Praticas de Biotecnologia - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Praticas de Biotecnologia - Apostilas - Biotecnologia_Parte1, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo dos fundamentos de fotometria e espectrometria de absorção, principios gerais, Leis da fotometria.
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PRÁTICA No 1 - ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DAS PROTEÍNAS

uff UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

GCM

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

1

PRÁTICA No 1 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO

1. Princípios gerais

O termo espectro foi utilizado inicialmente por

Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao

atravessar um prisma, é dividida em várias cores.

Atualmente, sabe-se que o espectro visível é apenas uma

pequena parte do espectro eletromagnético. A luz é,

portanto, definida como uma forma de energia

eletromagnética, formada por ondas que apresentam

comprimentos diferentes. O comprimento de onda (λ) é

medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10-9 m. A tabela

abaixo mostra as regiões do espectro em relação ao

comprimento de onda:

REGIÃO: (λ) EM nm: Raios X 0,1-100 Ultravioleta 100-400 Visível 400-800 Infravermelho 800-5000 Microonda 5000-30000

A cor dos objetos é devida a duas causas:

reflexão e absorção. Assim, um papel transparente,

vermelho, recebe todos os λ da luz branca, mas reflete e

transmite somente o vermelho, sendo o restante

absorvido. Quando um objeto é da cor branca, todos os

λ são refletidos, se é negro, é porque, praticamente,

todos os λ são absorvidos. No entanto, existe uma cor

(ou λ) que é mais absorvida, a qual corresponde à

chamada cor complementar. Se uma solução absorve na

faixa de 435-480 nm, que corresponde à radiação azul, a

sua cor (cor complementar) será o amarelo; a sensação

visual do amarelo será dada pelo conjunto de todos os

outros componentes da luz branca, que não foram

absorvidos. A tabela abaixo mostra as cores de cada

intervalo de radiação da faixa do visível e as suas

respectivas cores complementares:

A capacidade que as diversas substâncias

químicas têm de absorverem luz em determinados

comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua

determinação quantitativa e qualitativa, uma vez que o

espectro de absorção é característico para uma

determinada substância e a quantidade de absorção

(intensidade) é dependente da concentração do

composto.

A intensidade da radiação transmitida por uma

solução pode ser determinada em aparelho (fotômetro),

que deverá ser constituído de: uma fonte luminosa, um

seletor de λ (filtro ou prisma), um compartimento para a

amostra, uma célula fotoelétrica (ou fototubo) e um

sistema para amplificação e medida do sinal (corrente

elétrica) proveniente da célula fotoelétrica (medidor de

potencial elétrico = potenciômetro). Pode-se selecionar

o comprimento de onda que incidirá sobre a solução

usando-se um monocromador (prisma ou retículo de

difração) ou um filtro óptico (vidro colorido ou quartzo,

que transmite uma determinada faixa deλna região do

ultravioleta, UV). Se o aparelho dispõe de filtro óptico,

é denominado fotômetro ou fotocolorímetro e se dispõe

de prisma ou retículo é denominado de

espectrofotômetro. Este último é muito útil, pois pode

selecionar faixas de comprimentos de onda

INTERVALO

(nm)

COR

ABSORVIDA

COR

COMPLEMENTAR

380-435 violeta Verde-amarelada

435-480 azul amarela

480-490 azul esverdeada alaranjada

490-500 verde azulada vermelha

500-560 verde púrpura

560-580 Verde- amarelada violeta

580-595 amarelada azul

595-650 alaranjada Azul-esverdeada

650-780 vermelha verde-azulada

2

extremamente estreitas, nas regiões do UV, visível e

infravermelho (IV).

A fotometria de absorção, portanto, presta-se

tanto para a medida da concentração de compostos

naturalmente corados, como daqueles incolores, mas

passíveis de adquirirem cor mediante o emprego de

certos reativos, bem como de compostos incolores que

absorvem UV ou IV. Esta metodologia, por conseguinte,

tem largo emprego na química analítica quantitativa.

Alguns poucos exemplos: na determinação de atividade

enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em

fluidos biológicos, como glicose, uréia, proteínas, etc.,

em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de

uma reação química, ou um produto incolor que absorva

na região do UV ou do IV. Ensaios imunológicos

quantitativos (como o ELISA: Enzyme-Linke

ImmunoadSorbent Assay) também usam a fotometria.

