Vesículas - Apostilas -Biotecnologia, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)
Raimundo
Raimundo15 de Março de 2013

Vesículas - Apostilas -Biotecnologia, Notas de estudo de Biotecnologia. Universidade de São Paulo (USP)

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Apostilas de Biotecnologia sobre o estudo do tráfego intracelular de vesículas, seleção da carga, revestimentos, fusão de membranas.
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Aula_25.pdf

Tráfego Intracelular de Vesículas

Ao fi nal desta aula, você deverá ser capaz de:

• Compreender o equilíbrio entre o compartimentos das vias endocítica e secretória;.

• Conhecer os mecanismos de direcionamento de vesículas.

• Enumerar os diferentes tipos de revestimento de vesísculas e sua função.

• Correlacionar o mecanismo de fusão de membranas com a sua especifi cidade.

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l a

OBJETIVOS

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Na aula 16, você aprendeu que as novas moléculas (proteínas, glicoproteínas,

lipídios) produzidas no retículo endoplasmático passam dessa organela para

o complexo de Golgi em vesículas. Depois, na aula 17, você aprendeu que

para percorrer o complexo de Golgi as moléculas precisam ser colocadas em

vesículas que brotam de cada lamela e se fundem com a lamela seguinte, já

que as lamelas do Golgi não são contínuas. A princípio, isso pode parecer

uma trabalheira absurda, mas como a cada lamela essas moléculas ganham

cadeias de açúcar que vão sendo modifi cadas, com certeza o processamento

dessas moléculas fi ca mais organizado. No fi nal, já na rede trans do Golgi, as

moléculas seguirão para a membrana plasmática ou para os lisossomas, sempre

dentro de vesículas.

Repare bem, você não acha que, de tanto receber vesículas, a membrana

plasmática fi caria enorme? (daria para fazer babados, ou, no mínimo, umas

preguinhas...). Esse aumento da área da membrana plasmática seria muito

prejudicial para a célula, já que, por conter o citoplasma fl uido, o aumento

de área seria acompanhado por um aumento de volume. Colocando um

pouquinho de matemática nesse raciocínio, você vai lembrar que: se a área

da membrana aumenta ao quadrado, o volume que ela delimita aumenta ao

cubo. Se o volume da célula aumentasse muito, certamente haveria entrada de

água (por osmose), o que diluiria o citoplasma, alterando o equilíbrio de todas

as reações que lá se desenrolam. Por isso, acréscimos de superfície precisam

estar bem controlados.

Em contrapartida, as células precisam se nutrir, inclusive de moléculas que não

atravessam a membrana, e para isso endocitam o fl uido extracelular. A formação

de vesículas endocíticas reduz a área da membrana plasmática, contrapondo-

se, assim, ao processo secretório. Observando a Figura 25.1, podemos ter uma

idéia do trânsito de vesículas envolvidas nas duas principais vias da fi siologia

celular: a endocítica e a secretória.

INTRODUÇÃO

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lisossoma

endossoma tardio

MP

endossoma inicial

RE

N

grânulo de secreçãoCGN Golgi TGN

Complexo de Golgi

Figura 25.1: Tráfego de vesículas que transportam material do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi e daí para a membrana (via secretória) e de vesículas que transportam material endocitado para os lisossomas (via endocítica). MP, membrana plasmática; N, núcleo; RE, retículo endoplasmático; CGN, rede cis do Golgi; TGN, rede trans do Golgi.

Concluímos, então, que a área da membrana plasmática e o volume

celular podem ser mantidos pelo equilíbrio entre a chegada de vesículas

da via secretória e o brotamento de vesículas endocíticas. Mas será que o

controle desse equilíbrio é simples? Considerando apenas a via endocítica,

lembremos que, na endocitose mediada por receptor, vesículas são

devolvidas à membrana quando os receptores são reciclados.

