dois ou mais sítios de clivagem para

endonucleases de restrição (como o sítio múltiplo de clonagem, onde geralmente é

incorporado o gene exógeno), possuir um gene que codifica um produto que

distingue a célula transformada da célula não transformada (como, por exemplo, a

resistência a algum antibiótico).

Após a construção de um plasmídeo através do uso de enzimas de restrição e

ligação dos pedaços de DNA, deve-se introduzir o plasmídeo na célula hospedeira

através de técnicas de transformação.

Muitas vezes nas bactérias que receberam plasmídeos ocorre uma

desvantagem seletiva da célula portadora do gene exógeno. Um microrganismo que

recebeu um material genético de outra fonte pode não conseguir predominar num

meio de cultura porque eles são forçados a produzir substâncias desnecessárias ao

seu metabolismo em grande quantidade, e isso pode acarretar na supressão da

produção de substâncias necessárias para o crescimento normal, gerando uma

desvantagem seletiva.

28

Outro tipo de vetor bastante utilizado é o bacteriófago λ, o qual comporta-se

como um vírus da E.coli. O bacteriófago injeta seu DNA na bactéria hospedeira para

que ocorra a sua multiplicação. Os genes do fago podem seguir dois caminhos

dentro da célula: o ciclo lítico, em que o DNA do fago permanece na bactéria como

uma molécula independente, havendo a ativação de alguns genes do fago e

replicação ativa do DNA produção de novos fagos; ou o ciclo lisogênico, no qual o

DNA do fago é integrado no cromossomo da bactéria passando a ser chamado

profago e todos os genes do profago estão inativos com excessão do gene que

produz uma proteína repressora (a multiplicação do material genético do fago

juntamente com o da bactéria, e é transpassado para as células filhas

passivamente). A escolha pelo ciclo lítico ou lisogênico acontece de acordo com as

condições do meio de cultivo, os fatores intracelulares da célula hospedeira e dos

genes que o bacteriófago carrega. Por exemplo, o fago λ na bactéria E.coli em

meios ricos em nutrientes segue o ciclo lítico, enquanto que em condições de

poucos nutrientes há a preferência pelo ciclo lisogênico.

Durante o ciclo lítico, os genes envolvidos nos processos do ciclo lisogênico são

dispensáveis e no seu lugar podem ser inseridos outros fragmentos de DNA que se

deseja clonar. Em comparação com o processo de transformação bacteriana, a

clonagem com bacteriófago é muito mais eficiente pois os bacteriófagos

empacotados sempre irão infectar a bactéria hospedeira, enquanto a eficiência de

transformação é muito baixa. A desvantagem do fago λ é o tamanho da seqüência

clonada, a qual não ultrapassa cerca de 15 kb.

Sempre que um bacteriófago  se desenvolve numa estirpe de Escherichia

coli C, os fagos resultantes da lise deste hospedeiro multiplicam-se muito mal em

outra estirpe, de tipo K. Diz-se que o fago é "restrito" pela segunda estirpe

bacteriana. Por outro lado, os fagos que escaparam à restrição são capazes de

crescer normalmente se forem utilizados para re-infectar a estirpe K. No entanto, se

estes mesmos fagos passarem primeiro por E. coli C, ficam de novo restritos por E.

coli K. Portanto, a eficácia com a qual um fago se multiplica num hospedeiro

depende da estirpe na qual ele se multiplicou anteriormente. Esta modificação não

hereditária, conferida ao fago pela segunda estirpe (K) e que lhe permite voltar a

multiplicar-se nesta estirpe sem ser de novo restrito, chama-se modificação.

Os fagos restritos adsorvem-se sobre os hospedeiros restritores e injetam o

seu DNA normalmente. No entanto, este DNA é rapidamente degradado depois da

29

injecção. A enzima responsável por esta degradação é uma endonuclease, também

chamada endonuclease de restrição ou enzima de restrição. O hospedeiro restritor

tem evidentemente que proteger o seu DNA dos efeitos das enzimas de restrição

que ele próprio contém; esta proteção é assegurada pela modificação do DNA. Mais

precisamente, as modificações resultam da metilação (por metilases) de certas

bases num número reduzido de locais do DNA, que constituem as seqüências de

reconhecimento para a enzima de restrição. É, pois, compreensível a razão pela

qual um fago que escapa à restrição num dado hospedeiro, pode em seguida re-

infectar eficazmente o mesmo hospedeiro: o DNA do fago terá se replicado em

presença da metilase de modificação e será protegido, assim como o DNA do

hospedeiro, contra os efeitos de restrição.

