Mitocondrias - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Mitocondrias - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo das mitocondrias, o genoma, cloroplastos, genoma humano, proteínas mitocondriais.
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– se a bicamada lipídica da membrana interna é bastante imper-

meável e, no entanto, é preciso que muitas moléculas cheguem à matriz

e de lá saiam atravessando essa membrana, ela tem de ter muitos trans-

portadores, carreadores etc.

Matriz mitocondrial – o conteúdo da matriz mitocondrial é tão

concentrado que não se espalha logo que a membrana mitocondrial

interna é rompida, como representado na Figura 26.7. A matriz é como

um colóide que vai se dispersando devagar. Como está isolada por uma

membrana bastante impermeável, a matriz mitocondrial tem composição

iônica muito particular. Seu pH, por exemplo, é bem maior que o do

citoplasma, cerca de 8, porque a cadeia respiratória bombeia prótons

para fora da mitocôndria, alcalinizando a organela (mas sem acidifi car

o citoplasma, já que o volume deste é muito maior).

O estado físico coloidal da matriz é resultado de uma grande

concentração de macromoléculas, em que se destacam:

a) proteínas solúveis:

– as enzimas do ciclo de Krebs;

– as enzimas que fazem a β-oxidação dos ácidos graxos;

– a piruvato desidrogenase, complexo enzimático muito grande

e abundante que é essencial para o funcionamento do ciclo de Krebs a

partir de glicose (e que vamos ver na próxima aula);

b) ácidos nucléicos:

– DNA;

– RNAs: ribossomais (rRNA), transportador (tRNA), e o equiva-

lente ao mensageiro (mRNA).

Na próxima aula, vamos abordar o metabolismo mitocondrial,

com as proteínas e enzimas que dele participam, do ponto de vista

celular. Por ora, vamos nos deter nos ácidos nucléicos encontrados na

matriz mitocondrial.

O GENOMA DAS MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS

A descoberta de que mitocôndrias e cloroplastos (Aulas 28 e 29)

possuem ácidos nucléicos (DNA e RNA) despertou enorme curiosidade

entre os pesquisadores. Procuramos incluir nesta aula algumas das con-

clusões dessas pesquisas, que tiveram enorme infl uência na elaboração

das teorias sobre a evolução da vida em nosso planeta.

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Diferentemente do DNA nuclear, nas mitocôndrias e nos cloro-

plastos essas moléculas são circulares (Figura 26.10a) e não possuem

histonas, como o DNA de procariotos. Em cada organela, estão presentes

várias moléculas de DNA iguais que geralmente estão associadas em

pequenos grupos espalhados pela matriz mitocondrial (e pelo estroma

dos cloroplastos).

Por alguma razão, nos tripanosomatídeos, os círculos de DNA estão presos uns aos outros como os elos de uma corrente. Por isso, formam um aglomerado eletrondenso na região da mitocôndria que fi ca próxima à base do fl agelo (Figura 26.10b). Devido a essa proximidade, pensava-se que era uma estrutura ligada ao batimento fl agelar e deu-se a ela o nome de cinetoplasto (que signifi ca corpúsculo do movimento). Nesses protozoários, os genes contidos no cinetoplasto parecem ter relação com a infectividade do parasito e são muito estudados.

Figura 26.10: Micrografi as de um círculo de DNA mitocondrial isolado (a) e do cineto- plasto (seta em b) do Trypanosoma cruzi, formado por vários círculos associados; M, mitocôndria; N, núcleo. Foto a, de David Clayton; foto b, de Isabel Porto Carreiro.

As muitas moléculas de DNA de uma mitocôndria são produzi-

das por replicação. No entanto, a replicação do DNA de mitocôndrias

e cloroplastos não está regulada pelos mesmos mecanismos que a

replicação do DNA nuclear. Além de replicadas, as moléculas de

DNA de mitocôndrias e cloroplastos também são transcritas por

enzimas próprias das organelas, produzindo RNAs que, por sua vez,

são traduzidos por ribossomos também nas próprias organelas.

Os ribossomos de mitocôndrias e cloroplastos são diferentes

dos ribossomos citoplasmáticos. Especialmente os dos cloroplastos

são semelhantes aos ribossomos de bactérias e conseguem até mesmo

funcionar em conjunto com enzimas ou tRNA de bactérias. Quando a

síntese de proteínas em mitocôndrias e cloroplastos começa, o primeiro

aminoácido da cadeia é sempre formil-metionina, como nos procariotos,

enquanto nos eucariotos o primeiro aminoácido é sempre metionina.