Um experimento relativamente simples buscou testar esse equilíbrio

impedindo a formação de vesículas revestidas por clatrina. A idéia era

perturbar o equilíbrio de área da membrana através do bloqueio de um dos

tipos de endocitose. Isso foi feito eliminando o gene de uma das adaptinas

(recorde na Aula 20). O resultado esperado era o aumento de área da

membrana plasmática. Mas o resultado encontrado foi que, ainda assim, a

área da membrana se mantinha aproximadamente constante! Isso aconteceu

porque a taxa de endocitose de fase fl uida aumentou. Esse experimento

sugeriu que o equilíbrio é dinâmico e não tão simples.

Um ponto intrigante é: como os compartimentos intracelulares

manteriam a composição de sua membrana e seu lúmen apesar de trocarem

vesículas entre si? Essa questão é particularmente importante entre lamelas

do Golgi. A única resposta possível parece ser que cada compartimento

tem de selecionar as moléculas que farão parte de uma vesícula antes que

ela se solte.

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Depois da vesícula formada, ela deve seguir pelo citoplasma

transportando sua CARGA para o destino certo. Será que seu

deslocamento pelo citoplasma é aleatório, ou seja, ela vai sendo levada

pelos movimentos dos outros componentes do citoplasma?

Aleatório ou não, uma vesícula certamente encontrará pelo seu

caminho citoplasmático muitas outras vesículas e compartimentos.

Por que ela não se funde com o compartimento errado, levando, por

exemplo, moléculas recém-sintetizadas do retículo para o lisossoma ao

invés de para o Golgi?

Aliás, falando em fundir, como será que uma vesícula se funde

a outra?

Como você pode ver, perguntas não faltam! Nos últimos anos,

muitas delas começaram a ser respondidas. Vamos organizar o assunto

tratando dos seguintes pontos: direcionamento das vesículas, sua

composição incluindo a seleção da carga e por último fusão de vesículas

a compartimentos.

DIRECIONAMENTO

Quando analisamos as direções seguidas pelas vesículas no

citoplasma de uma célula de mamífero (Figura 25.1), podemos perceber

que as vesículas da via secretória se deslocam da região próxima ao

núcleo, onde se encontram retículo endoplasmático e complexo de

Golgi, para a periferia da célula, até chegar à membrana plasmática.

Convencionou-se chamar essa direção de tráfego de anterógrada. Já

as vesículas endocíticas se deslocam passando pelos endossomas

inicial e tardio em direção aos lisossomas, que costumam estar

preferencialmente na região perinuclear; essa direção de tráfego

é dita retrógrada.

Com o que você aprendeu nas últimas aulas, já poderia apostar

que algum tipo de fi lamento do citoesqueleto estaria envolvido no

Daqui para a frente esta aula contém muitas informações incompletas, como você poderá perceber, mas isso é devido à falta de informações sobre certos processos celulares reconhecidamente importantes. Nossa intenção é trazer as informações mais atuais. Muitas dessas informações serão supérfl uas para você hoje, mas decidimos escrevê-las porque, por enquanto, não há outro texto em português que você possa usar como fonte de consulta sobre esse assunto. Não se preocupe em guardar nomes de moléculas, importante mesmo é perceber como funciona em geral o tráfego intracelular de vesículas (até onde se sabe!).

CARGA DE UMA VESÍCULA O conjunto de moléculas que ela transporta, o que inclui não só o seu lúmen mas também as moléculas que compõem a própria membrana que a delimita.

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direcionamento das vesículas, já que as proteínas motoras podem

fazer com que vesículas ou mesmo organelas inteiras deslizem ao

longo de microtúbulos ou microfi lamentos. Para testar essa hipótese,

um experimento simples seria usar drogas que despolimerizam esses

fi lamentos e observar se as vesículas continuam se deslocando.

Os resultados desses experimentos foram muito interessantes.

