Proteína recombinante ECP - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)
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Lula_8514 de Março de 2013

Proteína recombinante ECP - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)

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Apostilas de Bioquímica sobre o estudo da proteína recombinante ECP em E. coli e gel de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida para confirmação da expressão.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI CCO-DONA LINDU – DIVINÓPOLIS – MG Relatório de Práticas em Biologia Molecular

EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE EM E. coli E ELETROFORESE EM GEL DESNATURANTE SDS-PAGE Turma: Bioquímica - 6º período II.INTRODUÇÃO

O sistema de expressão de proteínas heterólogas mais comumente usado é o que utiliza a

Escherichia coli como célula hospedeira. Este sistema é amplamente difundido devido à facilidade e baixo

custo de cultivá-la em condições laboratoriais, e pela reprodutibilidade e abundância de proteína que

produz. Além disso pode suprir de imediato necessidades da pesquisa básica, tais como, produção de

anticorpos e purificação destes por afinidade, sondas em experimentos variados e para estudos

funcionais/estruturais da proteína expressa. Permite, também, a expressão em grande escala, para fins

industriais ou clínicos de enzimas, hormônios, anticorpos, etc., quando a atividade da proteína é

preservada.

A descoberta de promotores e repressores específicos do genoma de E. coli, permitiu a

manipulação da expressão de proteínas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja

expressão pode ser indutível ou contínua.

O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expressão de proteínas heterólogas em E. colié

baseado no operon lac . Neste sistema, o DNA de interesse é clonado em fago ou plasmídeo contendo o

lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para mRNA da b-galactosidase). A

indução da transcrição é obtida pela adição de um análogo de lactose sintético e não degradável

(isopropiltio-b-D-galactosídeo, IPTG), o qual se associa ao repressor e inibe-o, deixando o promotor livre

para a interação com a RNA polimerase e consequente transcrição do gene1.

Deve-se levar em consideração algumas características do inserto e do vetor antes da clonagem

para que seja sintetizada corretamente a proteína de interesse. É necessário respeitar o sinal de tradução

de genes procarióticos(sinal de Shine-Dalgarno), ou seja, o DNA deve ser clonado demaneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador. Além disso, um vetor para expressão em E. coli deve

apresentar uma origem de replicação; um gene que confira resistência a antibióticos; um promotor para

transcrição forte e regulável ;um MSC para facilitar a inserção do gene de interesse na orientação correta e um tag específico que permita a fácil purificação da proteína, no caso a cauda de histidina. A partir de

análises in silico, utilizando ferramentas computacionais específicas, pode-se verificar a existência de

códons não usuais e também de modificações pós-traducionais que ajudarão na melhor escolha do vetor

para a clonagem do inserto de DNA em interesse. Vários vetores encontram-se disponíveis no mercado

para a expressão de proteínas em E.coli. Os mais referidos são da série pET (plasmid for expression by T7

RNA polimerase). A grande vantagem deste vetor é que ele é transcrito pela T7 RNA polimerase, a qual é

muito seletiva e ativa, sendo capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rápido que

a RNA polimerase de Escherichia coli 1.

Para verificar a expressão da proteína ECP, foi realizada a eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida (SDS-PAGE).

A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração de moléculas carregadas, numa

solução, em função da aplicação de um campo elétrico 2. Diferentes suportes podem ser utilizados, na

forma de géis poliméricos, como por exemplo gel de poliacrilamida. Na eletroforese em gel de poliacrilamida

(PAGE) as proteínas migram através dos poros do gel em resposta a um campo elétrico. O tamanho desses

poros diminuem para concentrações crescentes de acrilamida. A facilidade com que as proteínas migram

através do gel é condicionada pelo tamanho dos poros do gel e pelo peso molecular das proteínas 3.

Considerando um determinado tamanho de poro, tem-se que quanto menor for o peso molecular da

proteína mais facilmente ela migrará em relação as proteínas de alto peso molecular. A percentagem de

acrilamida do gel deve ser escolhida tendo em consideração o peso molecular da proteína que se quer

identificar. A solução de acrilamida é estável por mês. Quando estocada por períodos prolongados,

transforma-se em ácido acrílico, que pode causar distorções no gel. É importante frisar que a acrilamida é

fotossensível e neurotóxica, devendo, portanto, ser estocada em frasco escuro e manuseada com o maior

cuidado possível.

Antes de iniciar a eletroforese, as variáveis forma e carga nativa das proteínas devem ser

eliminadas para que a separação dependa de sua massa molecular. Para isso, as proteínas são misturadas

com SDS, um detergente anfipático cuja função é desnaturá-las, ou seja, convertê-las numa estrutura

linear- a forma nativa é geralmente globular- e conferir-lhes densidade de carga uniforme. Na ausência de

SDS, as proteínas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial

de cargas de suas estruturas tridimensionais 2 .

