Microrganismos - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Microrganismos - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos Microrganismos, preservação, congelamento, secagem, conservação a longo prazo.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

11

Os óleos utilizados devem ser bastante viscosos e com densidade relativa de

0,8 a 0,9 à temperatura de 20ºC, para que eles não sejam mais densos que a água e

parem no fundo da cultura líquida. Eles também não devem conter produtos tóxicos

à célula. Os óleos mais recomendados para a conservação de microrganismos são a

parafina e a vaselina.

Durante a esterilização do óleo deve-se evitar a formação de umidade para

evitar contaminação. Existem dois procedimentos possíveis para a esterilização do

óleo mineral: através de autoclavagem a 1 atm por 30 minutos seguida de secagem

a 150ºC, e através de aquecimento à 170ºC por 1 hora. No entanto, a elevação da

temperatura do óleo pode às vezes resultar na formação de produtos tóxicos.

O meio de cultivo em que o microrganismo está deve ser adequado para o

crescimento assim como na técnica de repique contínuo. A temperatura de

conservação do meio após adição do óleo varia na literatura de 4ºC a 20ºC. Ela

deve ser ajustada de acordo com as necessidades individuais dos microrganismos.

Fungos geralmente são mantidos em 15ºC.

Esse método possui as mesmas desvantagens que o repique contínuo,

diferindo somente na longevidade da cultura, que por essa técnica é maior.

Bactérias sobrevivem por um período de 1 a 7 anos dependendo da espécie. Já

fungos macroscópicos suportam de 1 a 5 anos, enquanto leveduras geralmente

podem ser estocadas até 7 anos.

A repicagem de uma cultura proveniente desse método deve ser feita para o

mesmo meio de cultivo em que o microrganismo se encontrava durante a

preservação. A retirada do microrganismo acontece após a drenagem total da

camada de óleo.

3.2- PRESERVAÇÃO EM ÁGUA ESTÉRIL

Esse método, também chamado de método de Castellani, pode ser feito em

água estéril ou solução salina de água. A solução salina é utilizada para a

preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões osmóticas de soluções

hipotônicas. Esse método visa atingir a hipobiose com a diminuição do metabolismo

e formação de estado latente da célula devido à falta de fontes nutritivas. Uma

suspensão de células ou um bloco de ágar (aproximadamente 5 mm x 10 mm)

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contendo o microrganismo é adicionado a uma solução de água estéril e conservado

a baixas temperaturas ou temperatura ambiente.

Esse processo vem sendo muito utilizado pelo Laboratório de Micologia

Fitopatológica do Centro de Sanidade Vegetal do Instituto Biológico de São Paulo

com excelentes resultados desde 1966. A metodologia desenvolvida no Laboratório

de Micologia Fitopatológica consiste no preenchimento de frascos do tipo

empregado para antibióticos de capacidade para 6mL com 4mL de água destilada,

tampados com algodão e autoclavados a 121° e 1 atm por 30 minutos. Então ocorre

a repicagens dos fungos para os frascos com água em câmara asséptica retirando-

se os tampões de algodão e transferindo-se pedaços de meio de cultura contendo o

microrganismo.

A cultura que será transferida para a solução aquosa deve ser jovem para ter-

se bons resultados. Para a maioria dos fungos preservados por esse método a idade

da cultura é 8 a 10 dias. Dá-se preferência a repicar a parte periférica das culturas

onde as hifas estão em franco desenvolvimento. Após a repicagem os tampões de

algodão são substituídos por rolhas de borracha esterilizadas e os frascos são

lacrados para evitar contaminação e perda de água.

O armazenamento das culturas é feito à temperatura de 12º-24º C com

aparelhos refrigeração de ar. Para fungos, temperaturas elevadas podem causar

uma perda na viabilidade quando submetidos a altas temperaturas por um longo

período de tempo.

Os primeiros experimentos realizados por essa técnica foram feitos com

bactérias fitopatogênicas e fungos microscópicos estocados de 1 a 2 anos. Bactérias

como Acinetobacter e leveduras como Saccharomyces cerevisiae também podem

ser conservados satisfatoriamente por esse método.

As vantagens desse método são a possibilidade de armazenamento à

temperatura ambiente, a solução não ser atacada por ácaros, e o baixo custo do

processo, pois não necessita de equipamentos sofisticados. No entanto, existem

problemas quanto a contaminações por outros microrganismos e a instabilidade

genética da população.

