Teoria cromatografia - Apostilas - Biologia_Parte1, Notas de estudo de Biologia. Centro Universitario Nove de Julho (UNINOVE)
Jose92
Jose9214 de Março de 2013

Teoria cromatografia - Apostilas - Biologia_Parte1, Notas de estudo de Biologia. Centro Universitario Nove de Julho (UNINOVE)

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Apostilas de Biologia sobre o estudo da cromatografia, historico, Princípio Básico, Modalidades e Classificação, Aplicabilidade.
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CROMATOGRAFIA Histórico

M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com

adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo

CaCO3

m istura de pigmentos

pigmentos separados

Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever]

(grego)

Adaptado do original: QFL2242 Prof. Fábio Augusto - Unicamp Marina F. M. Tavares

CROMATOGRAFIA Princípio Básico

Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou

sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

CROMATOGRAFIA Modalidades e Classificação

FM = Líquido

FM = Gás

Cromatografia Líquida

Cromatografia Gasosa (CG)

Em CG a FE pode ser:

Sólida

Líquida

Cromatografia Gás-Sólido (CGS)

Cromatografia Gás-Líquido (CGL)

CROMATOGRAFIA GASOSA Histórico

Presentemente: Vendas de equipamentos e acessórios para CG nos EUA

estimadas em mais de US$ 750.000.000 (1995).

1940

1950

1960

“CGS” rudimentar

CGL proposta (Martin e Synge)

Separação de ácidos orgâni- cos por CGL: primeiro cro- matógrafo (Martin e James)

Primeiro equipamento comer- cial (Griffin & George) Detector por Densidade de

Gás (Martin e James)

Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar)

Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky)

Colunas Capilares (Golay)

CROMATOGRAFIA GASOSA Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)

(para uma substãncia qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela

deve ser dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás)

DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que termicamente estáveis.

O Cromatógrafo a Gás

1

2

3

4

6

5

1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

Observação: em vermelho: temperatura controlada

INSTRUMENTAÇÃO Gás de Arraste

Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amos- tra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE

Requisitos:

INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento.

PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária.

Impurezas típicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCEH2O, O2

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

INSTRUMENTAÇÃO Gás de Arraste

Requisitos: CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser

muito caros.

COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para

melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector:

He , H2DCT DIC N2 , H2 DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4

C U

ST O

PUREZA A

B C

A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0)

INSTRUMENTAÇÃO Alimentação de Gás de Arraste

Componentes necessários à linha de gás:

controladores de vazão / pressão de gás

dispositivos para purificação de gás (“traps”)

1

2

3 4

5

6

1 - Cilindro de Gás 2 - Regulador de Pressão Primário

3 - “Traps” para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário

5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro)

Nota: Tubos e Conexões: Aço Inox ou Cobre

INSTRUMENTAÇÃO Dispositivos de Injeção de Amostra

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na

coluna cromatográfica

Injeção instantânea:

Injeção lenta:

t = 0

t = x

t = 0

t = x

INSTRUMENTAÇÃO Injetor “on-column” Convencional

1

2

3

4

1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica

INSTRUMENTAÇÃO Injeção “on-column” de líquidos

1 2 3

1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna.

2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna.

3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

INSTRUMENTAÇÃO Parâmetros de Injeção

TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser sufi- cientemente elevada para que a amostra vapo- rize-se imediatamente, mas sem decomposição

Regra Geral:Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra

COLUNA AmostrasGasosas Amostras Líquidas

empacotada = 3,2 mm (1/4”)

0,1 ml ... 50 mL0,2 µL ... 20 µL

capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 µL ... 3 µL

Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução

INSTRUMENTAÇÃO Microsseringas para Injeção

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL

êmbolo

corpo (pirex)

agulha (inox 316)

Microseringa de 10 µ L:

Microseringa de 1 µ L (seção ampliada):

corpo

guia

êmbolo (fio de aço soldado ao guia)

agulha

INSTRUMENTAÇÃO Colunas: Definições Básicas

EMPACOTADA = 3 a 6 mm

L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pul- verizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

Paredes internas recober- tas com um filme fino (fra- ção de µ m) de FE líquida

ou sólida

INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna

Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende

de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).

p0 = f Estrutura química

do analito

Temperatura da coluna

Temperatura da

coluna

Pressão de

vapor

Velocidade de

migração

ANALITO ELUI MAIS RAPIDA- MENTE (MENOR RETENÇÃO)

INSTRUMENTAÇÃO Temperatura da Coluna

TEM PER

A TU

R A

D A

C O

LU N

A

CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER

BOA SEPARAÇÃO EM CG

INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna

Características Desejáveis de um Forno:

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USOPelo menos de Tambiente até 400oC. Sistemas criogênicos (T < Tambiente) podem ser necessários em casos especiais.

TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MÓDULOSNão deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector.

TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIORSistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno.

INSTRUMENTAÇÃO Forno da Coluna

Características Desejáveis de um Forno:

FÁCIL ACESSO À COLUNAA operação de troca de coluna pode ser frequente.

AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDOImportante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas.

TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL

A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C.

Em cromatógrafos modernos (depois de 1980), o controle de temperatura do forno é totalmente

operado por microprocessadores.

INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes)

separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA: - Componentes mais

voláteis são separados - Componentes menos volá- teis demoram a eluir, saindo

como picos mal definidos

TCOL ALTA:

- Componentes mais volá- teis não são separados

- Componentes menos volá- teis eluem mais rapidamente

INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura

A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:

Consegue-se boa separação dos

componentes da amostra em menor

tempo

TEMPO

TE M

PE R

AT U

R A

tINI tFIM

TINI

TFIM

R

Parâmetros de uma programação de temperatura:

TINITemperatura Inicial

TFIMTemperatura Final

tINITempo Isotérmico Inicial

tFIMTempo Final do Programa

RVelocidade de Aquecimento

INSTRUMENTAÇÃO Programação Linear de Temperatura

Possíveis problemas associados à PLT:

VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.

viscosidade vazão

DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASEDevido ao aumento de volatilização de FE líquida

INSTRUMENTAÇÃO Detectores

Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas-

sagem de substâncias que não o gás de arraste

Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece

como um PICO no cromatograma.

INSTRUMENTAÇÃO Detectores

Mais Importantes:

DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD)Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.

DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD)Variação da condutividade térmica do gás de arraste.

DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID)Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.

REGISTRO DE

SINAL

ANALÓGICO Registradores XY

DIGITAL Integradores

Computadores

TEORIA BÁSICA Tempo de Retenção Ajustado, tR

tR

tM

tR’ = tR - tM

TEMPO

SI N

A L

tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in- jeção e o ápice do pico cromatográfico)

tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja

com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que

as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o

TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:

TEORIA BÁSICA Volume de Retenção Ajustado, VR

Embora não diretamente mensurável, o parâ- metro fundamental de retenção é o

VOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO, VR’:

vazão do gás de arraste

MRR ttt

TEORIA BÁSICA Constante de Distribuição, KC

Coluna cromatográfica: série de estágios inde- pendentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste:

Ocorre um “quase-equilíbrio” en- tre o analito sorvido na FE e dis-

solvido no gás de arraste.

SA

TEORIA BÁSICA Fator de Retenção, k

Exprimindo o equilíbrio em termos da MASSA do analito em cada fase, ao invés da concentração:

M

S

W Wk

FATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as massas de

analito contidas na FE (Ws) e gás de arraste (WM)

S

M

V VRAZÃO DE FASES, β:

razão entre volumes de FE e gás de arraste na coluna

O fator de retenção k depen- de da constante termodi-

nâmica de distribuição KC e da razão de fases β da coluna

TEORIA BÁSICA Razão de Fases, β

Depende das DIMENSÕES da coluna: L = comprimento da colunarC = raio

da coluna

df = espessura do filme de FE

TEORIA BÁSICA Relações entre VR’, KC e β

VR’ pode ser definido em função de KC e β:

VR’ depende diretamente da constante de dis- tribuição do soluto entre a FE e o gás de arraste e

das dimensões da coluna.

Outra combinação

possível:

É possível estimar tanto o fator de

retenção quanto a constante de

distribuição a partir do cromatograma

TEORIA BÁSICA Eficiência de Sistemas Cromatográficos

A migração um analito pela coluna

provoca inevitavelmente o

alargamento da sua banda:TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos: Separação deficiente de analitos com retenções

próximas.

Picos mais largos e menos intensos = menor

detectabilidade

EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

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