Praticas de Biotecnologia - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Praticas de Biotecnologia - Apostilas - Biotecnologia_Parte2, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo da cinética enzimatica, Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimática, o tempo de reação, a concentração de substrato e a concentração de enzima.
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PRÁTICA No 1 - ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DAS PROTEÍNAS

8

6.3- Num extrato biológico existem hormônios protéicos

e isoenzimas, que devem ser isolados da maneira mais

pura possível para uso posterior. Você dispõe de sulfato

de amônio, TCA, etanol, resinas cromatográficas,

equipamentos cromatográficos e de eletroforese. Que

métodos você poderia utilizar? Explique o seu princípio

e como executá-lo. Que métodos não poderiam ser

utilizados?

6.4- Uma solução a 1% de hormônio anti-diurético

(nonapeptídio) foi submetida aos tratamentos abaixo

com os seguintes resultados: a) reação fortemente

positiva para o biureto e fracamente positiva para

ninhidrina; b) a adição de ácido forte gelado e posterior

neutralização do pH, não alteraram os resultados do

item anterior; c) Com a adição de ácido forte à quente

(100oC por 2 h) e posterior resfriamento e neutralização

do pH , a reação da ninhidrina foi positiva (fortemente

positiva). Interprete e explique estes resultados.

9

PRÁTICA No 3 - CINÉTICA ENZIMÁTICA

1. Introdução

Enzimas são catalisadores biológicos: aceleram a

velocidade das reações químicas, diminuindo a energia

de ativação. Possuem, em geral, estrutura protéica,

sendo que foram descritas algumas moléculas de RNA

com atividade catalítica. As enzimas não alteram a

constante de equilíbrio nem a variação de energia livre

das reações, sendo regeneradas, sob a forma original, ao

final da catálise. As moléculas reagentes são

denominadas substratos (S) e produtos (P) são formados

ao final. As enzimas são, geralmente, bastante

específicas com relação aos substratos, formando um

complexo com estes durante a catálise:

E + S ES E + P

Algumas teorias procuram explicar esta

especificidade: 1- teoria de Fischer (“chave-fechadura”)

, onde enzima e substrato seriam complementares; 2-

teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o

substrato durante a catálise se encaixa na enzima; 3-

teoria que propõe o perfeito encaixe no estado de

transição, estado onde a barreira energética (energia de

ativação) foi vencida.

Diversos são os fatores que influenciam a

velocidade de uma reação enzimática. Por terem

estrutura protéica, alterações no pH, na temperatura, na

força iônica do meio reacional podem modificá-las (ás

vezes, até a estrutura dos substratos é alterada),

modificando, assim, a velocidade das reações. Como

esperado, a concentração de substrato e de enzima no

meio reacional são determinantes para a velocidade

reacional.

A velocidade de uma reação catalisada pode ser

determinada, em instantes iniciais, através da

determinação do produto formado por unidade de tempo

(caso mais comum) ou através da mensuração do

substrato consumido por unidade de tempo. O produto

formado pode ser medido diretamente através de alguma

propriedade físico-química característica, ou então fazer

uma reação química com este produto produzindo um

outro que possua propriedades apropriadas para medida.

Uma propriedade freqüentemente usada para tal fim é a

capacidade do produto a ser quantificado de absorver

determinados comprimentos de onda de radiações

luminosas (o que não deve, em princípio, acontecer com

qualquer outra substância encontrada no meio

reacional), aplicando-se os princípios da fotometria.

Os ensaios de atividade enzimática

desenvolvidos na aula prática serão realizados com a

enzima FOSFATASE, presente no extrato aquoso da

batata inglesa. No ensaio, a enzima catalisará a reação

de desfosforilação do para-nitrofenil fosfato, resultando

na formação de um composto de cor amarelada em meio

alcalino, o para-nitrofenol. Portanto, a atividade

enzimática será detectada pelo aparecimento da

coloração amarela no meio reacional.

