Purificação Mitocondrial - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)
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Lula_8514 de Março de 2013

Purificação Mitocondrial - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)

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Apostilas de Bioquímica sobre o estudo da Purificação Mitocondrial, Purificação e Inibidores, Experiência de redução do Azul de Metileno.
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CEFET – QUÍMICA/ URJ Coordenadoria de Biotecnologia

Bioquímica II _____________________________________________________________

Mitocôndria Purificação e Inibidores

A) Material: Geral:

 Potter Por grupo:

 1 pipeta de 1 e 5 mL.  2 Pró-pipetes  10 tubos de ensaio

 Pipetador automático de 200μL e de 1mL

Soluções:  Hepes 2mM com Sacarose 0.28M e Albumina 0.05% (p/v) pH 7,4 (0,5 L) (Solubilizar o Hepes e a sacarose, acertar o pH com KOH 1 mol/L, depois solubilizar a albumina e avolumar)  KOH 1M  Tampão fosfato 100mM pH 7,4  Azul de metileno 0,01%  Homogenato de figado

 Succinato de potássio 200mM  Malonato de potássio 100mM  Azida de sódio 100mM  Óleo mineral ou vaselina líquida

B) Método: I - Purificação mitocondrial

Separar a fração mitocondrial, excluindo a fração nuclear (mais pesada) e excluindo a fração microssomal e solúvel (mais leves). Utilizar meio isotônico contendo albumina (para poteger as mitocôndrias da ação detergente de ácidos graxos) 1- Sacrificar o camundongo (usar 4 animais), fazer uma incisão abdominal e retirar o fígado. 2- Lavar o fígado 1x com 15 mL de tampão em becker. 3- Cortar com tesoura em pedaços pequenos e lavar, 2x com 15 mL de tampão. 4- Homogeneizar em duas etapas: Colocar metade da massa de fígado em um potter com 10mL

de tampão e homogeneizar com 4 passos (4 idas e 4 voltas) à 400 rpm (use uma furadeira caso não haja um mixer).

5- Diluir tudo à 160mL com tampão e reservar 40 mL do diluído (para 8 grupos)= homogenato total

6- Pesar os tubos e equilibrá-los. 7- Centrifugar o homogenato em 3 tubos de 45mL ou 9 tubos de 15mL, 600xg, 4°C, 10min .

(PARA TUBOS DE 45ML USAR SOMENTE TUBOS CORNING POIS ELES NÃO COLABAM NO ROTOR)

Descartar o precipitado (P1) contendo restos de tecido, núcleos, hemácias e transferir para outro tubo de centrifuga o sobrenadante (S1).

8- Pesar os tubos e equilibrá-los. 9- Centrifugar S1, 7000xg, 4°C, 10 min. Descartar o sobrenadante (S2) contendo membranas leves e fração solúvel e

Reservar o precipitado (P2) 10- Ressuspender P2 com tampão em 3 tubos com 45mL cada ou 9 tubos com 15mL cada.

11- Pesar os tubos e equilibrá-los. 12- Centrifugar 10.000xg, 4 C, 10 min Descartar o sobrenadante (S3) Reservar o precipitado (P3) 13- Ressuspender P3 em 40 mL total de tampão (para 8 grupos) = fração mitocondrial

II - Experiência de redução do Azul de Metileno 1- Pipetar os tubos conforme a tabela (coluna por coluna) 2- Homogeinizar levemente (SEM INSERIR AR NOS TUBOS) 3- Colocar delicadamente uma fina camada de óleo mineral na superfície da mistura (para evitar o contato com o O2). 5- Marcar o tempo que cada tubo demora para ficar incolor, SEM MEXER NOS TUBOS.

Ensaio de redução – Homogenato

Tampão fosfato

mL

Azul de metileno

mL

Água mL

Succinato mL

Malonato mL

Azida mL

Amostra Homogenato de

fígado mL

Bco 1.0 0.1 3.1 - - - - C 1.0 0.1 2.1 - - - 1.0

Suc 1.0 0.1 1.9 0.2 - - 1.0 Mal 1.0 0.1 1.8 0.2 0.1 - 1.0

azida 1.0 0.1 1.8 0.2 - 0.1 1.0

Ensaio de redução – Fração mitocondrial

Tampão fosfato

mL

Azul de metileno

mL

Água mL

Succinato mL

Malonato mL

Azida mL

Amostra Fração

mitocondrial mL

Bco 1.0 0.1 3.1 - - - - C 1.0 0.1 2.1 - - - 1.0

Suc 1.0 0.1 1.9 0.2 - - 1.0 Mal 1.0 0.1 1.8 0.2 0.1 - 1.0

azida 1.0 0.1 1.8 0.2 - 0.1 1.0 Relatório: Deve ser feito seguindo-se o roteiro de confecção de relatórios vigente.

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