Ao despolimerizar microfi lamentos usando citocalasina, as células não

conseguem mais fazer fagocitose, porque a emissão de pseudópodos

depende do remodelamento dos microfi lamentos naquela região. Outra

alteração que chamou a atenção dos pesquisadores foi o “encolhimento”

do retículo endoplasmático: ao invés de se manter espalhado por uma

grande área do citoplasma ele se tornou menos ramifi cado. Entretanto,

os resultados mais marcantes foram obtidos com o uso do nocodazol,

uma droga que provoca a despolimerização dos microtúbulos. Nessa

situação, a via endocítica fi cava bastante prejudicada, a maior parte

das vesículas formadas não conseguia passar o material endocitado

para os outros compartimentos, principalmente do endossoma inicial

em diante (Figura 25.2). Em muitas células, a despolimerização dos

microtúbulos causava a redistribuição dos lisossomos, que deixam de

ser encontrados principalmente na região perinuclear para se espalhar

na periferia da célula.

endossoma inicial

endossoma tardio

lisossoma

MP

TGN

microtúbulo Figura 25.2: O direcio- namento das vesículas transportadoras da via endocítica depende dos microtúbulos.

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Não era só na via endocítica que se notavam os efeitos da

despolimerização dos microtúbulos. A troca de vesículas entre retículo

endoplasmático e complexo de Golgi também se mostrava alterada.

Como já foi comentado antes (aula 17), a manutenção da identidade de

cada uma das lamelas do Golgi é essencial, já que cada lamela reúne

um conjunto de enzimas responsáveis por uma etapa da síntese de

glicoconjugados. Do mesmo modo, é muito importante que proteínas

mal formadas que tenham escapado para o Golgi voltem para o

retículo endoplasmático, de onde serão translocadas para o citoplasma

e destruídas pelo sistema ubiquitina-proteassomos (aula 18). Se os

microtúbulos forem despolimerizados, também essas etapas do tráfego

de vesículas deixam de acontecer (Figura 25.3).

Analisando em conjunto os efeitos da despolimerização de

microtúbulos sobre o tráfego de vesículas, você vai notar que os trechos

afetados são aqueles em que as vesículas se deslocam da região periférica

para o centro da célula, portanto, na direção retrógrada. Já foi testado

experimentalmente, mas você até poderia advinhar: o tráfego retrógrado

usa proteínas motoras da família das dineínas para transportar vesículas

ao longo dos microtúbulos em direção à extremidade minus desses

fi lamentos.

Quanto aos microfi lamentos, alguns pesquisadores têm conseguido

registrar pequenos fi lamentos de actina, com o aspecto de cauda de

cometa, propelindo uma vesícula, assim como acontece com a bactéria

Listeria monocitogenes (veja box na aula 24). Entretanto, essa é uma idéia

ainda não muito generalizada, porque foi observada poucas vezes (Figura

25.4).

RE

microtúbulo

Golgi

Figura 25.3: O deslocamento de vesículas do complexo de Golgi para o retículo endoplasmático depende de microtúbulos.

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SELEÇÃO DA CARGA

Vimos na aula 20 que a grande efi ciência da endocitose mediada

por receptor se deve à concentração do conteúdo das vesículas

revestidas por clatrina. O mecanismo de concentração é a reunião

de vários complexos receptor-ligante na pequena área de membrana

plasmática que vai formar a vesícula, graças à interação das caudas

citoplasmáticas dos receptores com adaptinas e clatrina (Figura 25.5).

Na saída da região trans do complexo de Golgi, ocorre a mesma

concentração de conteúdo, também com auxílio do revestimento de

clatrina, só que com outras adaptinas. As adaptinas são grupos de

proteínas que fazem pontes entre a cauda citoplasmática de receptores,

na membrana plasmática ou no Golgi, e a clatrina. São conhecidos há

bastante tempo dois complexos de adaptinas, o complexo AP1, que

funciona no complexo de Golgi, e o complexo AP2, que funciona na

endocitose mediada por receptor. Recentemente, mais dois complexos

foram descobertos, o AP3, envolvido na formação de lisossomas

especiais, como os melanossomas, e o complexo AP4, presente em

neurônios.

Figura 25.4: Esquema de propulsão de uma vesícula por uma cauda de fi lamentos de actina. Micrografi as de endossomas de ovócito de rã com a cauda de actina formada. Fotos de Taunton et al. J. Cell Biol.148:519, 2000.