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3.3- CONGELAMENTO COMUM

O congelamento comum consiste na utilização de freezers comuns que

atingem temperaturas de 4 a 20ºC negativos, sendo aconselhável temperaturas

iguais ou inferiores a -20ºC. Não há necessidade de equipamentos caros nem de

preparos da amostra. A desvantagem seria a danificação de algumas células

durante o congelamento. A viabilidade média dos microrganismos é de 1 a 2 anos.

3.4- SECAGEM

A técnica consiste em uma suspensão do microrganismo que é derramada

sobre carregadores como areia, lama, solo, carvão ativado, grãos de trigo, esferas

de vidro, grânulos gelatinosos ou sintéticos, papel-filtro, entre outros. Esses

carregadores são bons devido a grande superfície e a capacidade de absorver parte

da umidade para então serem secos à temperatura ambiente ou em aquecimento de

36-40ºC. A secagem também pode ser feita na presença de algum composto

hidrofílico como a sílica-gel e o petóxido de fósforo.

O método de preservação em tubos contendo solo ou areia estéril foi

idealizado e empregado por muito tempo para a conservação de bactérias. Teve

também aceitação ampla em diversos laboratórios para conservação de fungos

comercialmente importantes. As técnicas para o preparo de culturas em solo são

basicamente duas.

A primeira consiste na inoculação de um pequeno volume de solo seco e

estéril ou areia estéril, com pequena quantidade de suspensão de esporos do fungo

que se deseja manter, seguindo-se a imediata secagem. Essa técnica não permite o

crescimento do fungo e preserva os conídios ou esporos inicialmente introduzidos no

solo.

Essa é a técnica mais comumente empregada por quem usa este método e

foi descrita por Greane & Fred em trabalho publicado em 1934. Inicialmente inocula-

se cerca de 5 gramas de solo rico em matéria orgânica, previamente autoclavado

por 1 hora a 121° C, com 1 mL de uma suspensão concentrada de esporos, seguido

pela secagem do material a temperatura ambiente. O armazenamento é feito à

temperatura ambiente ou em refrigerador.

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A segunda técnica consiste na utilização de um volume de inóculo em solo

umedecido e previamente esterilizado por autoclavagem, seguido de um período de

incubação. Esta técnica possibilita, para fungos, o crescimento, preservando as

células propagativas e de resistência (clamidósporos esclerócios, etc) além do

micélio, provenientes da germinação do inóculo inicial.

São obtidos resultados mais satisfatórios quando o solo possui de 20 a 25%

de capacidade de retenção de água. Para a determinar esse valor de capacidade de

retenção de água do solo pode-se colocar uma porção de solo em um funil contendo

um cone de papel-filtro umedecido e adiciona-se água até que uma gota d’água se

forme na ponta do cone de papel. A quantidade de água adicionada ao solo

corresponde aproximadamente à capacidade de retenção de água desse tipo de

solo.

Entre os tipos de solo que têm sido utilizados para a preservação de

microrganismos estão a turfa e a argila. Também se pode utilizar uma combinação

de solo e areia na proporção de 1:1, atingindo-se resultados satisfatórios.

A preservação em papel-filtro pode ser feita utilizando tiras de papel de filtro

de 0,5 x 2,0 cm previamente esterilizadas. Elas são imersas em suspensão

microbiana e postas a secar em ambiente fechado contendo sílica-gel e

armazenadas em geladeira.

Também se pode fazer a secagem em sílica-gel. Esse método consiste em

pequenos frascos de vidro com tampas metálicas que são parcialmente preenchidos

com sílica-gel purificada, de malha 6-22 mesh, previamente esterilizada pelo calor,

seca a 130ºC por 3 horas e resfriadas em congelador. A suspensão de esporos é

misturada com 5% de leite desnatado é adicionada à sílica gel em quantidade

suficiente para umedecer ¾ da sílica gel dos frascos. Os frascos são então

colocados por 20 minutos em banho frio, para evitar efeitos do desprendimento de

calor. Como a sílica-gel libera calor quando em contato com a água ou suspensões

aquosas há a necessidade de resfriamento em banho de gelo para evitar danos aos

microrganismos. Após, os frascos são guardados a temperatura ambiente. Para

recuperar as culturas, alguns poucos cristais de sílica são assepticamente

removidos e colocados em meio de cultura propício ao desenvolvimento microbiano.

As vantagens dos métodos de secagem são o longo período de preservação

(em média de 5 ou mais anos); as modificações morfológicas ou fisiológicas são

reduzidas ou praticamente eliminadas, pois são utilizados formas de resistência

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como esporos; a obtenção de inóculo por longos períodos, necessitando fazer

somente a repicagem de pequenas porções de solo quando se necessita reativar a

cultura; e a manutenção da capacidade esporulação do microrganismo.