2. Objetivos

Avaliar o efeito de alguns fatores que interferem na atividade enzimática, tais como, o tempo de reação, a

concentração de substrato e a concentração de enzima.

10

3. Reagentes

• Uma batata inglesa média (cerca de 110g). • Substrato: para-nitrofenilfosfato de sódio 1mM

(solução fresca). • NaOH 0,02N. • Liquidificador.

4. Preparo de fração com atividade de fosfatase

alcalina

• Descascar a batata;

• Homogeneizar a batata descascada em 200mL de

água, usando um liquidificador;

• Filtrar o homogeneizado em algodão.

IMPORTANTE: O homogeneizado deve ser usado

no prazo máximo de 30 minutos.

5. Procedimentos

• Enumerar os tubos de ensaio que seu grupo vai usar;

• Colocar sempre os reagentes na mesma ordem em

todos os tubos;

O HOMOGENEIZADO DEVERÁ SER

ADICIONADA SEMPRE POR ÚLTIMO.

• Após adicionar o homogeneizado, agite a mistura

suavemente;

• A incubação será realizada à temperatura ambiente.

5.1. INFLUÊNCIA DO TEMPO DE REAÇÃO

TUBO SUBSTRATO (mL) ÀGUA (mL)

HOMOGENEIZADO (mL)

Tempo após a adição de 2mL de NaOH 0,02N (min)

1 3,0 2,0 0,5* 0 2 3,0 2,0 0,5 2 3 3,0 2,0 0,5 5 4 3,0 2,0 0,5 10 5 3,0 2,0 0,5 20 6 3,0 2,0 0,5 30

*Adicionar 2mL de NaOH 0,02N antes da adição do homogeneizado (SOMENTE NO TUBO 1)

• Observe a cor desenvolvida em todos os tubos.

• Anote os resultados.

5.2. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

TUBO SUBSTRATO (mL) ÁGUA (mL) HOMOGENEIZADO

(mL) 7 3,0 1,0 0,0 8 3,0 0,9 0,1 9 3,0 0,5 0,5

10 3,0 0,0 1,0

Após 5 minutos de reação, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo.

Observe a cor desenvolvida nos tubos (7-10). Anote os resultados.

5.3. INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO. (curva [S] x velocidade da reação)

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Após 10 minutos de reação, adicione 2mL de NaOH 0,02N em cada tubo.

Observe a cor desenvolvida nos tubos (11-16). Anote os resultados.

6. Questões para discussão:

6.1- Por que a enzima (homogeneizado) só deve ser

adicionada por último?

6.2- Como são fixadas as condições de dosagem de uma

determinada enzima em condições ótimas?

6.3- Explique os resultados de cada item.

7. Exercícios complementares

7.1- A variação da velocidade de reação de uma enzima

em função de sua concentração foi analisada em 5 tubos

conforme o indicado na tabela abaixo. Cada tubo

recebeu 0,8 mL de uma solução de substrato 0,01mM. A

enzima usada (E) estava contida num homogeneizado

hepático a 10g% e na tabela abaixo estão indicados os

volumes deste homogeneizado adicionado a cada tubo.

O volume final em cada tubo foi o mesmo, ajustado com

tampão apropriado. Ao final de 30 minutos de reação a

quantidade de produto formado foi igual em todos os

tubos, exceto no tubo 5 que foi mantido a 0oC durante

toda a experiência. Com estas informações, discuta:

a) o fato de ter sido obtida a mesma quantidade de

produto nos quatro primeiros tubos;

b) sem alterar o tempo de reação, como seria possível

aumentar a quantidade de produto formado nesses

quatro tubos?

c) o que teria acontecido no tubo 5?