Apesar dessas diferenças e do descompasso na replicação, a tradução

nas mitocôndrias tem de ser bastante coordenada com a que ocorre no

citoplasma, já que a grande maioria das proteínas das mitocôndrias está

codifi cada no núcleo. Os poucos genes presentes na organela codifi cam

De novo, os protozoários!

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para subunidades de enzimas mitocondriais que dependem da chegada,

vindas do citoplasma, de outras subunidades da mesma proteína para

poder montar a enzima funcional.

Nem tudo é igual!

Além das muitas semelhanças com os ácidos nucléicos e as enzimas

de procariotos, existem diferenças marcantes também. Talvez a maior

delas esteja no código genético. No código nuclear de todas as espécies,

o signifi cado de alguns CÓDONS é bastante conservado.

No genoma mitocondrial de animais e fungos, o código univer-

sal para fi m de leitura (stop codon), por exemplo, não tem esse signi-

fi cado, codifi cando para o aminoácido triptofano. Já no genoma das

mitocôndrias de plantas, o signifi cado também é parada de leitura.

O RNA das mitocôndrias e cloroplastos é mais permissivo no

pareamento com os códons. Enquanto nos eucariotos e procariotos cada

códon tem um signifi cado, nas organelas a terceira base pode variar, sem

mudar o signifi cado. Isso permite usar menos tRNA diferentes (são 22

nas mitocôndrias e 30 no citoplasma). Por isso, os biólogos molecula-

res dizem que o código genético das mitocôndrias é mais relaxado, no

sentido de menos exigente.

O genoma de mitocôndrias e cloroplastos pode ter tamanhos muito

diferentes, sendo o dos cloroplastos geralmente maior. Numa mesma

planta, o genoma da mitocôndria pode ter cerca de 200 mil pares de

bases, enquanto o do cloroplasto tem 250 milhões de pares de bases.

Os menores genomas de organelas são os das mitocôndrias de

animais, que têm entre 16 e 19 mil pares de bases. O genoma da mito-

côndria humana, por exemplo, é bem pequeno e já foi completamente

seqüenciado.

CÓDON

Conjunto de três bases nitrogenadas,

codifi cando um aminoácido, o início ou o fi m da leitura.

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O genoma mitocondrial humano O seqüenciamento completo do genoma mitocondrial humano mostrou que ele é formado por dois genes que codifi cam para RNA ribossomal, 22 genes que codifi cam para RNA transportador e 13 genes que codifi cam para proteínas. Sua característica mais marcante (comum a vários genomas mitocondriais) é que todos os 16.569 nucleotídeos presentes fazem parte de algum gene, ou seja, não há regiões não codifi cantes nem espaço para regiões reguladoras. Ao mesmo tempo, apresenta alta taxa de substituição de nucleotídeos, cerca de 10 vezes maior que a taxa nuclear. Por isso, a comparação de seqüências mitocondriais humanas tem sido muito útil no estudo da migração de populações. O seqüenciamento do genoma mitocondrial teve grande impulso depois da guerra do Vietnã porque, pressionado pelas famílias dos soldados mortos que não aceitavam os túmulos do “soldado desconhecido”, o exército americano fi nanciou e executou um grande trabalho de análise do DNA mitocondrial dos soldados mortos. A razão do in- teresse é que o DNA mitocondrial é o mais adequado para a identifi cação de cadáveres muito destruídos. Por ser menor, está menos sujeito a quebras; por ser circular, é mais fácil saber se a molécula está completa; por estar presente em mais de mil cópias por célula, é mais fácil de ser encontrado; por ser herdado apenas da mãe, as comparações para identifi cação são mais fáceis. Depois da metodologia estabelecida, o DNA mitocon- drial já foi usado para identifi cação de cadáveres muito antigos ou destruídos (como os restos mortais da família do último czar russo) e vem sendo freqüentemente usado em genética forense (como, por exemplo, na busca dos netos por avós argentinos, cujos fi lhos “desapareceram” durante a ditadura).

Não apenas os ácidos nucléicos de mitocôndrias e cloroplastos se

parecem com os de procariotos, mas também as próprias enzimas que

trabalham na transcrição e na tradução dentro da organela têm caracte-

rísticas em comum com as enzimas dos procariotos, sendo inibidas pelas

mesmas drogas (Figura 26.11). Surpreendentemente, essas enzimas são

elas próprias completamente codifi cadas por genes do núcleo e tradu-

zidas no citoplasma.

Figura 26.11: As drogas que inibem a transcrição no núcleo (α-amanitina) e a tradução e citoplasma (ciclo-heximida) de uma célula são diferentes das que ini- bem transcrição (acridinas) e tradução (cloranfenicol, tetraciclina e eritromicina) em mitocôndrias ou cloroplastos na mesma célula.