Figura 25.5: Formação de uma vesícula revestida por clatrina.

adaptina

clatrina

receptor

carga

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Todos esses grânulos fi cam estocados no citoplasma da célula que

os produziu até que um sinal vindo de fora seja transmitido ao citoplasma

(você estudou esses mecanismos nas aulas 13 e 14) e provoque a exocitose

de muitos grânulos de uma vez só, aumentando a concentração do

conteúdo do grânulo no meio extracelular ou até na corrente sanguínea.

A exocitose de grânulos desse tipo é chamada secreção regulada, enquanto

a exocitose de vesículas que não têm o conteúdo concentrado, carregando

novas moléculas para a própria membrana, sem esperar ou depender

de nenhum sinal, não passando por nenhuma etapa de estocagem no

citoplasma, chama-se secreção constitutiva (Figura 25.7).

Figura 25.6: Um mastócito com o citoplasma carregado de grânulos de histamina, antes (A) e depois (B) do estímulo para exocitose. Micrografi as de Lawson et al., J. Exp. Med. 142: 391, 1975.

Assim, na saída do Golgi, formam-se vesículas transportadoras que

praticamente só contêm enzimas lisossomais e se dirigem ao endossoma

tardio e depois ao lisossoma. Nesse caso, o receptor que interage com as

adaptinas do complexo AP1 é o receptor de manose-6P (aula 20). Você

não acha adequado que as enzimas lisossomais sejam transportadas em

vesículas exclusivas? Com o conteúdo concentrado, outras proteínas são

excluídas da vesícula e não irão parar no lisossoma por engano.

O mecanismo de concentração de carga também é muito adequado à

formação de grânulos de secreção. Esses grânulos são formados no TGN e

contêm grande quantidade de uma mesma carga. Podemos citar como exemplos

os grânulos dos mastócitos, que contêm histamina, as vesículas sinápticas, que

contêm acetilcolina, os grânulos de adrenalina etc. (Figura 25.6).

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OUTROS REVESTIMENTOS

Seguindo a idéia de que o revestimento de clatrina não serve apenas

para concentrar a carga, mas também contribui para a formação da própria

vesícula, os pesquisadores procuraram revestimentos citoplasmáticos

em trechos do tráfego intracelular que não envolvem concentração de

conteúdo, apenas sua seleção.

A busca focalizou especialmente o tráfego de vesículas entre o

retículo endoplasmático e o complexo de Golgi. Nas vesículas que brotam

do retículo, foi encontrado o revestimento de COP II, e nas vesículas que

brotam da rede cis do Golgi, foi encontrado o revestimento de COP I

(Figura 25.8).

Esses revestimentos têm muito em comum, apesar de as proteínas

que formam cada um deles serem diferentes. O revestimento de COP I

é formado por sete proteínas, e o de COP II por quatro. Ambos têm em

comum o mecanismo de associação com a membrana de onde a vesícula

vai brotar (compartimento doador): uma GTPase monomérica serve como

adaptadora do resto do revestimento.

seleçãoproteínas misturadas

RE GOLGI

SECREÇÂO CONSTITUTIVA

SECREÇÂO REGULADA

PARA

LISOSSOMAS

Figura 25.7: Distribuição de moléculas na região trans do Golgi.

Figura 25.8: Micrografi as eletrônicas de vesículas revestidas de clatrina (A), COP I (B) e COP II (C). As fotos estão na mesma escala. A e B, de Orci et al., Cell, 46:171, 1986; C, foto de Barlowe e Orci.

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As GTPASE MONOMÉRICA que regulam o tráfego intracelular

têm uma outra característica em comum: são proteínas ligadas

covalentemente a uma cadeia de ácido graxo, o que lhes permite

inserir-se em membranas. A cadeia de ácido graxo fi ca exposta quando

a proteína está ligada a GTP e se esconde quando a proteína está ligada

a GDP. Por isso, o estado ligado a GTP é ativo e o ligado a GDP desliga

a proteína da membrana, inativando sua função (Figura 25.9).

