Reação em Cadeia da DNA Polimerase e Eletroforese - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)
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Lula_8514 de Março de 2013

Reação em Cadeia da DNA Polimerase e Eletroforese - Apostilas - Bioquímica, Notas de estudo de Bioquímica. Universidade Estadual de Maringá (UEM)

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Apostilas de Bioquímica sobre o estudo das técnicas da reação em cadeis da polimerase (PCR) e eletroferese.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI CCO-DONA LINDU – DIVINÓPOLIS – MG Relatório de Práticas em Biologia Molecular

AULA PRÁTICA 02 e 03: Reação em Cadeia da DNA Polimerase e Eletroforese

1. COMPONENTES Turma: Bioquímica - 6º período

2. INTRODUÇÃO

O advento da biologia molecular foi certamente um dos maiores passos das ciências biológicas durante

o século XX. A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe enormes benefícios e

desenvolvimento científicos como o sequenciamento genômico, expressão de genes em sistemas

recombinantes, o estudo da genética molecular, a determinação rápida de paternidade e o diagnóstico de

doenças infecciosas. Outras aplicações especialmente úteis para a PCR é a clonagem de um fragmento de

DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtida da molécula de RNA , o

que permite o estudo da expressão dos genes. Além disso a PCR tem um grande potencial na medicina

forense. Sua sensibilidade torna possível utilizar uma pequena amostra de DNA (traços mínimos de sangue

ou tecidos) e obter um fingerprint da amostra para posteriormente ser comparada com outras.

A PCR é uma metodologia que pode ser executada interiamente in vitro, sem o uso de células. Essa

técnica foi desenvolvida nos anos 80 po Kary Mullis, que recebeu em 1994, o prêmio Nobel.

Essa técnica possibilta a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA polimerase que

sintetiza uma sequencia complementar de DNA desde que um pequeno fragmento – o primer ou iniciador,

já esteja ligado a uma das cadeias de DNA . Os iniciadores definem a sequencia a ser replicada e o

resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequencia de DNA com bilhões de cópias.

O ciclo da Reação em cadeia da polimerase decorre em três estágios que se repetem um número

específico de vezes:

1. Desnaturação das fitas de DNA – desnaturação da fita dupla de DNA

2. Hibridização ou Annealing – hibridização dos primers com a cadeia de DNA previamente desnaturada

em sequências específicas e complementares. A escolha criteriosa dessa temperatura permite que os

primers se liguem à sequencia alvo com maior especificidade.

3. Extensão – amplificação do DNA (formação do amplicon).

A Reação em cadeia da polimerase, ocorre no Termociclador, aparelho capaz de controlar e alternar a

temperatura durante o períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR ,

geralmente entre 30 e 40 ciclos. O passo final é a análise do produto de reação. Esta pode ser feita através

de eletroforese em gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por

brometo de etídio. Em qualquer uma delas, o material amplificado é visualizado como uma banda, a ser

analizada de acordo com o seu peso molecular.

A eletroforese consiste na separação de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e

pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas orgânicas como RNA, DNA e proteínas são separadas

pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico. O princípio da eletroforese

utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (conferida pelos

grupamentos fosfatos). Sendo assim, as moléculas de DNA tendem a migrar em direção ao pólo positivo

(cátodo).

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na velocidade ou

mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula. A mobilidade

eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é

função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio.

Nessa técnica é utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos, solução salina para condução

de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba é encaixado o gel que deve ficar submerso. Pequenos

poços são feitos no gel durante sua preparação com pentes. As amostras são pipetadas nesses poços.

Essas amostras devem ser previamente misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante

é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a

densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como

indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema.

A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que

outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders

(marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e eqüidistantes

entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.

A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios-

suporte, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou

poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na

mobilidade das moléculas. No caso de eletroforese em géis, como poliacrilamida e agarose, a migração das

moléculas é profundamente influenciada pelas malhas porosas. Em relação a géis de poliacrilamida ou

agarose, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas, sendo este geralmente

decorrente do grau de polimerização entre os monômeros. Géis de poliacrilamida são freqüentemente

usados para análises de alta resolução (seqüenciamento de DNA/RNA) em análises protéicas e

isoenzimáticas que requeiram maior definição das bandas. Géis de agarose também são amplamente

usados na separação de DNA/RNA, especialmente para fragmentos maiores.

A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado para separar, identificar, analisar ,

caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar misturas de fragmentos de DNA

que não podem ser separados por outros meios, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou

por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente.

Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio (EtBr), uma

substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao fluorescer sob luz ultravioleta. Concentrações de

até 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.