7.2 - Ao estudar-se “in vitro” a cinética da reação onde a

formação do produto P (fumarato), a partir do substrato

S (succinato) é catalisada pela enzima E (succinato

desidrogenase) verificou-se que:

I) não sendo possível obter-se a enzima pura, usou-se,

sempre, um mesmo volume do mesmo extrato celular;

II) a quantidade de substrato inicial estava em ligeiro

excesso; III) o pH tinha sido previamente estudado e

escolheu-se aquele que proporcionava o máximo de

atividade enzimática; IV) a formação de produto cresceu

entre o instante zero (início da reação) até 20 minutos da

reação; V) a partir do 20o minuto de incubação, a

velocidade de reação medida pela quantidade de

produto formado por minuto, diminuiu.

VI) todas as observações acima foram obtidas em

temperatura ótima de reação.

Pede-se: discutir os fatores, dentre aqueles

analisados, que poderiam acarretar a diminuição da

velocidade a partir do 20o minuto de incubação.

TUBO SUBSTRATO µM SUBSTRATO

(mL) ÁGUA (mL) HOMOGENEIZADO (mL)

11 0,0 0,0 5,0 0,5 12 54,5 0,3 4,7 0,5 13 163,0 0,9 4,1 0,5 14 272,0 1,5 3,5 0,5 15 545,0 3,0 2,0 0,5 16 909,0 5,0 0,0 0,5

TUBO ENZIMA (mL)

1 0,2 2 0,4 3 0,6 4 0,8 5 0,8

12

PRÁTICA No 4 – URINÁLISE 1. Introdução

Os rins desempenham suas funções mais

importantes ao filtrarem o plasma sangüíneo e

removerem as substâncias do filtrado em quantidades

variáveis, dependendo das necessidades do corpo. Além

disso, eles “depuram” as substâncias indesejáveis do

filtrado (e, portanto, do sangue), ao excretá-las na urina,

enquanto devolvem ao sangue as substâncias

indispensáveis ao metabolismo. A intensidade de

excreção de diferentes substâncias na urina representa a

soma de três processos renais: filtração glomerular,

reabsorção de substâncias dos túbulos renais para o

sangue e secreção de substâncias do sangue para os

túbulos renais.

A urina normal é essencialmente composta de

água, tem coloração variável entre o incolor e o amarelo

(dependente da dieta, atividades físicas e principalmente

da ingestão de água), e carreia substâncias de excreção,

resultantes do metabolismo do organismo. Todo sangue,

ao passar pelos rins, é filtrado ou depurado, eliminando

seus catabólitos, que são veiculados pela água.

Entretanto, podem aparecer na urina elementos

anormais, como: albumina, glicose e altas quantidades

de corpos cetônicos, sais e pigmentos biliares

(urobilinogênio e urobilina). A análise da urina fornece

valiosas informações no diagnóstico de doenças renais,

das vias urinárias, do trato genital e até de doenças

sistêmicas.

Esta prática refere-se a dois dos exames de rotina

de urina, através dos quais é possível observar o

metabolismo anormal envolvendo algumas substâncias

como a glicose e os corpos cetônicos.

Em condições normais, não aparece glicose na

urina em quantidade detectável pelos reagentes

convencionais, visto que, praticamente, toda a glicose

filtrada é reabsorvida pelos rins. Entretanto, quando a

carga filtrada excede a capacidade de reabsorção da

glicose, a sua excreção urinária se dá em nível

detectável. Um grande aumento da concentração

plasmática de glicose, capaz de elevar a carga de

filtração renal acima de 320 mg/minuto, ocasiona a

excreção do excesso de glicose na urina. A glicose

plasmática no indivíduo sadio quase nunca fica elevada

o suficiente para causar a sua excreção pela urina. A

glicosúria (presença de glicose na urina) pode estar

relacionada a várias causas, como, por exemplo: fatores

endócrinos, hepáticos, neurológicos e alimentares. No

diabetes mellitus não-controlado, o nível plasmático de

glicose pode atingir valores elevados, com conseqüente

excreção urinária desta ose. A presença de glicose na

urina pode ser evidenciada através da redução alcalina

pelo cobre. Portanto, utiliza-se para a pesquisa de

glicose na urina o reagente de Benedict, que consiste de

uma solução de sulfato de cobre em um meio alcalino.

