Relatório - Fotossíntese, Notas de aula de Biotecnologia
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vanessayg13 de Junho de 2014

Relatório - Fotossíntese, Notas de aula de Biotecnologia

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Relatorio aula pratica sobre fotossintese. Curso Técnico em Biotecnologia. Histologia e Fisiologia Vegetal. OBJETIVOS: ATIVIDADE 1) Separar os pigmentos fotossintéticos por cromatografia de papel para que possamos visual...
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Curso Técnico em Biotecnologia

HISTOLOGIA E FISIOLOGIA VEGETAL Professora Márcia Bündchen

RELÁTORIO AULA PRÁTICA: FOTOSSÍNTESE

Vanessa Yuki Grafulin Vinícius Ziebell Noronha

Porto Alegre, 22 de abril de 2013

OBJETIVOS

ATIVIDADE 1) Separar os pigmentos fotossintéticos por cromatografia de papel para que possamos visualiza-los. ATIVIDADE 2) Observar a separação de pigmentos lipossolúveis e hidrossolúveis por meio da partição em solventes não miscíveis. ATIVIDADE 3) Quantificar os pigmentos fotossintéticos por espectrofotometria.

ATIVIDADE 1

Sobre a cromatografia em papel:

Uma das técnicas de separação de mistura bastante utilizada é a cromatografia. Esta técnica foi desenvolvida por Michael Tswett (botânico russo), no começo do século XX, passando através de uma coluna cromatográfica, preenchida com carbonato de cálcio (CaCO3), pigmentos extraídos de plantas. A cromatografia pode ser utilizada para a análise de misturas em seus componentes. É utilizada para separar e identificar (mediante a comparação com padrões) substâncias no trabalho policial-químico, por exemplo, drogas e narcóticos podem ser identificados na urina ou em uma amostra do sangue.

O conhecimento sobre a polaridade das moléculas das substâncias é muito importante na cromatografia em papel. Sabe-se que as substâncias cujas moléculas são polares interagem mais intensamente com solventes polares. As substâncias apolares têm mais afinidade com solventes apolares. Assim, variando a polaridade do solvente, ou misturas de solventes, podem-se separar os componentes de uma amostra.

A separação dos componentes de uma mistura neste tipo de cromatografia está baseada nas diferenças de solubilidade dos seus componentes na fase móvel (quando colocamos o papel filtro na placa contendo álcool) e estacionária (quando colocamos o papel filtro na placa com a amostra). Os componentes com menor solubilidade na fase estacionária têm um deslocamento mais rápido ao longo do papel. De outra parte, os componentes com maior solubilidade na fase estacionária serão consequentemente retidos e terão uma movimentação mais lenta.

Procedimento:

- Maceramos, em um almofariz, folhas recém coletadas com acetona 80% (aprox. 20 mL) - Filtramos o homogenato através de algodão, em seguida, filtramos novamente através de papel filtro transferindo o extrato resultante para uma proveta. - Transferimos parte do extrato para uma placa de Petri (o suficiente para cobrir o fundo) e reservamos o restante. - Recortamos um retângulo de papel filtro (aprox. 15cm x 2cm), dobramos ao meio e dispomos na placa contendo o extrato. - Aguardamos cerca de 1 minuto. - Transferimos o papel filtro para outra placa contendo álcool (também suficiente para cobrir o fundo) e observamos a movimentação dos pigmentos.

RESULTADO E DISCUSSÃO:

Como já foi citado, a separação dos componentes de uma mistura neste tipo de cromatografia é baseada nas diferenças de solubilidade dos seus componentes na fase móvel e na estacionária. O solvente sobe o papel por capilaridade e arrasta a substância pela qual tem mais afinidade, separando-a das substâncias menor afinidade. Ou seja, os componentes mais solúveis ao solvente da mistura (a acetona) serão os primeiros a subir e os com menor solubilidade irão demorar um pouco mais. No caso da nossa amostra nós conseguimos observar e identificar três pigmentos diferentes no final do procedimento: antocianinas (na parte superior), clorofila b (no meio) e carotenoides (em baixo). Isso quer dizer que as antocianinas são mais solúveis em acetona, mais polares e interagem mais com este solvente que os outros pigmentos já que ocupam a parte mais alta do papel. Logo abaixo está a clorofila b, menos polar que as antocianinas e os carotenoides, menos polares ainda, que subiram mais lentamente o papel por interagirem menos com o solvente.

- Pigment

os observad

os e identifica

dos: Antociani

nas, Clorofila B e Caroten oides.

ATIVIDADE 2 (Separação dos pigmentos foliares por solubilidade)

Procedimento 1:

- Colocamos 3 mL da mistura filtrada que reservamos na atividade 1 em um tubo de ensaio e adicionamos, lentamente escorrendo pelas

paredes, igual quantidade de éter etílico e igual quantidade de água destilada. - Agitamos suavemente.