1.1. Leis da fotometria

O princípio básico da fotometria é baseado no

fato de que: partículas dispersas ou dissolvidas em uma

solução interferem seletivamente com um raio de luz

que passa através desta solução. Esta interferência

depende dos seguintes fatores:

a) cor do composto ou do tipo de ligação química

presente;

b) tamanho da partícula;

c) transparência da solução;

d) combinação dos fatores acima.

Deste modo, as partículas podem absorver e

transmitir parte do espectro, dependendo da sua

concentração, da sua natureza química e/ou da sua cor.

Se pudermos medir o total de luz que incide (Io ) sobre a

solução de uma determinada substância e o total da luz

transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substância

absorveu (absorvância: A) O esquema abaixo mostra

como funciona um fotômetro ou um espectrofotômetro:

A seguinte formulação pode ser feita:

Transmissão = It / Io (luz transmitida / luz incidente).

Observe que o termo transmissão tem aplicação

limitada, uma vez que, a It é I0 menos a luz que é

absorvida não só pela substância que se deseja medir,

mas também pelo solvente, pelo material da cubeta e por

outras substâncias aí existentes. Assim, It é a luz

transmitida após as absorções pela substância de

interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito,

admite-se It =1 (100% de Transmitância) a luz

transmitida após I0 atravessar a cubeta contendo uma

solução denominada branco. Este branco contém todos

os componentes do meio, exceto a substância a ser

medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o

fototubo (fotocélula), a Transmitância = 0, ou seja, não

há luz transmitida a ser medida.

Na prática, a transmitância (T), que é medida

em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco

na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é

substituída pelo valor de densidade óptica (D.O.) ou

absorvância (A), termo mais aceito atualmente, que

corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância:

A = log 1/T

A absorvância é, desta forma, medida em uma

escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relação da A

com a concentração da substância pode ser

compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a

absorvância de uma solução é proporcional à

concentração da substância na solução e à distância

percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a solução

(caminho óptico): A = ε. l.c,

onde:ε = coeficiente extinção molar, que é constante

para cada substância, e definido como a absovância (A)

de uma solução l molar da substância em um

determinado comprimento de onda (λ), numa cubeta de

caminho óptico l = l cm (largura da cubeta) e c = à

concentração da solução.

3

Observe, portanto, que a absorvância é uma

função linear da concentração. Assim, para uma mesma

substância, considerando-se o caminho óptico constante,

a A é diretamente proporcional à concentração desta

substância. No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem

sem pre são obedecidas. Algumas desobediências são

conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na

natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos

baixos das concentrações das soluções, etc. Também as

presenças de ácidos, bases e sais na solução podem

contribuir para essas desobediências, por estarem mais

completamente dissociados, à medida que aumenta a

diluição, visto que absorção da luz pelos íons é diferente

daquela apresentada pelas moléculas não ionizadas. Para

se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, deve-

se trabalhar com soluções mais diluídas e construir,

previamente, uma curva padrão, em que são usadas

concentrações conhecidas (e crescentes) da substância

em análise, e verificar as absorvâncias no comprimento

de onda indicado e na cubeta de caminho óptico

adequado. Desta forma, teremos os limites de

concentração nos quais a solução obedece às Leis de

Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o

emprego da curva padrão, podemos, também,

determinar a concentração de uma solução problema. O

comprimento de onda (λ) usado para a obtenção da

curva padrão é obtido pela preparação do espectro de

absorção da substância em estudo e é, normalmente, oλ

onde a absorvância para a substância apresenta o valor

máximo.

2. Objetivos

• Determinar o espectro de absorção de uma solução

de permanganato de potássio;

• Caracterizar o comprimento de onda (λ) onde ocorre

absorção máxima;

• Construir uma curva padrão do permanganato de

potássio.

3. Reagentes

• Solução de KMnO4 3 mg /100 mL.

4. Procedimentos

4.1. Procedimentos gerais de ajuste do fotômetro

• Ligar o aparelho;

• Selecionar o comprimento de onda adequado.

• Ajustar o zero de transmitância;

• Introduzir a cubeta com o branco (água destilada) e

ajustar a 100% de transmitância, no botão

correspondente;

• Repetir os ajustes acima.