As proteínas são aplicadas no topo do gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente elétrica,

fazendo com que elas migrem através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo. Finalmente,

pode-se visualizar as proteínas no gel corando-as com prata ou com um corante como o Coomassie Blue.

III. OBJETIVO Expressão da proteína recombinante ECP em E. coli e gel de eletroforese em gel desnaturante de

poliacrilamida para confirmação da expressão.

IV. METODOLOGIA A. Expressão de proteína recombinante em E. coli Em um tubo tipo falcon de 50 ml contendo 10 ml de meio LB líquido, foi adicionado 10μl da solução estoque

de ampicilina (100 mM). 1 mL do meio LB, sem ampicilina, foi reservado para ser usado como “blank” no

nanodrop.

Em seguida, 300μl do caldo de bactérias (transformadas com o plasmídeo contendo o gene de interesse)

crescido no dia anterior foi adicionado ao tubo com LB.

O meio foi encubado sob agitação a 37º C e 180 rpm até começar a turvar (aproximadamente 3 horas).

Assim que iniciou-se a turvação, a O.D. 600 (optical density 600nm) foi medida no espectrofotômetro. Para

calibrar o aparelho, usou-se o meio aliquotado em tubo de 1.5ml, “blank”.

A O.D. foi medida a cada 20 min até que ficasse entre 0.6 e 0.8.

Ao atingir a medida correta (entre 0.6 e 0.8) foi coletado 1 ml da cultura e colocar em um tubo nomeado

como TO (não induzido). O mesmo foi guardado em geladeira e teve a OD anotada.

Ao restante da cultura, adicionou-se 9μl da solução estoque (500 mM) do indutor IPTG para atingir uma

concentração final de 0,5 mM IPTG. O tubo foi novamente colocado no Shaker.

Após duas horas, foi separado mais 2 ml dessa cultura e colocado no tubo nomeado T2. A OD foi medida e

anotada. A cultura foi colocada novamento no Shaker.

Após quatro horas, mais 2 ml da cultura foi colocado em tubo nomeado T4. A OD foi medida e anotada.

O restante da cultura foi descartada em Hipoclorito.

Os três tubos (T0, T2 e T4) foram centrifugados por 5 minutos a 146.000 RPM e o sobrenadante foi

descartado em hipoclorito.

O pellet foi ressuspendido em 20μl de tampão de amostra e adicionou-se mais 20 μl de água deionizada.

Após vortexar, foi congelado a -20º C durante uma semana até a próxima aula prática.

B. Eletroforese em gel desnaturante SDS-PAGE Primeiramente, calculou-se a quantidade de amostra de T0, T2 e T4 ser aplicada no gel seguindo a regra

de três inversa:

10 µL - OD 0,8

X µL - OD 1.2

T0 = 10 µL 10 µL – 1,026 10 µL - 1,026

X T2 – 1,786 X T4 - 2,415

X T2 = 10 * 1,026 X T4 = 10*1,026

1,786 2,415

X T2 = 5,745 µL X T4 = 4,248 µL

Para a eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, os tubos foram retirados do congelador e

transferidos para um banho em água fervente por 5 minutos. Após esse tempo, eles foram centifugados a

14.000 RPM por 3 minutos em temperatura ambiente.

Preparou-se 10mL do gel de corrida 10% da seguinte forma:

4 mL de água deionizada

3,3 mL de acrilmida 30%

2,5 mL de Tris 1,5M (pH 8.8)

100 µL de SDS 10%

100 µL de persulfato de amônia

4 µL de TEMED

O persulfato de amônia e o TEMED devem ser adicionados por último.

Após o preparo do gel de corrida aplicar no aparato de 1,5mm de espessura até o nível desejado ( o nível

deverá ter sido marcado com caneta permanente para melhor visualização). Adicionou-se água, com

cuidado para não solubilizar-se ao gel, para melhor nivelamento do gel. Após polimerização do gel, retirou-

se a água e secando com um papel toalha.

Para completar o volume de gel suportado pelo aparato é necessário a adição do gel de empacotamento

(Stacking gel) sobre o gel de corrida. Foi preparado 6 mL desse gel a 5% da seguinte forma:

3,4 mL de água deionizada

0,83 mL de acrilmida 30%

0,63 mL de Tris 1,5M (pH 6,8)

50 µL de SDS 10%

50 µL de persulfato de amônia

5 µL de TEMED

Aplicou-se esse gel (Stacking gel) sobre o gel de corrida e logo em seguida inseriu-se o pente para

formação dos poços.