Para clonagem de genes maiores pode-se utilizar cosmídeos, que suportam

seqüências de 35 à 40kb. Cosmídeos são plasmídeos que contém um fragmento de

DNA do fago λ. Estes cosmídeos podem ser usados como veículos de clonagem

molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro, reconstituindo a

estrutura do fago, o qual infectará uma célula hospedeira. Dentro da célula o DNA do

cosmídeo circulariza-se e replica-se como se fosse um plasmídeo normal, sem haver

expressão de nenhum dos genes do fago. A seleção das células infectadas ocorre

como na seleção de plasmídeos, através da resistência a um antibiótico.

Em leveduras o processo de clonagem pode ser realizado através de

cromossomos artificiais denominados YACs (Yeast Artificial Chromosome). Eles

contêm seqüências centroméricas e seqüências teloméricas, permitindo a replicação

dessas moléculas dentro da levedura exatamente como nos outros cromossomos.

Devido ao tamanho maior, nesses vetores é possível clonar seqüências maiores de

DNA.

4.3- PRODUÇÃO E DETECÇÃO DE CLONES RECOMBINANTES

A produção de organismos recombinates requer um DNA que se deseja

expressar em outro organismo, um vector de clonagem adequado, enzimas de

restrição, DNA ligase, e as células procariotas ou eucariotas que servem de

hospedeiro. Depois da introdução no hospedeiro, as moléculas recombinantes têm

que ser isoladas e caracterizadas. Foi através deste processo de caracterização,

30

que o conhecimento do gene foi progredindo. O processo de clonagem em si, só

fornece um meio de isolar e de identificar rapidamente os genes de interesse.

Já foram discutidos alguns exemplos de vetores anteriormente, e agora será

analisado o processo de junção do DNA inserido com o vetor. Para que isso ocorra,

os dois segmentos de DNA devem ter extremidades complementares, e isso é

possível através da utilização de enzimas de restrição. Estas enzimas já foram

isoladas a partir de mais de 200 estirpes bacterianas representando quase todos os

grupos de procariotas. Esta diversidade de enzimas torna indispensável a utilização

duma nomenclatura apropriada. Cada enzima é representada por um código de 3

letras derivado do nome do género e da espécie da bactéria donde a enzima foi

isolada. Hae por exemplo, significa que a enzima foi isolada de Haemophilus

aegyptiens. As seqüências devem então ser ligadas através da ação da ligase, a

qual é extraída de E.coli ou de células infectadas pelo fago T4.

As moléculas de DNA recombinante formadas in vitro por ligação só

começam a ter interesse depois de introduzidas num hospedeiro biológico. De fato,

a utilização das novas moléculas de DNA formadas por engenharia genética

depende da sua separação e propagação. Por isso, é necessário introduzi-las em

células bacterianas, por exemplo, de maneira a poderem replicar-se e serem

preservadas e recuperadas facilmente. Um meio de o conseguir é recorrer, como

vimos, a vetores particulares recombinados com o gene que nos interessa, para o

introduzir num hospedeiro biológico em geral um colibacilo.

Uma série de métodos foram desenvolvidos para assegurar a introdução

eficaz de DNA no hospedeiro. Sabe-se que o DNA exógeno pode entrar nas

bactérias naturalmente. Estas passam por um estado de competência que as torna

aptas para aceitar o DNA exógeno, fixando o DNA numa forma resistente às

nucleases. O estado de competência pode ser reproduzido artificialmente pela

exposição das bactérias ao cloreto de cálcio antes da adição do DNA exógeno

(plasmídeo recombinante).

Para manter o DNA recombinante nas células transformadas e evitar

problemas de degradação pelo sistema hospedeiro, as bactérias receptoras são

geralmente tornadas deficientes para o sistema de restrição e por vezes também

para o sistema de modificação. A proliferação permite a obtenção de bilhões de

cópias idênticas do fragmento clonado.

31

Após a inserção e expressão do gene de interesse, é necessário identificar os

clones que o contém, e isso depende da sensibilidade e especificidade do sistema

de detecção. Muitos métodos utilizam sondas radioativas de grande especificidade,

que contêm seqüências complementares ao DNA de interesse. A identificação pode

ser feita obtendo-se uma réplica das colônias em um filtro, as quais são

posteriormente lisadas, e o DNA é fixado ao filtro e hibridizado com uma sonda. A

detecção pode ser feita em seguida por autoradiografía.