Obtenção do espectro de absorção:

• Ajustar o comprimento de onda inicialmente em 450

nm;

• Ajustar o 100% de transmitância com o branco. Isto

coincide com o 0 de absovância;

• Colocar a cubeta com a solução de permanganato de

potássio à concentração de 3 mg/100 mL;

• Ler a absorvância e registrá-la;

• Ajustar o λ a 490 nm, repetir o ajuste do branco,

recolocar a solução de permanganato e ler,

novamente, a absorvância correspondente a este λ;

• Repetir estas operações para os seguintes valores de

λ: 530, 570 e 610;

• Fazer o gráfico do espectro de absorção do

permanganato em papel milimetrado, relacionando

absorvância (ordenada) contra λ (abcissa);

• Determinar o λ de absorção máxima.

λ A

450

490

4

530

570

610 Dados:

1) Espectrofotômetro: TURNER, modelo 330.

2) Solução: KMnO4 ( 3 mg/ 100 mL ).

3)λ - Comprimento de onda.

4) A - Absorvância. 4.2. Curva padrão - Obtenção

• Preparar soluções de permanganato de potássio nas

concentrações citadas na tabela abaixo:

Concentração de

KMnO4 (mg/100mL) Absorvância

3,00

2,00

1,50

1,00

0,75

0,50

• Ler as absorvâncias das diferentes soluções de

permanganato (λ : 530 nm) e registrá-las;

• Construir, em papel milimetrado, a curva padrão

(absorvâncias na ordenada e concentrações na

abcissa), considerando os pontos zero de absorção e

de concentração.

5. Questões para discussão

5.1- Você dispõe dos filtros azul, verde, vermelho e

amarelo de um fotômetro. Qual deles você usará, para

que uma solução de cor vermelha tenha uma absorção

(contra o branco) o mais próximo de zero possível?

5.2- Avalie, nas condições experimentais acima, se o

permanganato de potássio segue, estritamente, as Leis

de Lambert-Beer, admitindo que nada interferiu em seu

procedimento.

5.3- Explique por que não se deve usar cubetas de vidro

para leituras na região do ultravioleta..

6. Questões complementares

6.1 – Você pesou l, 2 e 3 mg de permanganato de

potássio e dissolveu cada uma quantidade em 50 mL. As

absovâncias destas soluções, em 530nm, foram,

respectivamente, 0,2, 0,4 e 0,6. A abosvância de uma

solução desconhecida do sal foi 0,3. Calcule a sua

concentração, em mg/100mL.

6.2 – Para a dosagem da glicose do sangue de um

paciente, a amostra foi diluída em 10 vezes (no processo

de desproteinização). 1mL do desproteinizado e 2mL de

cada um dos padrões de glicose (P) de 10, 20 e

30mg/100mL foram processados para a dosagem da

glicose, sendo o volume final, em todos os tubos,

ajustados para 5mL. Após as leituras

espectrofotométricas em comprimento de onda

adequado, as absorvâncias obtidas foram:

Amostra...................... ...0,180

P-10 mg/100mL............. 0,150

P-20 mg/100mL..............0,298

P-30 mg/100mL..............0,400.

Qual a concentração da glicose no sangue do paciente?

6.3 - O coeficiente de extinção molar (ε) de uma

substância de peso molecular 200 é 14,5. Uma solução

desta substância apresentou , numa cubeta de caminho

óptico de 2 cm, a absorvância de 0,800. Qual a

concentração (em mg/L) da substância nesta solução?

5

PRÁTICA No 2 - ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DAS PROTEÍNAS

1. Introdução

As proteínas, excluindo a água, são os

compostos químicos mais abundantes nos organismos,

com extrema versatilidade de conformações e funções.

O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos

leva, invariavelmente, ao estudo de proteínas. Portanto,

torna-se importante a existência de métodos adequados

de purificação e quantificação destes compostos. A

purificação e caracterização de uma proteína baseiam-se

em suas características físico-químicas. Por serem

formadas por aminoácidos e considerando-se que os

aminoácidos aromáticos absorvem luz na região

ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser

detectadas através da absorção de luz a 280 nm. No

entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos

envolve reações específicas com determinados reativos,

os quais originam substâncias coloridas que absorvem

luz na região visível, permitindo a sua quantificação.

