Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii - конспект - Химия - Часть 2, Конспект из Химия
zaycev_ia
zaycev_ia21 June 2013

Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii - конспект - Химия - Часть 2, Конспект из Химия

PDF (299.8 KB)
22 страница
433количество посещений
Описание
I.M. Sechenov Moscow Medical Academy. Реферат по химии. Выделение и очистка препаратов протеиназы. Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение. Глава 2. Материалы и методы исследования. Определение протеоли...
20очки
пункты необходимо загрузить
этот документ
скачать документ
предварительный показ3 страница / 22
это только предварительный показ
консультироваться и скачать документ
это только предварительный показ
консультироваться и скачать документ
предварительный показ закончен
консультироваться и скачать документ
это только предварительный показ
консультироваться и скачать документ
это только предварительный показ
консультироваться и скачать документ
предварительный показ закончен
консультироваться и скачать документ

1

вторичных белковых ресурсов и отходов мясной промышленности и

созданием безотходных технологий. Обеспечение устойчивого подъёма в этом

направлении может быть достигнуто за счет разработки эффективных

микробных препаратов. Способностью синтезировать специфические

ферменты, расщепляющие животные белки, обладают многие

микроорганизмы. Среди них выделяются виды, эффективно гидролизующие

белки типа коллагена, эластина, кератина. Показана возможность применения

для этих целей протеолитических ферментов на основе Bacillus, Pseudomonas,

Streptomyces, Aspergillus, Penicillium.

При использовании коллагенофильного препарата ферментов из

Penicillium wortmannii ВКМ – 2091 степень гидролиза коллагенов достигает 60

– 65%.

Анализ гидролизатов указывает на богатый набор и высокое содержание

свободных аминокислот: пролина, цистина, валина, аланина, изолейцина,

лейцина, фенилаланина, лизина, серина, глутаминовой и аспарагиновой

кислот. При этом перевариваемость сырья увеличивается в 2,0 – 2,5 раза.

Такие гидролизаты являются прекрасной основой для получения пищевых

добавок, модифицированных продуктов и кормовых концентратов.

Ряд методов получения ферментативных гидролизатов предложен

французскими исследователями, которые использовали ферменты животного

(панкреатин, трипсин, химотрипсин), растительного (фицин, бромелаин,

папаин) и микробного (B. subtilis Str. fradiae Str. griseus) происхождения.

В Германии получают гидролизаты из малоценных продуктов

переработки тушек птицы. В измельчённое сырьё вносят препараты из B.

subtilis, A. оryzae, P. latex, A. melleus. Гидролизат сушат и используют для

приготовления супов. При этом потери аминокислот, в частности, лизина,

минимальны.

1

Зарубежные авторы разработали способы получения пищевых

гидролизатов путём автолиза сырья содержащимися в нём ферментами.

Рекомендовано также получать пищевые гидролизаты из костного остатка

после механической обвалки тушек птицы. Согласно этому способу для

получения гидролизатов используют микробные протеолитические препараты

из B. subtilis, P. latex, A. melleus.

Для более эффективного гидролиза белков животного происхождения

предлагается ряд комбинированных способов. При этом применяется

предварительная кислотная или щелочная обработка, а затем –

ферментативный гидролиз.

В последнее время вырос практический интерес к способам

рационального использования малоценных коллагенсодержащих продуктов

убоя птицы для получения белковых гидролизатов, которые находят

применение не только как компонент пищи, но и как диетический продукт для

лечебного питания. Отечественными исследователями проведены работы и

достигнуты хорошие результаты по получению гидролизатов из голов и ног

сухопутной птицы. Для ферментативной обработки с последующим

получением белково-жировой эмульсии предлагается использование

препаратов ферментов из P. wortmannii ВКМ-2091 и Str. chromogenes graecus

0832, которые соответственно в большей степени обладают коллагеназной и

кератинолитической активностями.

Конкретные условия гидролиза, определённые с помощью методов

математической статистики, легли в основу нового способа получения

белково-жировой добавки – заменителя основного сырья в рецептурах

фаршевых мясных изделий. Способ заключается в следующем: промытые

свежие ноги и головы сухопутной птицы измельчают, а затем гомогенизируют

с добавлением воды. Это необходимо для разрушения тканевых структур и

частичной механической деструкции особенно прочных белков – коллагена и

1

кератина. Измельчённое сырьё (гомогенаты) нагревают до 80 – 90оС для

частичной деструкции упроченных белков. Затем сырьё подвергают

ферментативной обработке.