Em outros casos, pode-se utilizar um vetor de expressão dentro do qual se

insere o DNA. No caso de lactose (lac), pode-se inserir o fragmento de DNA dentro

do gene lac Z, obtendo-se, assim, uma proteína de fusão da β-galactosidade. Se a

proteína de interesse para produção é tóxica para a célula, isto se resolve

empregando células que elaboram repressores. Quando a concentração celular do

cultivo é elevada, induz-se à expressão com isopropil-β-D-tiogalactopiranosido

(IPTG), detectando-se a presença da proteína de interesse por métodos

imunológicos. Finalmente, para aumentar a estabilidade da proteína a ser produzida,

a qual contribui a estrutura da β-galactosidase, usam-se hospedeiros deficientes em

proteases.

Pode-se detectar clones que contêm a seqüência de DNA desejada também

através de técnicas de engenharia genética. A Hibridação in situ entre o DNA dos

clones recombinantes e uma sonda de DNA radioactiva consiste em uma sonda

radioativa (como um cDNA purificado, um RNA mensageiro purificado ou um

oligonucleotídeo sintético) marcadas in vitro com 32

P por nick translation (cDNA) ou

por quinação (oligonucleotídeo de síntese, RNA poli (A) + ) que irá se ligar ao DNA da

bactéria se o a sequencia também estiver presente.

No método de seleção do mensageiro específico por hibridação com o DNA

recombinante e tradução in vitro, o DNA plasmídico dos clones é isolado e em

seguida fixo num filtro de nitrocelulose. Em condições apropriadas de temperatura e

de força iônica, hibrida-se com o RNA mensageiro total que serviu para a síntese do

DNA complementar. Só o RNA mensageiro, que possui seqüências complementares

das do DNA imobilizado no suporte, permanecerá associado a este. Pode-se assim

isolar este RNA mensageiro, extrai-lo do suporte e traduzi-lo num sistema de

tradução in vitro. O produto codificado pelo RNA mensageiro é em seguida

32

identificado por imunoprecipitação com um anticorpo dirigido contra a proteína cujo

mensageiro foi clonado.

A técnica de Southern Blotting serve para localizar seqüências particulares

de DNA nos fragmentos de restrição, utiliza-se o método desenvolvido por Southern.

O DNA é clivado em fragmentos, que são separados em gel de agarose e em

seguida transferidos para uma folha de nitrato de celulose. O filtro é depois hibridado

com uma sonda radioativa apropriada. A autorradiografia da folha de nitrocelulose,

depois de lavada, revela fragmentos contendo sequências complementares das da

sonda utilizada.

Uma técnica análoga existe para a caracterização do RNA (chamada neste

caso Northern blotting): os RNA totais ou mensageiros são separados em gel de

agarose e depois transferidos para um suporte apropriado (nitrocelulose ou papel

activado). A hibridação com uma sonda marcada permite em seguida conhecer o

número e o comprimento dos RNA mensageiros complementares da sonda.

4.4- REGULAMENTAÇÃO SOBRE OGM

A utilização de microrganismos é bem controlada, e existem regras como a

GILSP (Good Industrial Large-Scale Practice) que estipula que o organismo que irá

receber a seqüência gênica exógena deverá ser não patogênico, não deve conter

elementos patogênicos como vírus, fagos e plasmídios, deve ter uma longa história

de uso seguro na indústria ou ter limitações ambientais de crescimento (ou seja, ele

necessita de uma condição ambiental controlada industrialmente para crescer, caso

contrário ela morrerá). No caso de ser um organismo patogênico ele deve ser

manuseado com muita cautela e deve ser conhecido um tratamento eficiente para a

doença caso haja algum escape.

O local de manipulação desses microrganismos também deve ser observado

de acordo com as características por ele apresentadas. Equipamentos, técnicas de

operação e local adequado para manipulação de determinados microrganismos

estão presentes em “Guideline for Industrial Application of Recombinant DNA

Technology”, que foi publicado pelo ministério de troca internacional e indústria do

Japão.

33

No Brasil, a lei federal número 11.105 de março de 2005 (mostrada em parte

abaixo) estabelece normas de segurança, e mecanismos de fiscalização de

organismos geneticamente modificados (OGM).