Montou-se o aparato de eletroforese contendo o tampão de corrida 10X e retirou-se o pente. No primeiro

poço do gel foi aplicado o marcador de peso molecular. No segundo poço, o volume calculado para T0, no

terceiro poço o volume calculado para T2 e no quarto poço o volume para T4. Correu-se o gel a 100V até

que as amostras alcançassem o gel de corrida. Em seguida a voltagem foi aumentada para 120V até que o

marcador azul do tampão de amostra saia. No final da corrida retirou-se o gel cuidadosamente,

transferindo-o para uma solução de Comassie Blue por 30 minutos. Decorrido esse tempo a solução de

Comassie Blue foi substituída pela solução descorante por 30 minutos e depois novamente substituída por

uma nova solução descorante. O gel com as bandas visíveis foi fotograda no Transiluminador.

Soluções: Tampão de amostra 2X (Loading buffer – 2X) Tris/HCl pH 6,8 100 mM

SDS 4,0 %

Azul de bromofenol 0,2%

Glicerol 20,0%

Antes do uso, adicionar dithiotreitol q.s.p. 200 mM (estoque: 1M armazenado a -20°C)

Tampão de corrida 10X Tris 250 mM

Glicina pH 8,3 2,5 M

SDS 1%

Corante coomassie blue (1L) Coomassie blue 2,5g

Metanol 450 mL

Ácido acétido glacial 100 mL

Água Milli-Q 450mL Solução descorante (1L)

Metanol 450 mL

Ácido acético glacial 100 mL

Água Milli-Q 450 mL

V. RESULTADOS

Nas canaletas 6, 7 e 8, correspondentes ao nosso grupo, não houve aparecimento de bandas

características de expressão em T0, T2 e T4. A proteína ECP possui 16 kDa portanto sua banda deve estar

compreendida entre a primeira e a segunda banda do gel, conforme indicado pelas setas.

Foto do gel

Fonte:

Mapa do gel: 1ª canaleta: padrão de peso molecular Broat- Promega

+ tampão de amostra 2X

2ª,3ª e 4ª canaleta: amostras de outro grupo

5ª canaleta: sem amostra

6ª canaleta: 10 µL de T0 + tampão de amostra 2X

7ª canaleta: 6 µL de T2 + tampão de amostra 2X

8ª canaleta: 4,3 µL de T4 + tampão de amostra 2X

9ª canaleta: padrão de peso molecular Broat- Promega + tampão de amostra 2X

Medidas de densidade ótica a 600nm T0 – 1,026

T2 - 1,786

T4 – 2,415

VI. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Primeiramente, fez-se necessário reservar 1mL do meio de cultura 2XYT para ser usado com “blank” no nanodrop a fim de que a OD lida das amostras posteriores seja correspondente apenas ao

número de células presentes, o que aumenta a turbidez do meio.

O tubo correspondente a T0, que continha o caldo de bactérias (crescido no dia anterior)

transformadas com o plasmídeo contendo o gene ecp, cresceu por aproximadamente três horas em shaker

a 37° C satisfazendo a temperatura ótima de crescimento de bactérias mesófilas como a E. coli e a 180 rpm

para melhor homogeneização e aeração do meio.

A OD a 600 nm ideal para T0 está compreendida entre 0,6 e 0,8, momento em que as células

atingiram a fase log, portanto tem uma maior taxa de cresimento sendo preferível para expressão.

A OD medida para T0 a 600 nm foi de foi de 1,026. Uma alíquota de T0 foi reservada para posterior

aplicação no gel de SDS-PAGE.

O próximo passo foi a adição do indutor IPTG ao tubo que após duas horas de incubação foi

nomedo T2. O IPTG é um indutor da transcrição que atua associando-se ao repressor (que neste caso é o

repressor lacI do vetor pET-21) e inibindo-o. Dessa forma, o promotor fica livre para a interação com a RNA

polimerase e consequente intensificação da transcrição do gene1.

A OD medida pra T2 foi de 1,786. O aumento observado na absorbância reflete uma maior turbidez

do meio que se deve ao crescimento bacteriano, como era esperado após o período de incubação. Foi

também reservada uma alíquota de T2 para posterior aplicação em gel.

Após quatro horas de incubação obteve-se T4 que teve OD de 2,415. Da mesma forma, foi

observado aumento de cresimento bacteriano. Reservou-se também alíquota para aplicação em gel.

Os tubos correspondentes a T0, T2 e T4 foram centrifugados e o sobrenadante foi descartado já

que é no pellet que se encontra, além das estrututras celulares e outras proteínas, a proteína de interesse

(ECP).