Os chamados corpos cetônicos (acetoacetato,

ácido β-hidroxibutírico e acetona), quando presentes em

níveis elevados na urina, indicam um quadro de jejum

severo e prolongado ou diabetes mellitus não tratado.

Em condições normais, o ácido acetoacético e o ácido

β-hidroxibutírico que entram na corrente sangüínea são

transportados, tão rapidamente, para os tecidos, que suas

concentrações plasmáticas, combinadas, raramente se

elevam acima de 3 mg/dL. Os corpos cetônicos são

liberados do fígado e transportados até as células.

Todavia, as células são limitadas, quanto à quantidade

de corpos cetônicos que podem oxidar, devido a várias

razões, dentre as quais pode-se destacar a quantidade de

oxaloacetato que é necessário para iniciar a oxidação de

Acetil-CoA no ciclo do ácido cítrico. Os corpos

cetônicos no sangue e na urina podem atingir níveis

13

extraordinariamente altos, provocando uma condição

conhecida como: cetonemia e cetonúria,

respectivamente. A pesquisa de corpos cetônicos na

urina é realizada através do reagente de Imbert. Este

reativo é de uma solução de nitroprussiato de sódio em

ácido acético glacial.

2. Objetivo

Analisar amostras de urina, quanto à presença ou

ausência de glicose e de corpos cetônicos.

3. Reagentes

• 8,5 mL de urina.

• 2,5 mL de Reativo de Benedict ( CuSO4; citrato de

sódio e Na2CO3).

• 1 mL de Reativo de Imbert ( nitroprussiato de sódio

e ácido acético glacial).

• 3 mL de NH4OH 10% (p/v).

4. Procedimentos 4.1. Pesquisa de Glicose • colocar 2,5 ml do Reativo de Benedict em um tubo

de ensaio;

• depositar 4 gotas de urina límpida;

• misturar e levar ao banho-maria até entrar em

ebulição;

• deixar esfriar espontaneamente (aproximadamente

15 minutos);

• observar a coloração do líquido.

RESULTADOS

cor inalterada (azul) negativo verde-azulado ou verde traços

verde (qualquer tom) com precipitado amarelo

positivo +

castanho ou marrom positivo ++

vermelho tijolo positivo +++ 4.2. Pesquisa de Corpos Cetônicos

• colocar 8 ml de urina em um tubo de ensaio;

• adicionar 12 gotas do Reativo de Imbert e misturar;

• inclinar o tubo e com o auxílio de uma pipeta, deixar

escorrer pelas paredes do tubo aproximadamente 3

ml de NH4OH 10%, lentamente, de tal maneira que

os dois líquidos não se misturem;

• observar a superfície de contato entre os dois

líquidos.

5- Questões para Discussão 5.1- Comente (sucintamente) a participação dos

hormônios: adrenalina, cortisol, glucagon e insulina no

controle da glicemia, envolvendo as vias metabólicas e

os seus mecanismos de ação.

5.2- Por que em condições de jejum severo e

prolongado ou o diabete melito não compensado pode

acarretar uma cetonemia e conseqüente cetonúria?

5.3- Conceitue e diferencie (metabolicamente):

diabetes insipidus” e “diabetes mellitus” e “diabetes

renallis”.

PRÁTICA No 5 - ISOLAMENTO DE DNA DE CÉLULAS DE CEBOLA

RESULTADOS

Nenhuma alteração ocorrida negativo

Presença de um anel violeta positivo

14

1. Introdução

Nos organismos eucariontes e procariontes a

informação genética está localizada nas moléculas de

ácido desoxirribonucléico (DNA), que são polímeros de

nucleotídeos, nos quais o açúcar é a desoxirribose. O

DNA está localizado principalmente no núcleo dos

eucariontes, associado com proteínas (principalmente

histonas) e dentro de organelas como mitocôndrias e

cloroplastos.