LEI Nº 11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005

Art. 1o Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, tendo como diretrizes o estímulo ao avanço científico na área de biossegurança e biotecnologia, a proteção à vida e à saúde humana, animal e vegetal, e a observância do princípio da precaução para a proteção do meio ambiente.

§ 1o Para os fins desta Lei, considera-se atividade de pesquisa a realizada em laboratório, regime de contenção ou campo, como parte do processo de obtenção de OGM e seus derivados ou de avaliação da biossegurança de OGM e seus derivados, o que engloba, no âmbito experimental, a construção, o cultivo, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a liberação no meio ambiente e o descarte de OGM e seus derivados.

§ 2o Para os fins desta Lei, considera-se atividade de uso comercial de OGM e seus derivados a que não se enquadra como atividade de pesquisa, e que trata do cultivo, da produção, da manipulação, do transporte, da transferência, da comercialização, da importação, da exportação, do armazenamento, do consumo, da liberação e do descarte de OGM e seus derivados para fins comerciais.

Art. 2o As atividades e projetos que envolvam OGM e seus derivados, relacionados ao ensino com manipulação de organismos vivos, à pesquisa científica, ao desenvolvimento tecnológico e à produção industrial ficam restritos ao âmbito de entidades de direito público ou privado, que serão responsáveis pela obediência aos preceitos desta Lei e de sua regulamentação, bem como pelas eventuais conseqüências ou efeitos advindos de seu descumprimento.

§ 1o Para os fins desta Lei, consideram-se atividades e projetos no âmbito de entidade os conduzidos em instalações próprias ou sob a responsabilidade administrativa, técnica ou científica da entidade.

§ 2o As atividades e projetos de que trata este artigo são vedados a pessoas físicas em atuação autônoma e independente, ainda que mantenham vínculo empregatício ou qualquer outro com pessoas jurídicas.

§ 3o Os interessados em realizar atividade prevista nesta Lei deverão requerer autorização à Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio, que se manifestará no prazo fixado em regulamento.

34

§ 4o As organizações públicas e privadas, nacionais, estrangeiras ou internacionais, financiadoras ou patrocinadoras de atividades ou de projetos referidos no caput deste artigo devem exigir a apresentação de Certificado de Qualidade em Biossegurança, emitido pela CTNBio, sob pena de se tornarem co- responsáveis pelos eventuais efeitos decorrentes do descumprimento desta Lei ou de sua regulamentação.

Art. 3o Para os efeitos desta Lei, considera-se:

I – organismo: toda entidade biológica capaz de reproduzir ou transferir material genético, inclusive vírus e outras classes que venham a ser conhecidas;

II – ácido desoxirribonucléico - ADN, ácido ribonucléico - ARN: material genético que contém informações determinantes dos caracteres hereditários transmissíveis à descendência;

III – moléculas de ADN/ARN recombinante: as moléculas manipuladas fora das células vivas mediante a modificação de segmentos de ADN/ARN natural ou sintético e que possam multiplicar-se em uma célula viva, ou ainda as moléculas de ADN/ARN resultantes dessa multiplicação; consideram-se também os segmentos de ADN/ARN sintéticos equivalentes aos de ADN/ARN natural;

IV – engenharia genética: atividade de produção e manipulação de moléculas de ADN/ARN recombinante;

V – organismo geneticamente modificado - OGM: organismo cujo material genético – ADN/ARN tenha sido modificado por qualquer técnica de engenharia genética;

VI – derivado de OGM: produto obtido de OGM e que não possua capacidade autônoma de replicação ou que não contenha forma viável de OGM;

VII – célula germinal humana: célula-mãe responsável pela formação de gametas presentes nas glândulas sexuais femininas e masculinas e suas descendentes diretas em qualquer grau de ploidia;

VIII – clonagem: processo de reprodução assexuada, produzida artificialmente, baseada em um único patrimônio genético, com ou sem utilização de técnicas de engenharia genética;

IX – clonagem para fins reprodutivos: clonagem com a finalidade de obtenção de um indivíduo;

X – clonagem terapêutica: clonagem com a finalidade de produção de células- tronco embrionárias para utilização terapêutica;

XI – células-tronco embrionárias: células de embrião que apresentam a capacidade de se transformar em células de qualquer tecido de um organismo.