3. OBJETIVO

Introdução de conceitos e execução das técnicas da reação em cadeis da polimerase (PCR) e

eletroferese.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1.1. Materiais para a PCR Microtubos de 200 µLEnzima Taq Dna polimerase

Primers específicos: forward e reverse – estoque 10 µM = 10 ρmol/µL

dNTPs – estoque 1mM

Tampão de reação 10x (100mM Tris-HCl (pH 8,5), 500 mM KCl )

MgCl2 – estoque 50mM

Água MiliQ autoclavada

cDNA - 100ng/µL

Termociclador

4.1.2. Materiais para a Eletroforese em gel de agarose Agarose – 1g

Erlenmeyer de 250 mL

Brometo de etídio – 3 µLPadrão de peso molecular 100 pb

TAE 1X

Tampão de carregamento

Cuba de eletroforese horizontal

Pentes

Fonte

Cabos

4.2. Métodos 4.2.1. Preparo do Mix de reação Antes do inicio da preparação do mix de reação, irradiar a capela de fluxo laminar, da qual será realizado o

trabalho, com luz ultravioleta por 10 minutos.

Calcular o volume de cada reagente para a concentração final correspondente (ver Anexo 1).

Completar o volume do Mix para 10 µL com água MiliQ.

Numerar o tubo 1 como o Teste e tubo 2 como Controle Negativo.

Adicionar os reagentes da solução Mix nos microtubos 1 e 2 conforme a Tabela 1. (cálculo das

concentrações Anexo 1)

Tabela 1: Volumes dos reagentes para adição no Mix da reação:

Concentração final Tubo 1 Tubo 2

Primer forward 1 µM 1 µL 1 µL

Primer reverse 1 µM 1 µL 1 µL

dNTP 0,1 mM 1 µL 1 µL

Tampão 1 x 0,5 µL 0,5 µL

MgCl2 2,5 mM 0,5 µL 0,5 µL

Taq DNA polimerase 0,5 ui 0,5 µL 0,5 µL

cDNA (template) 10 ng 1 µL -

Água MiliQ -- 4 µL 5 µL

Volume total 10 µL 10 µL

Após adicionar o DNA, colocar o microtubo imediatamente no gelo.

Levar os microtubos 1 e 2 à centrífuga por aproximadamente 10 minutos e em seguida colocá-los no

Termociclador devidamente programado.

4.2.2.Termociclagem Programar o Termociclador com as condições apropriadas para a reação.

4.2.3. Preparação do gel de agarose Montar a cuba de eletroforese.

Pesar 1 g de agarose em um erlenmeyer e adicionar 100 mL de TAE 1X. Tampar com um plástico filme

e levar ao microondas por aproximadamente 2 minutos até completa dissolução. Aguarde o líquido esfriar

poe aproximadamente 5 minutos e verta-o na cama. Em seguida, coloque os pentes para formação das

canaletas. Aguarde a polimerização do gel e encaixe-o na cuba que deve ser coberta completamente com o

tampão TAE 1X. Adicionar 5 µL do marcador de peso molecular na primeira canaleta. Na segunda canaleta,

adicionar 10 µL do produto de PCR do controle negativo (microtubo 1) com 2 µL do tampão de

carregamento. Na terceira canaleta, adicionar 10 µL do produto de PCR (microtubo 2) com 2 µL tampão de

carregamento.

Conectar os cabos à cuba e à fonte. Programar a voltagem para 80V. A formação de microbolhas indica

o início da corrida do gel. Aguardar em torno de 60 minuots.

4.2.4. Coloração do gel Retirar o gel da cuba cuidadosamente e transferi-lo para uma bandeja contendo a solução de coloração

(solução de brometo de etídio e TAE). Aguardar aproximadamente 15 minutos sob agitação e 15 minutos

em repouso. Levar o gel ao transiluminador. As bandas, nesse caso, devem ser visíveis na altura dos

marcadores de 400 pb. Capturar a imagem utilizando o programa LPix Image.

5. RESULTADOS

6. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

Para a preparação da solução Mix de reação havia necessidade de calcular o volume correspondente

para cada concentração final, sendo que o Mix deveria ter o volume total de 10 µL. Os resultados desses

cálculos estão organizados na Tabela 1 e os respectivos cálculos se encontram no anexo 1.

A Reação em Cadeia da Polimerase é dividida em 3 estágios: desnaturação, annealing ou hibridização

e extensão.

- Desnaturação: A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a cadeia dupla de DNA em dois

filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”. Os dois filamentos ou cadeias de DNA

são mantidos juntos por ligações de hidrogênio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas

temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações

covalentes mais fortes, permanecem intactas.

- Annealing ou hibridização: Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo:

estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídios, entre 20 e 30 bases. Numa reação de

PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de

desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a

sequência complementar. Temperatura de annealing ou hibridização: normalmente encontra-se entre 40 ºC

e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A escolha criteriosa desta

temperatura permite que estas sequências iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada

especificidade.

- Extensão: Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de DNA, a

temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de ADN. A Taq

polimerase é uma polimerase de DNA termo-estável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que,

ao contrário de outras polimerases, se mantém ativa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é

iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleotidios

complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs em solução. A extensão inicia-se sempre na

extremidade 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq

polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5’ para 3’.

Após 30 ciclos da PCR (número de ciclos utilizados para a maioria das reações), um único fragmento

gênico apresentará mais de 1 000 000 000 de cópias.