Подготовленные гомогенаты сырья охлаждают и вносят специфическую

энзимную композицию на основе микробных препаратов. В результате

максимально образуются водорастворимые белковые фракции,

перивариваемость гидролизата в 2,0 – 2,5 раза выше, чем исходного сырья.

Изготовленные в соответствии с рекомендациями и технологическими

инструкциями готовые изделия имеют хороший товарный вид, высокие

вкусовые свойства и биологическую ценность при увеличении выхода на 1,5 –

3,0%.

Аспекты применения на пищевые цели специфического

коллагенсодержащего сырья – шквары, получаемой в виде отхода при

вытопке жиров и содержащей 22 – 44% белков (в основном коллагенов),

известны [3].

Гомогенизированная шквара – ценное белковое сырьё. В её составе

присутствуют такие незаменимые аминокислоты, как валин, лизин,

фенилаланин. Для улучшения функционально-технологических свойств

шквары также целесообразно применение ферментов, специфичных к

гидролизу фибриллярных белков. В нейтральной зоне рН при умеренных

температурах наиболее эффективными оказались протеолитические

препараты глубинной культуры микромицета Penicillium wortmannii.

Полученный гидролизат отличается следующими показателями:

значительная доля свободных аминокислот и общие изменения во

фракционном составе белков.

В результате нарушения белково-липидных комплексов создаются

условия для дополнительного получения жира.

1

Возможности гидролизатов различного коллагенсодержащего сырья

имеют огромные перспективы при получении специальных продуктов

питания, в том числе профилактических.

Применение ферментных препаратов при обработке кожевенного сырья

является одним из перспективных методов совершенствования

технологических процессов кожевенного производства.

Присутствие в шкуре растворимых и нерастворимых компонентов

различной химической природы, многоступенчатая структурная организация

основного белка шкуры – коллагена – определяют сложный характер реакций

при ферментативной обработке.

Среди подготовительных процессов кожевенного производства

наиболее трудоёмким является обезволашивание. Наиболее перспективным

для всех видов сырья показало себя обезволашивание с помощью ферментов.

В достижении эффекта обезволашивания установлена целесообразность

применения ферментов, действующих на разные классы соединений дермы –

белки, углеводы, жировые вещества, ведущее место среди которых

принадлежит специальным протеазам. Основной фактор ускорения процесса –

изменение структуры дермы, способствующее увеличению её проницаемости

и пористости, скорости проникания фермента к волосяной сумке.

Одним из направлений в проведении ферментативных обработок

является применение композиций ферментных препаратов.

Благодаря ферментативным обработкам, потери коллагена на 20 – 30%

меньше, чем при традиционных методах, при этом из шкуры удаляется

основная масса неколлагеновых белков, углеводов, аминосахаров и

происходит разделение структурных компонентов коллагена. Это позволяет

проводить последующее золение в более мягких условиях, с уменьшением

концентрации химических реагентов и длительности процесса.

1

Важной операцией в получении мягкой кожи с гладкой шелковистой

лицевой поверхностью, является процесс мягчения голья. В процессе

мягчения под действием ферментов в голье происходит:

 разложение кератозы, удаление её и других продуктов распада белков,

гидролиз остатков эпидермиса, гидролиз и удаление межволоконных

веществ, эмульгирование и удаление липидов;

 видоизменение эластиновых волокон;

 разделение коллагеновых волокон на отдельные фибриллы.

Одним из направлений совершенствования процесса мягчения является

использование ферментных препаратов, действующих в кислой среде, что

даёт возможность объединить в один процесс мягчение и пикелевание.

Мягчение в кислой среде способствует получению однородного грифа и

текучести по всей площади кожи.

Из-за ряда существенных преимуществ, предпочтение отдаётся

микробным препаратам. Среди них положительно опробированны препараты,

полученные из грибов Aspergillus, бактерий Bacillus, актиномицетов [1,4].

В результате отбора микробных продуцентов авторами [5] предложены

Penicillium wortmannii ВКМ – 2091 и Streptomyces chromogenes s.graecus 0832.

Установлено, что Str. chromogenes наиболее кератинофилен, однако по

уровню коллагеназной активности этот продуцент был ниже промышленного

B. subtilis. Высоким уровнем коллагеназной и кератиназной активности при

гидролизе пера отличаются протеолитические комплексы ферментов P.

wortmannii, включающие две специфические протеиназы с различными

физико-химическими свойствами, удовлетворяющие требованиям мясной

промышленности [2].