No entanto, as desvantagens envolvem a utilização desse método somente

para um número reduzido de microrganismos (aqueles que têm a capacidade de

produzir esporos resistentes ou outras formas de resistência), a dificuldade de se

perceber contaminações que muitas vezes só são notadas quando durante a

repicagem.

Os fungos que já foram preservados por essa técnica são de gêneros

anamórficos ou mitospóricos (Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium,

Rhizoctonia, Septoria, Verticillium). Várias espécies de actinomicetos e leveduras

também já forma conservadas dessa forma.

O método de liofilização que será abordado mais adiante também realiza a

secagem da amostra, mas esse método proporciona um período de conservação

mais longo, e por isso se encontra separado. O ANEXO 3 é um artigo de revisão que

mostra alguns outros métodos de secagem mais sofisticados como a técnica de

formação de espuma, o spray drying, e a secagem em fluidised bed.

4- MÉTODOS DE CONSERVAÇÃO A LONGO PRAZO

Os métodos de conservação a longo prazo são bastante utilizados em

laboratórios que possuem os equipamentos necessários e principalmente nos

centros de preservação de culturas. Dentre essas técnicas de preservação estão a

liofilização, o congelamento em ultrafreezers e a criopreservação em nitrogênio

líquido.

4.1- LIOFILIZAÇÃO

O processo de liofilização, também chamado de freeze drying em inglês, foi

patenteado em 1906 pelos cientistas franceses D’Arsonval e Bouda. O

desenvolvimento desta técnica foi uma conseqüência do aperfeiçoamento dos

métodos de desidratação que são empregados para uma ampla variedade de

microrganismos.

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A técnica utiliza a associação dos métodos de congelamento e desidratação

sob condições de vácuo, pois a exposição contínua das células aos solventes

concentrados da suspensão durante o congelamento e a desidratação é perigoso

para elas. A morte das células também é relacionada com o início de formação de

gelo extracelular, gerando concentrações de sais em níveis críticos. A exposição a

tais eletrólitos altamente concentrados leva a desequilíbrios nos sistemas

enzimáticos e provoca alterações irreversíveis na permeabilidade da membrana

celular.

A liofilização consiste na dissecação sob vácuo do material congelado através

da sublimação. Usualmente, os esporos ou células são suspensos em um colóide

que pode ser leite desnatado (10 – 20%), soro bovino, ou solução de lactose, glicose

ou sacarose 1%.

O material líquido é congelado em ampolas e então conectado em uma

bomba a vácuo acoplada a um sistema coletor de vapores da água. Após a

liofilização as ampolas são guardadas a temperatura ambiente ou em refrigerador de

4 a -6ºC.

As vantagens do processo são a desidratação a partir do estado de

congelamento (possibilitando a remoção da água de estruturas rígidas mantidas pelo

congelamento), a manutenção da viabilidade de vários microrganismos por muitos

anos sem alterações de suas características genéticas, e a facilidade de transporte

das amostras liofilizadas. As desvantagens são a impossibilidade de seu emprego

para certos fungos que não suportam o processo devido à fragilidade ou ao tamanho

do esporo, a alta taxa de morte de leveduras por essa técnica, e a utilização da

ampola somente uma vez, pois, após a abertura delas e em contato com o ar, o

fungo deve ser semeado imediatamente para não perder a viabilidade.

Alguns cuidados devem ser tomados com essa técnica, tais como: as

amostras de ampolas recentemente liofilizadas devem ser testadas quanto à

viabilidade para que se evite o armazenamento de culturas mortas, a substância

protetora deve ser devidamente esterilizada, e a escolha do protetor depende do

microrganismo (sendo necessário fazer testes empíricos).

Através dessa técnica, a viabilidade de alguns microrganismos pode ser

mantida por muitos anos ultrapassando períodos de 17 a 20 anos. A maioria das

coleções de microrganismo atualmente utiliza essa técnica para a conservação. A

maioria das bactérias, actinomicetos e muitos fungos, inclusive os leveduriformes,

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respondem bem a essa técnica, mesmo considerando que o número total de células

que sobrevivem ao processo em cada operação seja relativamente pequeno.

Fungos não esporulantes, que possuem esporos demasiadamente delicados ou

excepcionalmente grandes não suportam a liofilização, como os fungos do gênero

Phytophthora, Pythium, e Aclya.