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Talvez você tenha reconhecido algumas drogas na Figura 26.11, já que as drogas que inibem tradução nas mitocôndrias e cloroplastos são as mesmas que inibem a tradução em bactérias e por isso são usadas como antibióticos. Mas você não precisa achar que vai exterminar suas mitocôndrias tomando esses antibióticos, porque eles se concentrarão nas bactérias que têm uma taxa de tradução muito mais acelerada que as mitocôndrias.

IMPORTAÇÃO DE PROTEÍNAS MITOCONDRIAIS

Como você viu, a maioria das proteínas presentes em mitocôn-

drias e cloroplastos está codifi cada no genoma nuclear e é sintetizada

no citoplasma. Como vão parar dentro das organelas?

Para entrar em mitocôndrias e em cloroplastos, as proteínas

precisam ter seqüências sinal que serão reconhecidas por receptores na

membrana externa das organelas. Isso lembra a entrada de proteínas no

retículo endoplasmático, não lembra?

Uma diferença muito marcante entre a entrada de uma proteína

no retículo e na mitocôndria é que uma proteína só entra na mitocôn-

dria depois que foi completamente sintetizada, ou seja, a importação

de proteínas pela mitocôndria é pós-traducional. No entanto, assim

como no retículo, a proteína precisa estar desenovelada para passar

pelos translocadores mitocondriais. Por isso, uma proteína mitocondrial,

mesmo depois de completamente sintetizada, continua ligada a várias

chaperonas, que impedem o enovelamento precoce ou a agregação de

várias proteínas (reveja esse conceito na Aula 18). As chaperonas só vão

se soltar da proteína depois que ela for reconhecida pelos translocadores

mitocondriais.

Existem dois grupos de translocadores, os complexos TOM (Trans

Outer Membrane, translocase de membrana externa) e TIM (Trans

Inner Membrane, translocase de membrana interna) (Figura 26.12).

Eles podem funcionar separadamente, só o TOM para proteínas de

membrana externa e do espaço intermembranar e, TOM e TIM para

proteínas de membrana interna e proteínas da matriz.

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Figura 26.12: Os complexos de importação mitocondriais t r a n s l o c a s e da membrana externa (TOM) e translocases de membrana interna (TIM).

Vamos imaginar uma proteína de matriz mitocondrial. Ela é sinte-

tizada no citoplasma, mantida desenovelada por chaperonas até que sua

seqüência de sinal seja reconhecida por uma TOM (Figura 26.13).

Figura 26.13: Importação de uma proteína da matriz mitocondrial.

Uma vez reconhecidas, as chaperonas se soltam e a hidrólise

de ATP por essas chaperonas contribui para que a TOM transporte a

proteína para dentro. Logo que sua seqüência-sinal aparecer no espaço

intermembranar, uma TIM vai reconhecê-la e translocá-la para a matriz

com a ajuda da energia do gradiente de prótons da cadeia respiratória

(Figura 26.13). Ao chegar à matriz, sua seqüência-sinal é cortada, e a

conformação funcional é adquirida com a ajuda das chaperonas mito-

condriais.

Com certeza, esse mecanismo seria mais efi ciente se a passagem

pelas duas membranas fosse consecutiva. Essa idéia é confi rmada pela

existência de sítios de contato entre a duas membranas da mitocôndria,

observada em algumas preparações especiais de microscopia eletrônica

(Figura 26.14), e pela descoberta de que uma das TIM (a TIM 23) é uma

proteína das duas membranas.

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Figura 26.14: Observando ao microscópio eletrônico de alta voltagem um corte espesso de mitocôndrias do fungo Neurospora crassa preservadas por congelamento, é possível observar que as membranas externa e interna mantêm distância aproxi- madamente constante, exceto nos pontos de contato (no detalhe), que se acredita sejam os locais de importação de proteínas para a matriz mitocondrial. Foto de Daniela Nicastro (J. Struct. Biol. 129:48, 2000).

ORIGEM SIMBIÓTICA DE MITOCÔNDRIAS E CLOROPLASTOS

Agora que você já conhece melhor as características de mitocôn-

drias e cloroplastos, podemos voltar à discussão sobre a origem dessas

organelas.

As mitocôndrias teriam se originado a partir da fagocitose de

procariotos aeróbicos por eucariotos que não os destruíram e passaram

a usufruir de grandes vantagens numa época em que o teor de oxigê-

nio da atmosfera terrestre estava aumentando. Os novos eucariotos

desenvolveram, então, uma relação de simbiose com os procariotos que

fagocitaram e passaram a predominar porque podiam obter muito mais

energia a partir dos substratos disponíveis. A aquisição das mitocôndrias

também liberou a membrana plasmática das tarefas de produção de

energia, possibilitando outras especializações que contribuíram muito

para o aumento da complexidade dos eucariotos.