Dentre os métodos utilizados, situa-se o método do

biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em

meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e

peptídeos (no mínimo tripeptídeos). O nome do método

provém do fato de que a uréia aquecida a 180oC dará

reação positiva com desprendimento de amônia:

NH3

NH2

N H

H

H

H N

NH2 NH2

BIURETO

0 C

0 C

0 C

N

NH2

H 0 C

URÉIA

Quando a substância contém duas ou mais

ligações peptídicas, produz uma cor azul-violeta com o

reativo de biureto. Esta cor desenvolvida é devida a um

complexo entre o íon cúprico e duas cadeias peptídicas

adjacentes:

NH

C O

RCH

HR C

OCHN

0 C NH

CR H

CO NH

CHR

Cu+2

Dependendo dos aminoácidos que fazem parte

das proteínas (estrutura primária), podem-se ter

diferenças fisico-químicas individuais entre proteínas

numa mistura, as quais podem ser utilizadas para a

separação e purificação destes compostos. Por exemplo,

métodos cromatográficos podem ser baseados em

diferenças no peso molecular e/ou carga elétrica.

As proteínas são macromoléculas coloidais,

possuem uma camada de solvatação ou hidratação. Ao

seu redor interagem moléculas de água, que permitem a

sua solubilidade. Diversas substâncias, entre elas os sais

inorgânicos ((NH4)2SO4, Na2SO4 e outros) podem

alterar a camada de solvatação de proteínas, aumentando

(“salting-in”) ou diminuindo (“salting-out) a

solubilidade.

As proteínas possuem estruturas espaciais bem

definidas que, segundo o nível de complexidade, podem

ser caracterizadas como estruturas secundária, terciária e

quaternária. A função biológica está associada à

estrutura espacial, que, por sua vez, depende da

estrutura primária (a simples disposição dos

aminoácidos na cadeia polipeptídica). Certos agentes

podem alterar a conformação espacial original das

proteínas, sem que ocorra alteração da estrutura

primária, modificando, desta forma, algumas de suas

propriedades biológicas. Este efeito, chamado de

desnaturação, pode ser produzido pelo aumento da

6

temperatura do meio, alteração do pH ou pela adição de

solventes orgânicos. A alteração da estrutura primária

das proteínas (quebra das ligações peptídicas) ocorre

por tratamento à quente (100oC) em presença de ácido

ou base forte ou através de adição de enzimas

proteolíticas. Determinados agentes podem ser usados

na precipitação de proteínas, o que é útil na

desproteinização de materiais biológicos, como o

sangue: ânions de ácidos complexos (tricloroacético,

tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis onde a

proteína funciona como cátion; metais pesados (cobre,

zinco, prata, mercúrio) em meio alcalino formam

precipitados onde a proteína atua como ânion.

Os aminoácidos componentes de uma proteína

podem ser genericamente caracterizados se, após sua

hidrólise, efetuarmos a reação da ninhidrina. A

ninhidrina (hidrato de tricetoidrindeno) reage com

aminoácidos produzindo cor púrpura. É uma reação

inespecífica quanto à identidade do aminoácido, sendo a

reação dependente da presença de grupos amina livres.

O aminoácido prolina, na verdade um iminoácido, ao

reagir com a ninhidrina produz coloração amarela.

2. Objetivos

• Realizar reação específica para detecção de

proteínas (reação do Biureto);

• Realizar reação específica de detecção de

aminoácidos (reação com a ninhidrina);

• Verificar a alteração de solubilidade de proteínas em

presença de soluções salinas e solventes orgânicos;

• Verificar a ação de agentes desnaturantes;

• Observar a separação cromatográfica (cromatografia

de exclusão molecular) de substâncias de pesos

moleculares diferentes.

3. Reagentes

• Reagente do Biureto: CuSO4 em solução alcalina.

• Solução diluída de proteínas.

• Solução concentrada de proteínas.

• Solução de ninhidrina 0,1g% (P/V).

• Solução de aminoácidos.

• Ácido tricloroacético (TCA ) 10% (P/V).

• Solução saturada de sulfato de amônio (NH4)2 SO4.

• Solução tampão de fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0.

• Etanol gelado.

• Resina Sephadex G-25 (faixa de separação PM

1000-5000 D).

• Solução contendo compostos de diferentes pesos

moleculares (azul de dextran: 2.000.000 D, vitamina

B12: 1355 D em tampão pH 7,0, contendo sacarose).

4. Procedimentos

Enumerar 12 tubos de ensaio

4.1. Reação do Biureto:

• Tubo 1 (tubo branco): colocar: 1 mL do reativo do

Biureto + 0,5 mL de água destilada;

• Tubo 2: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5

mL da solução diluída de proteínas;

• Tubo 3: colocar: 1 mL do reativo do Biureto + 0,5

mL da solução de aminoácidos;

• Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.