Figura 25.9: Uma GTPase fi ca inativa quando está ligada a GDP e tem a cadeia lipídica oculta em uma reentrância da molécula, estando solúvel no citoplasma da célula. A mesma proteína ligada a GTP expõe a cadeia lipíca e vai funcionar inserida em uma membrana.

cadeia lipídica

GTPGDP

A B

Para a formação de um revestimento do tipo COP, é preciso

que as adaptadoras desse revestimento, que são GTPases solúveis no

citoplasma, tenham o GDP substituído por GTP, para que exponham a

cadeia lipídica e possam inserir-se na membrana do compartimento de

onde a vesícula vai brotar (Figura 25.10).

GTPase solúvel no citoplasma

GDP GDP GTP

GTP

GEF

membrana do compartimento de onde vai brotar a vesícula

GTPase inserida e ativa

Figura 25.10: Para que a GTPase fi que ativa, uma proteína da membrana do compartimento doa- dor rouba o GDP, que logo é substituído por GTP, ativando a GTPase. A proteína que rouba o GDP é conhecida como GEF, de GTP exchanging factor.

PA R A D I N H A ES P E R T A

Atenção! Para que a GTPase ligada a GDP passe a estar ligada a GTP, é preciso que o nucleotídeo inteiro seja retirado. Logo ele será substituído por GTP, que é muito mais abundante no citoplasma que a forma GDP. A conversão direta de GDP a GTP pelo acréscimo do terceiro fosfato demanda energia e só acontece na mitocôndria, como vamos ver nas próximas aulas.

GTPASE MONOMÉRICA É uma proteína formada por uma única cadeia que está ligada a GTP e é capaz de hidrolizá-lo. Assim como as outras GTPases que você conheceu na aula de sinalização celular (aula 13), essas proteínas estão ativas quando ligadas a GTP e fi cam inativas depois de hidrolizá-lo.

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Depois de inserida na membrana, a GTPase vai servir de adaptadora

das outras proteínas do revestimento (Figura 25.11). As adaptadoras foram

identificadas em leveduras e são semelhantes, mas não iguais, nas várias

etapas do tráfego de vesículas. A adaptadora de COP I se chama ARF e a de

COP II se chama Sar 1.

proteínas do revestimento

A

B

vesícula brotando

CITOPLASMA

carga transmembrana

carga solúvel

LÚMEN DO RE

Sar 1 - GTP

subunidades de COP II

carga transmembrana

chaperonas ligadas a proteínas malformadas

Figura 25.11: Em A, esquema representando apenas as proteínas do revestimento, inclusive a adaptadora inserida na membrana do compartimento doador. Em B, um brotamento de vesículas no retículo endoplasmático revestido por COP II e sua adaptadora Sar1, onde, além das proteínas do revestimento, foram também representadas proteínas transmembrana e proteínas solúveis do lúmen do compartimento doador que serão incluídas como carga na vesícula em formação e outras proteínas, como chaperonas, por exemplo, que sendo residentes no retículo não serão incluídas.

De novo as leveduras

Muitas etapas do tráfego intracelular de vesículas foram primeiro identifi cadas em leveduras. A razão disso é que é muito mais fácil produzir nesses fungos mutantes estáveis defi cientes em alguma etapa do tráfego intracelular. Correlacionando o fenótipo do mutante, ou seja, a etapa que ele não consegue fazer, com o gene que foi deletado pode-se inferir qual o papel da proteína que está faltando. Os mutantes de levedura defi cientes na secreção celular foram classifi cados como mutantes sec. A maioria das proteínas de mamífero que funcionam no tráfego de vesículas tem uma proteína correspondente em leveduras classifi cada como sec.

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Figura 25.13: Duas vesículas que tiverem brotado do mesmo compartimento doador, mas carregando marcadores diferentes, vão se fundir com compartimentos-alvo diferentes, onde cada uma encontrará marcadores complementares.

Compartimento A

Compartimento B

Compartimento

doador

Ao contrário do revestimento de clatrina, que despolimeriza logo

que a vesícula se solta do compartimento doador, as COPs continuam

revestindo as vesículas até que elas atinjam seu destino. Por isso, quando

os revestimentos do tipo COP foram descobertos, tentou-se correlacionar

as etapas do tráfego em que cada um deles ocorria com a direção que a

vesícula iria seguir, anterógrada ou retrógrada. Depois, com tantas etapas

identificadas, essa idéia não ficou muito clara (Figura 25.12).