35

§ 1o Não se inclui na categoria de OGM o resultante de técnicas que impliquem a introdução direta, num organismo, de material hereditário, desde que não envolvam a utilização de moléculas de ADN/ARN recombinante ou OGM, inclusive fecundação in vitro, conjugação, transdução, transformação, indução poliplóide e qualquer outro processo natural.

§ 2o Não se inclui na categoria de derivado de OGM a substância pura, quimicamente definida, obtida por meio de processos biológicos e que não contenha OGM, proteína heteróloga ou ADN recombinante.

Art. 4o Esta Lei não se aplica quando a modificação genética for obtida por meio das seguintes técnicas, desde que não impliquem a utilização de OGM como receptor ou doador:

I – mutagênese;

II – formação e utilização de células somáticas de hibridoma animal;

III – fusão celular, inclusive a de protoplasma, de células vegetais, que possa ser produzida mediante métodos tradicionais de cultivo;

IV – autoclonagem de organismos não-patogênicos que se processe de maneira natural.

Art. 5o É permitida, para fins de pesquisa e terapia, a utilização de células- tronco embrionárias obtidas de embriões humanos produzidos por fertilização in vitro e não utilizados no respectivo procedimento, atendidas as seguintes condições:

I – sejam embriões inviáveis; ou

II – sejam embriões congelados há 3 (três) anos ou mais, na data da publicação desta Lei, ou que, já congelados na data da publicação desta Lei, depois de completarem 3 (três) anos, contados a partir da data de congelamento.

§ 1o Em qualquer caso, é necessário o consentimento dos genitores.

§ 2o Instituições de pesquisa e serviços de saúde que realizem pesquisa ou terapia com células-tronco embrionárias humanas deverão submeter seus projetos à apreciação e aprovação dos respectivos comitês de ética em pesquisa.

§ 3o É vedada a comercialização do material biológico a que se refere este artigo e sua prática implica o crime tipificado no art. 15 da Lei no 9.434, de 4 de fevereiro de 1997.

Art. 6o Fica proibido:

I – implementação de projeto relativo a OGM sem a manutenção de registro de seu acompanhamento individual;

36

II – engenharia genética em organismo vivo ou o manejo in vitro de ADN/ARN natural ou recombinante, realizado em desacordo com as normas previstas nesta Lei;

III – engenharia genética em célula germinal humana, zigoto humano e embrião humano;

IV – clonagem humana;

V – destruição ou descarte no meio ambiente de OGM e seus derivados em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio, pelos órgãos e entidades de registro e fiscalização, referidos no art. 16 desta Lei, e as constantes desta Lei e de sua regulamentação;

VI – liberação no meio ambiente de OGM ou seus derivados, no âmbito de atividades de pesquisa, sem a decisão técnica favorável da CTNBio e, nos casos de liberação comercial, sem o parecer técnico favorável da CTNBio, ou sem o licenciamento do órgão ou entidade ambiental responsável, quando a CTNBio considerar a atividade como potencialmente causadora de degradação ambiental, ou sem a aprovação do Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS, quando o processo tenha sido por ele avocado, na forma desta Lei e de sua regulamentação;

VII – a utilização, a comercialização, o registro, o patenteamento e o licenciamento de tecnologias genéticas de restrição do uso.

Parágrafo único. Para os efeitos desta Lei, entende-se por tecnologias genéticas de restrição do uso qualquer processo de intervenção humana para geração ou multiplicação de plantas geneticamente modificadas para produzir estruturas reprodutivas estéreis, bem como qualquer forma de manipulação genética que vise à ativação ou desativação de genes relacionados à fertilidade das plantas por indutores químicos externos.

Art. 7o São obrigatórias:

I – a investigação de acidentes ocorridos no curso de pesquisas e projetos na área de engenharia genética e o envio de relatório respectivo à autoridade competente no prazo máximo de 5 (cinco) dias a contar da data do evento;

II – a notificação imediata à CTNBio e às autoridades da saúde pública, da defesa agropecuária e do meio ambiente sobre acidente que possa provocar a disseminação de OGM e seus derivados;

III – a adoção de meios necessários para plenamente informar à CTNBio, às autoridades da saúde pública, do meio ambiente, da defesa agropecuária, à coletividade e aos demais empregados da instituição ou empresa sobre os riscos a que possam estar submetidos, bem como os procedimentos a serem tomados no caso de acidentes com OGM.”