Mas será que essa hipótese é verdadeira? Ainda não foi possível

testá-la diretamente, já que ainda não se conseguiu “cultivar” mitocôn-

drias e depois oferecê-las a um eucarioto sem mitocôndrias, como uma

ameba, na tentativa de refazer o evento simbiótico. O estudo de outras

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relações simbióticas, entre protozoários e bactérias, tem contribuído

bastante para o entendimento do processo. Algumas características argu-

mentam fortemente a favor da origem procariótica das mitocôndrias:

1) A presença de porinas na membrana mitocondrial externa – pela

hipótese da origem simbiótica, a membrana externa da mitocôndria cor-

responderia à membrana do vacúolo fagocítico, portanto, a presença de

uma proteína típica de procariotos nessa membrana parece contraditória.

No entanto, o estudo detalhado da membrana do vacúolo que envolve

parasitos, como Trypanosoma, Toxoplasma etc. mostrou que é comum

a inserção de proteínas do parasito na membrana do vacúolo.

2) A presença de cardiolipina, fosfolipídeo típico de procariotos,

formado na própria mitocôndria a partir de duas fosfatidilcolinas.

3) A presença de DNA circular em múltiplas cópias, sem histonas.

4) A presença de RNA transportador semelhante ao de procariotos.

5) A presença de ribossomos semelhantes aos de procariotos.

6) A síntese de proteínas começando sempre por formil-metionina.

A tentação de considerar a hipótese verdadeira é grande, não?

Mas ainda é preciso explicar algumas divergências, como as diferenças

no código genético, que não é semelhante ao de eucariotos, mas também

não é semelhante ao de procariotos.

Mitocôndrias sempre se originam de outras mitocôndrias, que

aumentaram de tamanho e depois sofreram fi ssão. Apesar de possuírem

o próprio DNA e ainda manterem os processos de replicação, transcrição

e tradução, poucas proteínas e RNAs estão codifi cadas pelo genoma da

própria organela, tornando-as dependentes do genoma nuclear e dos

mecanismos de síntese e transporte citoplasmáticos. Durante a evolução,

a relação simbiótica aprofundou-se, envolvendo a transferência de genes

do simbionte para o núcleo do eucarioto hospedeiro. Essa transferência

foi lenta, durante milhões de anos, porque, além de serem transferidos

para o núcleo, os genes precisam se adaptar aos mecanismos de replica-

ção e controle de expressão gênica dos eucariotos, incorporando-se ao

genoma de maneira estável e produzindo mRNA capaz de ser lido e de

conter em si mesmo o sinal de direcionamento para mitocôndria. Assim,

as mitocôndrias se tornaram totalmente dependentes do hospedeiro,

deixando de ser um simbionte para se tornar uma organela. Como o

processo de transferência gênica é unidirecional, são considerados mais

evoluídos os genomas mitocondriais menores, que já transferiram mais

genes, como o genoma mitocondrial humano.

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De que procarioto as mitocôndrias e os cloroplastos descedem?

Certamente, a relação simbiótica entre eucariotos e mitocôndrias

é mais antiga e data de um período anterior à separação entre animais e

plantas. Acredita-se que o evento endocítico que incorporou as mitocôn-

drias aos eucariotos data de cerca de 1,5 x 109 anos, quando os níveis de

oxigênio na atmosfera aumentaram. Comparando as seqüências gênicas,

as mitocôndrias parecem ter se originado de bactérias púrpura; e os

cloroplastos, muitos anos depois, com animais e vegetais já separados

evolutivamente, de bactérias fotossintéticas (Figura 26.15).

Figura 26.15: A árvore filogenética da provável evolução de mitocôndrias e cloroplastos e seus ances- trais procariotos.

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EXERCÍCIOS

1. As mitocôndrias de todos os tipos celulares são morfologicamente iguais?

2. Como se organiza estruturalmente a mitocôndria?

3. Quais as principais características da membrana mitocondrial externa?

4. Quais as principais características da membrana mitocondrial interna?

5. Quais as principais características do espaço intermembranas?

6. Quais as principais características da matriz mitocondrial?

7. Por que as mitocôndrias representaram um grande salto evolutivo para os seres euca-

riontes?

8. Como se distribuem as mitocôndrias em uma célula?

9. Como é feita a importação de proteínas mitocondriais cujos genes se encontram no

núcleo?

10. Por que se acredita que as mitocôndrias resultam de uma relação simbiótica entre uma

bactéria e uma célula eucarionte primitiva que a fagocitou?

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