Figura 25.12: As etapas do tráfego e os revestimentos que as regulam.

secreção regulada

secreção constitutiva

GOLGIRE

MP

clatrina

COP I

COP II

LEGENDA

FUSÃO DE MEMBRANAS E A ESPECIFICIDADE DO TRÁFEGO DE VESÍCULAS

Por que as vesículas só se fundem com o compartimento a que estão

destinadas? O que signifi ca estarem destinadas? Cada vesícula tem em sua

membrana, voltado para o citoplasma, um conjunto de marcadores que será

reconhecido por marcadores complementares no compartimento-alvo (Figura

25.13). Assim, todas as vesículas se fundirão ao compartimento certo.

Os dois tipos mais importantes de marcadores de membrana das

vesículas e compartimentos celulares são as SNAREs e as Rabs.

via endocítica

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SNARES

As SNAREs são proteínas de cadeia longa e superespiralada

responsáveis pelo reconhecimento entre vesículas e compartimentos e

também pela própria fusão entre suas membranas. Elas estão presentes

tanto na membrana da vesícula quanto na membrana do compartimento

receptor. A SNARE do compartimento doador, que vai ser incluída na

vesícula que está brotando, é dita v-SNARE (de vesicle SNARE) e a SNARE

complementar que está na membrana do compartimento-alvo é a t-SNARE

(de target SNARE) (Figura 25.14).

As SNAREs já tinham sido identifi cadas em leveduras (pelo método

da seleção de mutantes) e em neurônios de mamífero (veja o box). Sua

semelhança com proteínas virais que promovem fusão de membrana

fez com que durante alguns anos se acreditasse que tinham apenas essa

função. Lipossomas (vesículas compostas apenas por bicamada lipídica,

sem proteínas) a que se adicionaram apenas SNAREs fundiram-se in

vitro. Esses experimentos mostraram que apenas essas proteínas já eram

sufi cientes para conferir especifi cidade aos eventos de fusão. Traduzindo:

para que dois lipossomas se fundissem era necessário que estivessem

carregando SNAREs complementares.

Figura 25.14: O reconhe- cimento entre v-SNARE e t-SNARE é o responsável pela especificidade da fusão entre vesículas e compartimentos.

Compartimento A

Compartimento B

carga B

carga A

Compartimento

doador v-SNARE

t-SNARE

t-SNARE

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A fusão de membranas pode ser dividida em duas etapas:

1) ancoramento (docking): as SNAREs da vesícula e do

compartimento se reconhecem e a vesícula ali se ancora (Figura 25.16).

Figura 25.15: Quando uma vesícula sináptica vai ser exocitada, a sinaptobrevina (v- SNARE) que está em sua membrana será reconhecida pela sintaxina e pela snap-25 (t-SNAREs) que estão na face citoplasmática da membrana do neurônio.

membrana plasmática do neurônio

t-SNARE (sanap-25)

t-SNARE (sinaptobrevina)

t-SNARE (sintaxina)

CITOPLASMA

Figura 25.16: Etapas da fusão entre duas vesículas, que levam cargas dife- rentes, a seus respectivos compartimentos-alvo. Note que depois da fusão pro- priamente dita o complexo v-SNARE e t-SNARE fi ca no mesmo compartimento.

complexo v-t-SNAREcomplexo v-t-SNARE

1 - RECONHECIMENTO 2 - FUSÃO

A liberação de neurotransmissores depende das SNAREs

O mecanismo de estocagem de vesículas sinápticas no terminal pré-sináptico e sua exocitose regulada na membrana do neurônio tem sido objeto de intensos estudos (você vai saber muito mais sobre o assunto em uma aula dedicada aos neurônios, em Biologia Celular II). Associados aos estudos genéticos em levedura e aos experimentos de fusão de vesículas in vitro, os resultados obtidos em neurônio formam todo o conjunto de conhecimentos atuais sobre o assunto. A estrutura do complexo SNARE formado antes da fusão de vesículas foi resolvido pelo seqüenciamento das proteínas envolvidas e modelagem molecular de sua interação (Figura 25.15).