4.2- CONGELAMENTO EM ULTRAFREEZER

As células podem ser preservadas por um longo período de tempo através do

congelamento a temperaturas de -60 a -80ºC. Essas temperaturas são obtidas em

ultrafrezeers.

A cultura deve ser primeiramente cultivada até a o meio ou final da fase

logarítmica e centrifuga-se o meio de cultivo para recuperar as células. As células

precipitadas são ressuspendidas em solução de criopreservante (como glicerol 10%

v/v) e estocadas em vials criogênicos ou ampolas. O material é então congelado até

-70ºC numa taxa de resfriamento de 1 a 2ºC por minuto.

Para evitar a perda das culturas em caso de falta de energia, deve haver um

gerador de emergência para manter alguns equipamentos essenciais do laboratório

funcionando, como o freezer -80ºC.

4.3- CRIOPRESERVAÇÃO EM NITROGÊNIO LÍQUIDO

A preservação em nitrogênio líquido consiste no congelamento do material a

temperaturas de -196ºC. Freqüentemente nesse método há a necessidade de uso

de substâncias crioprotetoras como o glicerol e o dimetilsulfóxido, como será

abordado na próxima sessão.

O processo consiste resumidamente no seguinte na coleta dos

microrganismos das culturas em ágar através da adicionando sa solução

crioprotetora (como glicerol a 10% v/v) e raspando delicadamente da superfície das

culturas. Então se pipeta 5 mL da suspensão para ampolas de vidro esterilizadas e

resfria-se a amostra lentamente na razão de 1ºC por minuto até 20º C ou 30ºC

negativos através de um freezer comum. Após, é feita uma rápida transferência para

o congelador de nitrogênio líquido para resfriar a amostra rapidamente até -196ºC.

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Para recuperação as culturas o degelo deve ser rápido, fazendo imersão das

amostras em "banho-maria" a 30 ou 40 ºC e semeando a solução descongelada em

meio de cultura adequado.

O manuseio de refrigeradores de nitrogênio líquido exige várias precauções e

por isso só deve ser manipulado por técnicos especializados. Deve-se utilizar luvas

protetoras para evitar contato direto com o nitrogênio, evitar o trabalho em

ambientes pouco ventilados, cuidar com o perigo de explosões de ampolas mal

seladas e verificar o nível de nitrogênio, o qual deve ser completado de tempos em

tempos.

Consegue-se preservar por essa técnica fungos, bacteriófagos, vírus, algas,

leveduras, bactérias, células animais, vegetais e cultura de tecidos por vários anos.

No entanto a viabilidade das células pode ser modificada em sucessivos processos

de resfriamento e descongelamento.

As desvantagens do procedimento são o custo do equipamento e a sua

manutenção com reposição do nível de nitrogênio líquido, pois ele evapora. Se isso

não for feito, o equipamento falha em manter as culturas congeladas e pode ocorrer

uma perda da coleção de cepas.

4.4- CRIOPROTETORES

Os agentes crioprotetores são aditivos usados durante a conservação de

microrganismos a baixas temperaturas. Apesar de se observar que alguns

microrganismos conseguem passar pelo processo de congelamento sem grandes

danos (como algumas bactérias e esporos), observa-se que a utilização de

crioprotetor aumenta a taxa de sobrevivência dessas células ao procedimento. Os

crioprotetores envolvem uma variedade de compostos químicos complexos, mas

apenas uma minoria é freqüentemente utilizada, como dimetilsulfóxido (DMSO),

glicerol, soro de sangue, soro de albumina, leite desnatado, extrato de levedura,

sacarose, entre outros.

Os crioprotetores eliminam a maioria dos fatores destrutivos das estruturas

celulares durante o processo de congelamento. Para a conservação e preservação

da viabilidade dos microrganismos, morfológica, bioquímica, taxonômica e

propriedades genéticas durante é necessário que o criopreservante não seja tóxico,

seja hidrofílico, não seja reativo com a água facilmente, previna a hiperconcentração

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na suspensão, estabilize as pontes de hidrogênio nos cristais, previna a formação de

cristais grandes, e tenha boa penetração celular (somente para crioprotetores

endocelulares).