Os métodos utilizados para a detecção e

dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes (pois o

de cloroplastos e mitocôndrias não é em geral, detectado

pelas técnicas rotineiras) implicam no rompimento das

membranas citoplasmática e nuclear. Neste experimento,

o rompimento das membranas plasmática e nuclear será

realizado com o tratamento do detergente aniônico

duodecil sulfato de sódio (SDS). Os tratamentos com

detergentes, iônicos ou não, são largamente utilizados na

solubilização de proteínas e lipídeos de membrana.

Nestes processos de solubilização por detergentes, são

formadas micelas, que consistem de proteínas, lipídios e

detergentes. O tratamento das células com uma

concentração relativamente alta de SDS resulta no

rompimento das membranas celulares com a

conseqüente liberação das nucleoproteínas. A atividade

da enzima digestiva (DNAase) será inibida pela ação do

EDTA em meio alcalino − que altera pH e quela os íons

divalentes necessários à ação da DNAase. A adição de

etanol sobre a fase aquosa, contendo os ácidos nucléicos

dissolvidos, resultará na precipitação destes, uma vez

que o etanol diminui a constante dielétrica da água,

promovendo uma menor solubilização das moléculas de

DNA.

Nas técnicas de biologia molecular, o DNA

deve estar livre de proteínas, para isto, estas devem ser

extraídas. Normalmente, esse procedimento é realizado

utilizando-se uma solução de clorofórmio/álcool

isoamílico, que desnatura as proteínas e, após

centrifugação, estas são retiradas da solução de DNA.

2. Objetivo

Isolar DNA de células de cebola.

3. Material

• Cebola.

• Solução salina-EDTA:

NaCl 0,15 M

EDTA 0,1 M (pH=8,0).

• SDS 2% (P/V).

• Etanol absoluto 95%.

• Solução Tris-EDTA (TE)*

10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA - pH 7,5.

Obs:

*Esta solução mantém a força iônica, dissolvendo o

DNA, além de quelar íons divalentes, necessários para a

ação da DNase.

4. Procedimentos

• Cortar 5 g de cebola (fatia fina e bem picotada);

• Colocar a cebola picada em um tubo Falcon de 15

mL;

• Adicionar 2.5 mL de solução salina EDTA;

• Adicionar 1.0 mL de SDS 2%;

• Macerar a cebola com ajuda de um bastão de vidro

durante 5 minutos;

• Filtrar a solução com gaze para retirar os fragmentos

de cebola;

• Colocar o filtrado em um tubo de vidro;

• Adicionar, lentamente, com pipeta, 4 mL de álcool

etílico 95% de modo que os dois líquidos não se

misturem. Notar que na interface, forma-se um

material insolúvel filamentoso, o DNA;

15

• Introduzir um bastão até a região de interface.

Imprimir-lhe um movimento circular e verificar que

o material filamentoso irá aderir ao mesmo;

• Retirar o bastão e dissolver o precipitado a ele

aderido em 2 mL da solução de Tris-EDTA.

Desproteinização – (Não realizada durante a aula

prática):

• Após a dissolução do DNA, adicione igual volume

(2 mL) da mistura de clorofórmio:álcool isoamílico

24:1 (V/V), e agite vigorosamente por 30 minutos;

• Centrifugue a emulsão resultante a 3000 rpm durante

10 minutos;

• A emulsão será separada em 3 camadas;

• A camada superior (aquosa) contém os dois tipos de

ácidos nucléicos (DNA e RNA) que devem

coletados para posterior utilização.

5. Questões para discussão:

5.1 - Qual a função da solução de SDS?

5.2 - Ao romper a célula e, também, suas organelas, pela

técnica descrita acima, o DNA não seria degradado por

enzimas lisossomais?

SOLUÇÃO DE DNA

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