Os diferentes tempos de crescimento bacteriano (T0, T2 e T4) foram utilizados para avaliação da

expressão. Em TO há um nível basal de expressão gênica devido ao repressor que mantem os níveís

basais de expressão do gene insignificantes até aindução. Já em T2, o nível de expressão é aumentado pela adição de IPTG e em T4 espera-se um nível de expressão ainda maior, já que além do indutor há o

fator tempo de crescimento bacteriano aumentado.

Essa expressão pode ser constatada pela análise de gel de acrilamida desnaturante SDS-PAGE.

Essa técnica permite a visualização dos resultados da expressão protéica para posterior purificação da

proteína em questão e sua utilização em testes funcionais. O gel de poliacrilamida que contem ligações

altamente cruzadas como uma matriz inerte, através da qual as proteínas migram. O gel é preparado pela

polimerização de monômeros. O tamanho do poro do gel foi ajustado de maneira que fosse suficientemente

pequeno para retardar a migração das moléculas protéicas de interesse. Para tanto foi usado o gel de

corrida a 10%. É também usado um gel de empacotamento a 5% a fim de que as amostras atinjam o gel de

corrida linearmente.

Conforme dito anteriormente, as proteínas são misturadas com um detergente aniônico capaz de se

ligar a elas e desnaturá-las, o SDS, que é usado para que as proteínas migrem no gel apenas de acordo

com sua massa molecular, proteínas com menor peso molecular terão migração maior por ficarem menos

retidas na malha do gel. O SDS aplica uma carga negativa à proteína em proporção à sua massa se ligando

às suas regiões hidrofóbicas, dessa forma as diferenças de massa e carga não influenciam na migração no

gel. Como resultado, uma mistura complexa de proteínas é fracionada em uma série de diferentes bandas

de proteínas arranjadas de acordo com sua massa molecular. As proteínas são detectadas pela coloração

com o corante azul de Comassie 5. O Coomassie complexa com aminoácidos básicos (afinidade

principalmente a lisinas e argininas e pouca afinidade por aminoácidos com cadeia lateral aromática) por

interações não-covalentes . O Coomassie possui sensibilidade para detectar de 30 a 100 ng de proteína 6.

O excesso do corante foi removido com solução descorante.

Após corrida do gel, a expressão protéica pôde ser avaliada pela intensidade da banda corada por

Comassie. Como dito anteriormente, há uma maior expressão em T2 e principalmente em T4. Portanto,

espera-se uma banda muito pouco intensa em T0, um aumento da intensidade da banda em T2 e uma

banda bastante intensa em T4. A proteína ECP expressa em aula prática tem peso de 16 kDa devendo

aparecer entre a primeira e a segunda banda do padrão Broat Ranger Marker – Promega.

Porém, como observado no gel nosso grupo não obteve resultado positivo. Isso pode ter ocorrido

devido a diversos fatores, como falha na transformação bacteriana ou no crescimento ou ainda na indução

da expressão. Acreditamos que o erro mais provável seja na pipetagem em algumas das fases mesmo em

aulas práticas anteriores visto que as mesmas são sequenciais, e não nos reagentes uma vez que outro

grupo obteve resultado positivo.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Tecnologia do DNA recombinante. Alexandra A. C. Nascimento;Enilza Maria Espreafico; Maria Luisa Paçó Larson Nádia Monesi; Nilce Maria Martinez Rossi;Vanderlei Rodrigues. São Paulo, 2003. Disponível em:

<http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila/apost10.htm > Acesso em: 25 de outubro de 20102 Comunicado técnico – EMBRAPA . Eletroforese dimensional e análise de proteomas. Thales Lima Rocha; Paulo Henrique Alves da Costa ; José Cesamildo Cruz Magalhães; Raphael Garcia Souza Evaristo;

Érico Augusto Rosas de Vasconcelos; Marise Ventura Coutinho; Norma Santos Paes; Maria Cristina Mattar

da Silva; Maria de Fátima Grossi de Sá. Disponível em: <

http://www.cenargen.embrapa.br/laboratorios/LIMPP/PDFsLIMPP/cot136.pdf > Acesso em: 27 de outubro

de 2010.

3UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA. Separação de proteínas por eletroforese desnaturante descontínua na presença de SDS (SDS-PAGE). Prof. Antônio Augusto Ulson de Souza. Disponível em: <www.enq.ufsc.br/disci/eqa5517/pratica_eletroforese.doc > Acesso em: 27 de outubro de

2010.

4 imagem

5 alberts

6 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO. Proteômica . Disponível em : <http://www.unifesp.br/centros/proteomica/glossario/glossario > Acesso em: 10 de novembro de 2010.

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