4.2. Reação da ninhidrina:

Aquecer água à 100oC

• Tubo 4 (tubo branco): colocar 2 mL da solução de

ninhidrina + 0,5 mL de água destilada;

• Tubo 5: colocar 2 mL da solução de ninhidrina + 0,5

mL da solução diluída de proteínas;

• Tubo 6: colocar 2 mL da solução de ninhidrina + 0,5

mL da solução de aminoácidos;

• Ferver os tubos de ensaio 4, 5 e 6 por 5 minutos;

• Comparar o desenvolvimento de cor nos tubos.

4.4. Precipitação ácida:

7

• Tubo 7 (tubo de centrífuga): colocar 1 mL de TCA

10% (P/V). + 1 mL da solução diluída de proteínas;

• Agitar e observar;

• Centrifugar (por 10 minutos), separando as frações

sobrenadante e precipitado;

• Colocar 0,5ml do sobrenadante no Tubo 8;

• Adicionar 1mL do reativo do biureto ao Tubo 8;

• Adicionar tampão ao precipitado do Tubo 7. Agitar;

• Comparar os resultados.

4.5. Efeito da adição de sais:

• Tubo 9: Colocar 2 mL da solução diluída de

proteínas + 2 mL da solução saturada de sulfato de

amônio. Agitar. Centrifugar à 3000rpm por 10

minutos, separar as frações sobrenadante e

precipitado;

• Colocar o sobrenadante no tubo 10. Adicionar igual

volume de TCA 10% (P/V)., agitar e centrifugar

novamente. Se aparecer algum precipitado, tentar

dissolvê-lo com 1 mL de tampão;

• Adicionar 1 mL de tampão ao precipitado do tubo 10

e agitar. Verificar o que acontece.

4.6. Efeito da adição de solventes orgânicos:

• Tubo 11: colocar 1mL da solução de proteínas +

2mL de etanol gelado (lentamente até o

aparecimento de uma ligeira turvação).

4.7. Cromatografia em peneira molecular:

Montagem da coluna: numa coluna de vidro (aprox. 30

x 1,5 cm), colocar o gel suspenso em tampão pH 7,0,

deixando a extremidade inferior da coluna aberta, até

que o gel se acame. Cuidado para não deixar secar o gel,

adicionando sempre tampão, até que o gel esteja

equilibrado e acamado.

Aplicação da amostra: aplicar 1mL da amostra sobre a

superfície da coluna, que deverá estar com cerca de 2

cm de tampão sobre o gel. Como a amostra está mais

densa, devido à presença da sacarose, esta se depositará

sobre o gel.

Continuar adicionando o tampão e acompanhar o

fracionamento dos componentes da amostra, anotando

os resultados.

5. Questões para discussão:

5.1- Explique o que ocorreu em cada etapa executada.

5.2- Pelos resultados obtidos no item 4.5, podemos

afirmar que a solução de sulfato de amônio saturado

precipita todas as proteínas? Por quê? Como podemos

saber se esta precipitação é reversível ou não?

5.3.- Pelos resultados obtidos no item 4.6, podemos

afirmar que o etanol gelado precipita todas as proteínas?

Por quê? Como poderíamos comprovar isto? O

precipitado obtido (após centrifugação) seria

redissolvido em tampão? Por quê?

5.4 - Qual foi a ordem de eluição das amostras na coluna

(item 4.7)? Por quê?

6 - Exercícios complementares:

6.1- Você dispõe num laboratório de dois frascos

idênticos, porém, não rotulados. Um deles contém

solução de aminoácidos e, o outro, contém uma solução

de proteínas. Qual seria o seu procedimento para

identificar as duas soluções e rotular os frascos?

6.2- Descrever um método que permita separar a

proteína no 6 de uma mistura que contenha seis

proteínas, sabendo-se que: a) as proteínas de no 1, 3 e 5

precipitam pelo sulfato de amônio a 40% de saturação;

b) as proteínas de no 1, 2, 4 e 6 precipitam pelo etanol

gelado; c) as proteínas de no 1, 3, 5 e 6 precipitam pelo

sulfato de amônio a 75% de saturação; d) os pontos

isoelétricos das proteínas 1 e 3 são iguais a 6,5 ; o da

proteína 2 é 7,2; o das proteínas 4 e 6 se igualam a 6,3 e

o da proteína 5 é 6,8.

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