Fazendo uma comparação entre os mais utilizados, observa-se um melhor

resultado de preservação para o DMSO, o metanol, o etilenoglicol, o propilenoglicol,

e soro de albumina. Deve-se lembrar também que dióis são tóxicos a vários

microrganismos. A escolha de um criopeservante ou a combinação deles dependerá

do microrganismo e deverá ser determinada empiricamente, pois vários fatores irão

afetar a eficiência do criopreservante, como, por exemplo, a espécie, a linhagem, o

tamanho e a forma das células, a fase de crescimento, a taxa de crescimento, a

temperatura de incubação, a osmomolaridade, a composição do meio

criopreservante, a quantidade de água dentro da célula, a sua densidade quando

congelada, a taxa de congelamento, entre outros. Dentre esses fatores, o mais

importante é a composição do meio em que as células estão suspensas durante o

congelamento.

Os criopreservantes podem ser classificados dependendo do seu grau de

penetração na célula: os de rápida penetração (geralmente levando cerca de 30

minutos) como o metanol, o etileno glicol, o propileno glicol, dimetil formaldeído,

metilacetamida e DMSO; os de lenta penetração como o glicerol; e os impenetráveis

ou não permeáveis, como os mono, oligo e polissacarídeos, o manitol, o sorbitol, a

metil celulose, e o polietileno glicol, que causam crioperservação extracelular

quando presentes na concentração de 10-40%. A permeabilidade desses compostos

pela membrana plasmática depende da temperatura e do tipo de célula. Alguns

deles penetram somente a parede celular, mas não a membrana, gerando uma outra

forma de classificação: os que penetram parede e membrana celular (DMSO,

glicerol); os que penetram parede, mas não adentram a membrana (mono e

dissacarídeos, aminoácidos e polímeros de baixo peso molecular); e os que não

penetram nem a parede (polímeros de alto peso molecular, proteínas e

polissacarídeos).

A Tabela 3 mostra alguns dos agentes crioprotetores disponíveis. Em seguida

serão discutidos em maiores detalhes alguns dos crioprotetores mais utilizados nos

laboratórios de conservação de microrganismos.

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Tabela 3- Crioprotetores utilizados na microbiologia

Fonte: HUBÁLEK, 2003.

4.4.1- Sulfóxidos

Esses elementos químicos consistem de tioéteres oxidados solúveis em água.

Nessa classe de compostos se encontra o dimetilsulfóxido, que é considerado um

criopreservante universal. Ele era utilizado inicialemente como crioprotetor de

eritrócitos e células espermáticas, mas depois começou a ser utilizado para

bactérias (incluindo riquétsias e micoplasmas), vírus, fungos, leveduras, algas e

protozoários.

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A concentração de DMSO necessária durante o congelamento varia muito, de

1 a 32%, sendo que normalmente usa-se 10%. A Tabela 4 mostra algumas

concentrações relativas a determinados microrganismos.

Tabela 4- Concentração de DMSO por microrganismo

Microrganismo DMSO

Anaplasma marginale 32%

Dientamoeba fragilis 2,75%

Entodinium simplex 3,9%

Entodinium caudatum 3,9%

Leptospira interrogans 2,5%

Microcystis aeruginosa 3,0%

Fonte: HUBÁLEK, 2003.

DMSO é um criprotetor melhor que o glicerol para as seguintes espécies:

Spirillum volutans, L. interrogans, Escherichia coli, Lactobacillus delbuecki, bactérias

metanotróficas, alguns vírus, Lipomyces starkeyi, Saccharomyces exiguus, Candida

bogoriensis, Neurospora crassa, Sclerospora sorghi, Pezizales, Volvariella volvacea,

alguns basidiomicetos, Enteromorpha intestinalis, Chlamydomonas reinhardtii,

Porphyra yezoensis, microalgas marinhas, Trichomonas vaginalis, Trichomonas

foetus, Toxoplasma gondii, Leishmania tropica, Babesia spp., Naegleria, e

Acanthamoeba spp.

Esse criopreservante também pode ser tóxico para algumas células. Por

exemplo, algumas bactérias aeróbicas como Staphylococcus, Micrococcus,

Pseudomonas, Streptococcus, Lactococcus, Corynebacterium e E. coli, tem seu

crescimento inibido com concentrações de 10% de DMSO, enquanto esse fato não

acontece em microrganismos anaeróbicos. No entanto, a maioria das bactérias

agüenta altas concentrações de DMSO. Fungos geralmente suportam somente

pequenas quantidades de DMSO.

Observa-se que o cripreservante é menos tóxico para as células em baixas

temperaturas (0 a 5ºC), por isso, células que serão congeladas em DMSO devem

ser mantidas em baixa temperatura antes do congelamento. É aconselhável não

utilizar concentrações de DMSO maiores que 15%, evitar longos períodos de

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