Microbiologia  - Apostilas - Biologia, Notas de estudo de Biologia. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUC-RS)
Paulo89
Paulo891 de Março de 2013

Microbiologia - Apostilas - Biologia, Notas de estudo de Biologia. Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUC-RS)

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Apostilas sobre a microbiologia, normas de segurança no laboratório de microbiologia, esterilização e desinfecção, meios de cultivo e técnicas de semeadura, microscopia de gram, antibiograma.
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Aulas Práticas de Microbiologia

Índice

Introdução: Normas de segurança no Laboratório de Microbiologia........ 03

Introdução: Esterilização e Desinfecção .................................................... 04

Aula I: Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura ,,,,,,,,,,,,,,,,,,................. 06

Aula II: Microscopia de Gram .................................................................... 09

Aula III: Antibiograma .................... ........................................................... 10

INTRODUÇÃO

NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais.

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01- O uso do jaleco é OBRIGATÓRIO.

02- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos.

03- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática.

04- Fazer anti-sepsia das mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material.

05- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise.

06- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.

07- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes.

08- Não comer, beber ou fumar no laboratório.

09- Manter canetas, dedos e outros longe da boca.

10- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.

11- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.

12- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada.

13- Flambar as alças, agulhas e pinças de metal antes e após o uso.

14- Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia.

15- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto.

16- Trabalhe sempre próximo ao fogo.

OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de micro-organismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para

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Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

INTRODUÇÃO

DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO

• ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa à destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.

- A melhor maneira de garantirmos a destruição de micro-organismos presentes em instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor.

- As técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os esporos.

- Os métodos de esterilização mais empregados são os que utilizam o calor, seja este úmido (autoclave) ou seco (estufa), sendo que o desempenho do calor úmido (autoclave) é melhor.

I.1- Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)

Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação das proteínas, que resultam na morte dos micro-organismos.

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A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É indicado para esterilizar instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas e óleos.

I.2- Esterilização pelo Calor Úmido

• Vapor d’água

O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os micro- organismos e os esporos, que o calor seco.

A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos micro-organismos, e por este motivo é mais rápido.

• Funcionamento da autoclave:

1- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar;

2- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave;

3- A autoclave é usualmente operada na temperatura de vapor de 121ºC.

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• A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores:

✓ Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados.

✓ A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual.

• DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos micro-organismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfície ou local.

Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química (Desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de micro-organismos inativados.

II.1- Desinfecção por agentes físicos:

• Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C)

Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de micro-organismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos.

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II.2- Desinfecção por agentes químicos:

a) Método de Desinfecção de alto nível: Glutaraldeído 2%, Formaldeído, Ácido Peracético

b) Método de Desinfecção de nível intermediário: Compostos Clorados, Álcool 70%, Iodóforos

c) Método de Desinfecção de baixo nível: Álcool 70%, Compostos Clorados, Iodóforos (em concentrações menores)

• ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local.

• ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas.

• LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização.

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Aula Prática I: Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura

Meios de Cultivo

Os meios de cultivo, também chamados meios de cultura, são complexos que se destinam ao cultivo artificial de micro-organismos.

As técnicas de semeadura permitem que o cultivo destes micro-organismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas:

- crescimento bacteriano;

- isolamento bacteriano;

- estudo da morfologia colonial;

- pesquisa de patogenicidade;

- pesquisa das características bioquímicas.

Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias para o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria matéria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas, açúcares), fontes de nitrogênio (peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos, vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento.

Classificação dos meios de cultivo:

- Quanto à consistência:

• Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja o meio sofre uma turvação.

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• Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacarídeo chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.

• Meios sólidos: são aqueles que possuem uma porcentagem maior de ágar (cerca de 15 g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de micro-organismos.

- Quanto à função:

• Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de micro-organismos pouco exigentes. Ex: caldo simples.

• Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar sangue.

• Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados micro- organismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras. Ex: Ágar Salmonella-Shigella.

• Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espécie de micro-organismo. Ex: Ágar MacConkey.

Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.

NA AULA PRÁTICA IREMOS FAZER UM MEIO SÓLIDO SIMPLES EM PLACA DE PETRI

Técnica de Semeadura

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A escolha da técnica para o cultivo de micro-organismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas nas inoculações:

- A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da coleta.

- Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen.

- Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.

Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as condições de crescimento bacteriano.

Técnica I: Meio Líquido

1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

2- Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a alça.

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Técnica II: Meio semi-sólido

1- Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida.

2- Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido.

Técnica III: Meio sólido (ágar inclinado)

1- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

2- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfície do ágar.

Técnica IV: Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento) FAÇA NA AULA PRÁTICA!

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1- Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa.

2- Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada e o swab na narina anterior de um colega.

3- EM DUAS PLACAS DISTINTAS, faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a superfície da placa.

PLACA A: Material da cultura bacteriana PLACA B: Swab nasal do aluno

OBS: Anote o nome do grupo, a data e a identificação da cultura nas placas.

As placas serão incubadas a 37°C (de forma invertida) da estufa por 24h.

Aula Prática II: Microscopia de Gram

A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-negativas pela presença de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede celular é a base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e tintoriais da bactéria em pesquisa.

A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram- positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adição de álcool-acetona, as bactérias Gram- negativas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retêm o complexo, permanecendo roxas. A adição de fuccina (ou safranina) não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactérias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo álcool-acetona.

Técnica:

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-Esfregaço de cultura bacteriana sólida:

1- Retire uma gota da solução salina e deposite sobre a lâmina.

2- Flambe a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida.

3- Leve a amostra até a gota de salina depositada sobre a lâmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.

1- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

- Adição de Corantes:

1- Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.

2- Cubra a lâmina com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto.

3- Lave a lâmina em jato fraco de água corrente.

4- Cubra a lâmina com lugol, deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lâmina.

5- Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona, verifique a descoloração que deve ocorrer em cerca de 20 segundos.

6- Cubra a lâmina com fuccina, deixe agir por 1 minuto, e, novamente lave a lâmina.

7- Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir seque o restante da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando” a chama).

8- Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço)

1- Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia bacteriana e a reação tintorial.

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PLACA A PLACA B

Aula Prática III: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)

Antibiogramas são bioensaios conduzidos “in vitro” que visam testar a sensibilidade de bactérias aos antimicrobianos. A proposta primária deste teste é guiar o clínico na escolha do agente apropriado para a terapia. Além disso, estes testes são utilizados para avaliar “in vitro” a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).

Método de DISCO DIFUSÃO: é um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do ágar uniformemente semeado com o micro- organismo. A droga se difunde no ágar e produz inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são essenciais:

– Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas.

– Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-Farland).

Técnica:

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Para cumprir os objetivos desta aula será utilizado o método de difusão:

1- Fazer a escala 0,5 Mac Farland: Retire 1 colônia pura da placa semeada e coloque em 3 mL de solução salina a 0,85%

2- Sature um swab de algodão com a solução bacteriana (na escala 0,5 Mac Farland) (Fig. 1). Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo.

3- Semeie a suspensão sobre a superfície estéril de uma placa contendo ágar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente três direções para obter um inóculo uniformemente espalhado sobre toda a superfície do ágar (Fig 2).

Distribua os discos de antibiótico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfície do ágar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). Deixe uma distância de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco.

4- Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação.

5- Incube as placas por 24 horas a 37°C.

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Análise dos Resultados

Através da análise dos resultados poderemos classificar os micro-organismos testados em: “resistente”, “intermediário” e “sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro (Fig 4).

No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas.

1- Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactéria utilizada, a formação ou não do halo de inibição para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificação da bactéria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.

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