37

5- EXEMPLOS DE MICRORGANISMOS MELHORADOS

Na produção de antibióticos o melhoramento dos fungos produtores foi de

extrema importância para o aumento da produtividade nessa indústria. Com relação

à produção de penicilina por Penicillium chrysogenum, a produção inicial era muito

baixa, com 2mg de antibiótico por litro de meio. Através de seleção das linhagens,

foram obtidas cepas com produção de 60mg/litro. A utilização de técnicas

mutagênicas propiciou um grande aumento da produção e das condições de cultivo,

chegando a 7g/litro. Atualmente, estima-se que as linhagens industriais de

Penicillium são capazes de produzir mais de 50g/litro, ou seja, houve um aumento

de 25.000 vezes na produtividade. Além da penicilina, vários outros antibióticos

tiveram a sua produção aumentada devido às técnicas de meloramento de

microrganismos.

A produção de ácidos orgânicos por fungos como Aspergillus niger, foi

também melhorada devido à manipulação genética. No laboratório do Setor de

Genética de Microrganismos do Instituto de Genética da Escola Superior de

Agricultura Luiz de Queiroz da USP, uma linhagem industrial utilizada para produção

de ácido cítrico em cultura de superfície foi melhorada através de técnicas de

mutação, seleção e fusão de protoplastos, obtendo-se um aumento na produção de

até 30% de ácido em relação à cultura original. Quando as linhagens melhoradas

foram levadas à indústria, ocorreram aumentos consideráveis na produção de ácido

cítrico.

No desenvolvimento de processos de produção de etanol, procura-se também

melhorar as linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizada. Cepas mais

produtivas, com características desejáveis para produção de etanol e com

monitoramento na indústria por técnicas de marcação molecular, foram

desenvolvidas em vários laboratórios. Por tecnologia do DNA recombinante, os

laboratórios de pesquisa das universidades de Brasília e da USP desenvolveram em

conjunto linhagens de leveduras contendo genes de amilases capazes de utilizar o

amido de mandioca ou batata-doce durante a fermentação. Essas leveduras

manipuladas geneticamente estão sendo aperfeiçoadas e poderão desempenhar um

importante papel na produção de etanol.

Na fabricação do vinho também se tem utilizado a fusão de protoplastos para

o melhoramento das cepas. Os híbridos entre as leveduras Saccharomyces

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cerevisiae e Schizossaccharomyces pombe reunem características favoráveis dos

dois gêneros de fungos em uma só célula. Esta, multiplicada e retrocruzada com a

linhagem original de Saccharomyces cerevisiae, resultou em linhagem capaz de

utilizar uvas ácidas, como as que ocorrem em certas safras na região Sul do país, na

produção de vinhos finos, sem necessidade de utilização de fermentações mistas ou

a adição de açúcar.

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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microbial products. FEMS Microbiol Rev 30, 187-214, 2006.

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1991, 557 p.

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Disponível em :< http://www2.mcdaniel.edu/Biology/botf99/fungifromweb/fungiintro.html >

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39

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Microbiology. Chapman & Hall, London, 1995, 414 p.

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KRISTIANSEN, B.; RATLEDGE, C. Basic Biotechnology. Third Edition. Cambrige

University Press, 2006, 666 p.

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Agric. Vol. 55, Nº 1, Piracicaba, jan/apr 1998.

MOO-YOUNG, M. Comprehensive Biotechnology: The Principles, Applications

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Volume 1, Pergamon Press, Oxford, 1985.

PAREKH, S.; VINCI, V. A.; STROBEL, R. J. Improvement of microbial strains and

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PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5th edition. The

McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p.

REHM, H-J.; REED, G. Biotechnology: A Multi-Volume Comprehensive Treatise

- Volume 2: Genetic Fundamentals and Genetic Engineering. 2nd Completely

Revised Edition, Weinheim: VCH, 1993. 894 p.

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VOGEL, H. C.; TODARO, C. L. Fermentation and Biochemical Engineering

Handbook: Principles, Process Design, and Equipment. Second edition, Noyes

Publications, 1997. 799p.

40

7- ANEXOS

ANEXO 1

IMPROVEMENT OF MICROBIAL STRAINS AND FERMENTATION PROCESSES

S. PAREKH, V. A. VINCI & R. J. STROBEL

41

ANEXO 2

GENETIC IMPROVEMENT OF PROCESSES YIELDING MICROBIAL PRODUCTS

JOSE L. ADRIO & ARNOLD L. DEMAIN

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