RESULTADO

Após a adição do éter e da água houve uma separação da mistura em duas fases:

FASE VERDE: Como a densidade do éter etílico (0,71 g·cm-3 (20 °C)) é mais baixa que a da água, sabemos que é ele que está na parte

superior. Como o éter é considerado um solvente apolar, sabemos que os pigmentos que irão ficar solubilizados nessa fase são a clorofila e os carotenoides já que estes são apolares (também podemos observar isso

pela cor que esta fase possui). FASE ROXA: Na fase inferior esta a água destilada que adicionamos depois do éter e a acetona que já estava na mistura (ambos polares). Como já vimos na atividade 1, o pigmento mais polar entre os três que observamos são as antocianinas, logo, são elas que ficaram solubilizadas na fase roxa.

Procedimento 2:

- Com o auxilio de uma pipeta, retiramos cuidadosamente uma amostra de 2 mL da camada inferior para outro tubo de ensaio. - Diluimos a amostra com a mesma quantidade de água destilada. - Dividimos os 4 mL da solução em dois tubos. - No tubo A, acrescentamos 3 gotas de NaOH 0,1 M. - No tubo B, acrescentamos 3 gotas de HCl 0,1 M.

RESULTADO

- Tubo B (à direita): A solução contendo antocianinas ficou rosa com a adição de HCl.

- Tubo A (à esquerda): a solução contendo antocianinas ficou verde com a adição de NaOH.

Sobre as Antocianinas:

Antocianinas são derivados de sais flavílicos, solúveis em água, que na natureza estão associados a moléculas de açúcar, denominando-se então antocianidinas. São pigmentos pertencentes ao grupo dos flavonóides responsáveis por uma grande variedade de cores de frutas, flores e folhas que vão do vermelho-alaranjado, ao vermelho vivo, roxo e azul. Em particular, são os responsáveis pela cor rubi-violácea (cor "bordô") do vinho tinto jovem. Sua função é a proteção das plantas, suas flores e seus frutos contra a luz ultravioleta (UV) e evitam a produção de radicais livres. São sempre encontradas na forma de glicosídeos facilmente hidrolisados por aquecimento em meio ácido, resultando em açúcares e agliconas, denominadas antocianidinas. A organela celular que contém as antocianinas é o vacúolo.

ATIVIDADE 3 (Quantificação do Pigmentos Fotossintéticos por Espectrofotometria)

INTRODUÇÃO

A espectrofotometria é uma método que utiliza diferentes comprimentos de onda de luz visível através de uma solução, a fim de

identificar a quantidade desta luz que é absorvida pela solução e transmitida através da mesma.

De acordo com a técnica de Lichtenthaler (1987), utilizam-se três comprimentos de onda: 470nm para identificar carotenoides, 646nm para identificar clorofilas B e 663nm para identificar clorofilas A. Através de formulas podemos então, junto com a leitura da absorbância nestes comprimentos de onda, chegar a quantidades aproximadas destas substancias na amostra.

Procedimento:

Foram utilizadas duas amostras de folhas para este procedimento. 20mg de cada uma das amostras foi macerado e diluído em acetona 80%. Este extrato foi transferido para um tubo de ensaio e centrifugado a 3000rpm.

O sobrenadante de cada uma das amostras foi transferido para uma cubeta e teve absorbância medida em três comprimentos de onda, 470, 646 e 663.

Resultados:

Compriment o de onda / amostra

Folha nova Folha Velha

470 0,096 0,420 646 0,026 0,016 663 0,307 0,080

De acordo com a leitura demonstrada acima, foram feitos os seguintes cálculos:

Folha nova Clorofila a = 3,75 - 0,86 = 2,89 µg/ml Clorofila b = 0,52 - 0,13 = 0,39 µg/ml Carotenoides = 96-9,45-40,56 = 45,99/214 = 0,215 µg/ml

Folha velha Clorofila a = 0,97 - 0,22 = 0,75 µg/ml Clorofila b = 0,32 - 0,08 = 0,24 µg/ml Carotenoides = 420 - 2,45 - 24,96 = 392,59 / 214 = 1,83 µg/ml

Multiplicando os resultados pelo fator de diluição da amostra (0,005) teremos então quantidade de cada substancia em cada folha.

Resultados Folha Nova Folha Velha Clorofilas A 0,014 µg/g MF 0,004 µg/g MF Clorofilas B 0,0019 µg/g MF 0,0012 µg/g MF Carotenoides 0,0011 µg/g MF 0,009 µg/g MF

Conclusão:

De acordo com o os resultados, podemos verificar que a folha nova contém mais clorofilas, tanto A quanto B, do que a folha velha que apresentou mais Carotenoides que a folha nova.

BIBLIOGRAFIA:

- UFSC – DEPARTAMENTO DE QUÍMICA. CROMATOGRAFIA EM PAPEL. Disponível em: <http://www.qmc.ufsc.br/geral/Exp.Quimica5119/ EXPERIENCIA5_cromatografia.pdf>. Acesso em: 22 abr. 2013.

- PIGMENTOS FOTOSSINTETISANTES. Disponível em: <http:// www.sobiologia.com.br/conteudos/bioquimica/bioquimica13.php>. Acesso em: 22 abr. 2013.

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