As cadeias de DNA amplificadas são denominadas Amplicons.

Após a realização da PCR, os produtos da reação foram analisados por eletroforese. Uma PCR bem-

sucedida revelará uma banda no gel de agarose que deverá estar na região equivalente ao peso molecular

do inserto (400 pb). A localização dos fragmentos no gel é feita pela comparação com o DNA ladder

(padrão de peso molecular). Pela observação do gel da aula prática percebe-se que não houve

amplificação, uma vez que a banda correspondente ao amplicon está ausente. Isso pode ser devido a erros

de pipetagem dos reagentes na preparação da PCR ou na aplicação no gel da eletroforese ou ainda

temperatura de anelamento inadequada. Sugere-se repetir a PCR e a eletroforese e fazer testes para

determinação da temperatura ótima de anelamento dessa reação (como a PCR com gradiente de

temperatura), bem como aumentar a concentração de MgCl2 para que a DNA polimerase se torne mais

permissiva durante a reação. Porém a hipótese mais provável é que tenha ocorrido erros de pipetagem,

uma vez que houve amplificação na PCR de um dos grupos da aula prática que utilizou as mesmas

concentrações de reagentes, DNA template e programa de PCR.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ELETROFORESE – Apostila. Disponível em:

<http://web.cena.usp.br/apostilas/Figueira/2008/Apostila%2006%20Eletroforese.doc>. Acesso em 24 de

agosto de 2010.

ELETROFORESE – Genética molecular. Disponível em:

<http://genetica.ufcspa.edu.br/biomedic/conteudo/genetica_molecular/eletroforese.pdf>.Acesso em 24 de

agosto de 2010.

INTRODUÇÃO À PCR, Roche Portugal. Disponível em:

<http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-

diag/intro-pcr/> Acesso em: 25 de agosto de 2010.

MARIOTTO, J.M. Enzimas: Estágio de Docência. Disponível em:

<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_enzimas_ju.pdf> Acesso em 24 de

agosto de 2010.

PCR EM TEMPO REAL -. Disponível em: <http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/pcr.pdf> Acesso em 24 de agosto de 2010.

PRINCÍPIOS DA TÉCNICA DE ELETROFORESE – Embrapa Documentos online.

Disponível em: <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_do06_2.htm>. Acesso em 24 de agosto de 2010.

ANEXOS 1. Cálculo dos volumes para utilização na solução Mix de reação, quando se conhece a concentração final.

Primer Forward Primer Reverse C1 V1 = C2 V2 C1 V1 = C2 V2 10 µM * V1 = 1 µM * 10 µL 10 µM * V1 = 1 µM * 10 µL

V1 = 1 µL do Primer Forward V1 = 1 µL do Primer Reverse

dNTP Tampão C1 V1 = C2 V2 C1 V1 = C2 V2 1 µM * V1 = 0,1mM * 10 µL 10x * V1 = 1x * 10 µLV1 = 1 µL de dNTP V1 = 1 µL de Tampão

MgCl2 cDNA C1 V1 = C2 V2 C1 V1 = C2 V2 50 mM * V1 = 2,5mM * 10 µL 100ng/ µL * V1 = 100ng/ µL * 10 µL

V1 = 0,5 µL de MgCl2 V1 = 1 µL de cDNA

Taq DNA polimerase A unidade de medida de enzimas é a ui, que corresponde a quantidade de enzima capaz de formar 1μmol de produto por minuto em condições ótimas de pH e temperatura por exemplo, específicas para cada caso.

Nesse experimento usamos 0,5μL da enzima Taq DNA polimerase com 0,5ui.

2. Exercícios

A. Explique o que é Hot start, e como você pode otimizar uma PCR inespecífica (que amplifica vários

fragmentos ao mesmo tempo)

Hot start é uma variação da PCR, onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas.

Essa técnica aumenta a especificidade da PCR. A atividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a

preparação da reação por ação de anticorpos específicos, evitando a amplificação de produtos

inespecíficos,melhorando o rendimento da reação. Esse procedimento é muito utilizado quando existe baixa

especificidade (mispriming) entre seu primer e o gene de interesse, pois o uso de Hot Start Taq DNA

polimerases em temperaturas mais altas minimiza os efeitos do anelamento incorreto entre o primer e o

gene. Métodos de Hot Start incluem modificações químicas da Taq polímerase (Taq Platinum e Taq Gold),

anti-corpo anti-DNA polimerase e Wax bead. Assim, o Hot Start em conjunto com Taq DNA polimerases

modificadas são formas utilizadas em laboratório para minimizar os problemas encontrados em uma PCR

inespecífica.

B. Qual o gene amplificado por este primer ? Lembre-se que os 6 primeiros nucleotídeos fazem parte

de um sítio de enzima de restrição.

Segundo a busca por homologia através do BLAST – NCBI, o gene amplificado por este primer

corresponde a proteína catiônica eosinófila,uma ribnuclease humana.

- Primer Forward

- Primer Reverse

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