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2) fusão propriamente dita: as SNAREs mudam de conformação

puxando as membranas da vesícula e do compartimento uma de encontro à

outra, tornando-as tão próximas que a água que separa as duas bicamadas

é excluída, possibilitando a fusão. O próprio processo de fusão das duas

bicamadas passa por etapas, mas estas são tão rápidas que ainda não é possível

discriminar experimentalmente, sendo estudadas por hipóteses baseadas nas

propriedades fi sico-químicas das bicamadas lipídicas (Figura 25.17).

Volte à fi gura 25.16 e repare que as duas SNAREs, a que veio com

a vesícula e a que estava no compartimento, passaram a estar na mesma

membrana, o que inviabiliza sua função. Para separá-las, é necessário ATP

e o trabalho de proteínas auxiliares. A mais conhecida é chamada NSF,

uma espécie de chaperona solúvel no citoplasma, que pode agir, com a

ajuda de proteínas adaptadoras, na separação de complexos v-t SNARE

de qualquer membrana (Figura 25.18). Depois de separar o complexo,

a SNARE que veio com a vesícula pode voltar ao seu compartimento de

origem, numa nova vesícula que vai brotar, fazendo o caminho de volta.

Figura 25.17: As etapas hipotéticas do processo de fusão de membra- nas. Em A, a vesícula se aproximou do com- partimento-alvo e os complexos v-t SNARE se reconheceram, levando a uma mudança de confor- mação que os aproxima (B), chegando a excluir a água da área entre as duas membranas. Com o contato estreito forçado pelas SNAREs, forma-se um “ poro de fusão” (C), que transforma as duas bicamadas em uma só (D), que termina por se romper (E).

C

D

E

A

B

H2O H2O H2O

H2O

H2O H2O

H2O

H2O H2O

H2O

H2O H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O H2O

H2O

10nm

Figura 25.18: O mecanismo de separação das SNAREs.

RECONHECIMENTO FUSÃO

complexo v-t SNARE

adaptadoras

SNARE desacopladas

NSF

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Biologia Celular I | Tráfego Intracelular de Vesículas

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A ESPECIFICIDADE DOS PROCESSOS DE FUSÃO DE VESÍCULAS TEM GARANTIAS: O PAPEL DAS RABS

As Rabs também são marcadores de vesículas, assim como as

SNAREs, e agem em conjunto com elas para garantir a especifi cidade

do processo de fusão, ou seja, para garantir que uma vesícula não

vá se fundir acidentalmente com o compartimento errado. Rabs são

GTPases monoméricas que têm uma cadeia lipídica exposta no estado

ativo – ligado a GTP – e escondida no estado inativo – ligado a GDP

– quando então a Rab fi ca solúvel no citoplasma, exatamente como na

Figura 25.9. Veja na Figura 25.19 como as Rabs agem em conjunto

com as SNAREs.

Nem todas as funções das Rabs são conhecidas. Enquanto uma

Rab está ativada e inserida em uma membrana, ela pode ativar outras

moléculas, que são ditas efetoras de Rab. Dentre os efetores de Rab,

supõe-se que estejam as moléculas que interagem com as proteínas

motoras e fazem as vesículas deslizarem ao longo de microtúbulos.

Figura 25.19: No com- partimento doador, a Rab será ativada por uma GEF (como na fi gura 25.10), que rouba seu GDP e substitui por GTP, causando a exposição da cadeia lipídica e a conseqüente inserção na membrana daquele compartimento (é a membrana que está mais perto e a cadeia lipídica preci-sa se esconder da água rápido!). No com- partimento-alvo a Rab será reconhecida por uma molécula que vai prendê-la, funcionando como receptor, e depois estimular sua atividade GTPásica. Ao hidrolizar o GTP, a Rab volta ao estado solúvel no citoplasma.

v-SNARE

Rab ativa

RECONHECIMENTO FUSÃO

Rab inativa

CITOPLASMA

COMPARTIMENTO ALVO

1

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Sopa de letrinhas

Você achou complicados os nomes das moléculas nesse assunto de fusão de membranas? Realmente fi ca mais fácil de entender esses nomes se a gente sabe de onde eles saíram. Um dos primeiros resultados dos experimentos programados para estudar os fatores que regulam a fusão entre os compartimentos celulares foi usando uma droga que bloqueava completamente todos os processos de fusão de membrana, a N-etilmaleimida. O próximo passo foi identifi car a molécula que era sensível a essa droga: era o NSF, fator sensível a N-etilmaleimida (N-etilmaleimide sensitive factor). Mais alguns estudos e descobriram que o NSF não agia sozinho, precisava de auxiliares, que foram coletivamente chamadas SNAP (soluble NSF adaptor proteins, proteínas solúveis adaptadoras de NSF). Pouco tempo depois, foram identifi cadas, sempre em leveduras ou neurônios, as proteínas de membrana às quais o NSF e o SNAP se acoplavam: fi nalmente eram descobertas as SNARE (SNAP receptors, receptores de SNAP).

Rabs, uma grande família

As Rabs e as adaptadoras de COP I e II (chamam-se ARF e Sar1, respectivamente) são componentes da superfamília Ras das GTPases monoméricas, à qual tam- bém pertencem outras moléculas que você já conhece, como a própria Ras (aula 14), a dinamina (aula 20), a tubulina (aula 23), e outras que você ainda vai conhecer em Biologia Celular II, como Rac e Rho (funcionam no controle do ciclo celular) e Ran (funciona no transporte entre núcleo e citoplasma). Elas têm em comum a característica de funcionarem como um interruptor molecular, que liga quando associado a GTP e desliga quando associado a GDP.

Com quase 40 membros conhecidos, a subfamília das Rab é sem dúvi- da a maior de todas. Cada compartimento celular tem pelo menos uma Rab característica em sua membrana. Veja quadro 25.1 a seguir.

Proteína Organela Rab 1 Retículo e Golgi

Rab 2 Rede cis do Golgi

Rab 3A Vesículas sinápticas, grânulos de secreção

Rab 4 Endossoma de reciclagem

Rab 5A Membrana plasmática, vesículas revestidas de clatrina

Rab 5C Endossoma inicial

Rab 6 Golgi medial e trans

Rab 7 Endossoma tardio

Rab 9 Endossoma tardio

Rab 11 Endossoma de reciclagem

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Biologia Celular I | Tráfego Intracelular de Vesículas

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O tráfego intracelular de vesículas está organizado em duas direções:

TRÁFEGO RETRÓGRADO TRÁFEGO ANTERÓGRADO

(setas cheias) (setas pontilhadas)

Membrana plasmática retículo endoplasmático

endossoma inicial complexo de Golgi

endossoma tardio grânulos de secreção

R E S U M O

As setas maiores representam a direção majoritária e as menores representam

tráfego em menor escala, geralmente vias de reciclagem.

O tráfego retrógrado depende de microtúbulos.

A secreção de vesículas da rede trans do Golgi para a membrana plasmática pode

ser:

• constitutiva, reciclando elementos da própria membrana;

• regulada, fi cando estocada no citoplasma, aguardando um sinal para

exocitose.

Além da via endocítica, o revestimento de clatrina também funciona no complexo

de Golgi, concentrando o conteúdo de vesículas de secreção regulada ou que vão

para os lisossomas.

Os revestimentos de COP I e II funcionam selecionando a carga que será incluída

em vesículas que brotam do retículo e do complexo de Golgi, mas não concentram

o conteúdo.

lisossomas membrana plasmática

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As vesículas possuem marcadores moleculares em sua face citoplasmática.

Esses marcadores regulam a especifi cidade do tráfego e medeiam a fusão de

vesículas.

Os marcadores de vesículas do tipo SNARE promovem a fusão das membranas

aproximando as bicamadas até que se fundam.

Os marcadores Rab garantem a especifi cidade do tráfego e identifi cam os

compartimentos.

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