Целенаправленное применение комплекса ферментов открыло

перспективы к созданию принципиально нового подхода к обработке

кишечного сырья для получения натуральной колбасной оболочки. При этом

1

трудоёмкие процессы механической обработки возможно заменить

применением ферментных препаратов.

Известно, что серозный слой, подлежащий удалению, включает

жировые и белковые компоненты. Для их разрушения разработан в

Московской государственной технологической академии пищевых

производств и получен в опытно-промышленных условиях препарат путём

высушивания культуральной жидкости Rhizopus oryzae.

Сравнительные гистологические исследования тканей кишечного сырья,

обработанного механическим и ферментативным способами, показали

полностью идентичную структуру. Однако в случае ферментативной

обработки поверхность не деформирована, на ней полностью отсутствуют

штрихи, порезы и другие механические дефекты.

Разработанное техническое решение имеет ряд преимуществ: полностью

заменяется сложное электромеханическое оборудование по разрыхлению и

удалению серозных слоёв (шляма), отсутствуют разрывы кишок, повышается

качество сырья, улучшаются условия труда.

Основной задачей получения коллагеновых масс является максимальная

очистка исходного сырья и выделение целевого продукта – коллагена – в

свободном от примесей виде. В качестве ферментных препаратов используют

прототерризин П10х (источник Asp. terricoba) или протосубтилин Г10х

(источник Bac. subtilis). Способ характеризуется высокой степенью очистки

исходного сырья от балластных компонентов под действием ферментов

микробиального происхождения, их низкой себестоимостью, высокой

степенью экологичности производства.

Сложность и трудоёмкость приготовления препаратов ферментов,

потеря значительной доли коллагена в результате неполной его экстракции и

денатурации под влиянием повышенной температуры, действующей

длительное время, снижают значение методов обработки коллагена

1

протеолитическими ферментами животного и растительного происхождения.

Новые перспективы и реальная возможность внедрения биотехнологических

методов в производство возникает при использовании микробных

ферментных препаратов, отличающихся высокой стабильностью,

возможностью варьировать специфику биохимических свойств. Было

проведено изучение эффективности ферментативного гидролиза балластных

компонентов различных коллагенсодержащих источников с применением

ряда микробных препаратов: протосубтилина, протомегетерина, липоризина,

выделенных из соответствующих микроорганизмов (B. subtilis, B. megaterium,

R. oryzae).

Таким образом, для мясной промышленности наибольшую перспективу

имеют микробные ферментные препараты и клетки, характерные

специфической активностью в отношении фибриллярных белков упроченной

структуры.

Оценка эффективности биотехнологий переработки

коллагенсодержащего сырья предполагает экономию 10 – 20% основного

сырья при получении полноценных мясных продуктов и 70 – 100% - в случае

выработки искусственных оболочек и плёнок.

Применение специфических ферментных препаратов и клеток позволяет

осуществить принципиально новые технологии глубокой и комплексной

переработки основного, вторичного сырья и не пищевых отходов с

реализацией режимов в естественных диапазонах температуры, рН среды и

давления, минимальными энергозатратами, без дополнительных капитальных

вложений и нежелательных экологических воздействий.

1

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Определение величины рН.

Величину рН определяли потенциометрически на рН-метре ЛПУ-01.

Для измерений значений рН растворов в температуре отличной от 20oС,

применяли автоматическую компенсацию.

2.2 Метод определения протеолитической активности.

Протеолитическую активность (ПА) определяли по ГОСТ 20264.2-74

[12]. Субстратом служил 2% раствор казеината натрия, к которому добавляли

2см3 раствора фермента и помещали в ультратермостат при температуре

30oС. После проведения гидролиза в течение 10 минут в опытную пробирку

приливали 4см3 раствора трихлоруксусной кислоты. Выдерживали ещё 20

минут при температуре 30oС. Затем фильтровали в сухие пробирки. К 1см3

фильтрата добавляли 5см3 0,5М раствора карбоната натрия, перемешивали и

добавляли 1см3 рабочего раствора Фолина. Через 30 минут измеряли

оптическую плотность раствора на ФЭКе КФК-2 при 670 нм в кюветах с

поглощающим свет слоем 10 мм против контроля. За единицу ПА принимают

такое количество фермента, которое за 1 минуту при 30oС катализировало

переход в неосаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты гидролиза

казеината натрия в количестве, соответствующем 1 ммолю тирозина (1ммоль

тирозина равен 0,181мг).

2.3 Определение коллагеназной активности.

1

Коллагеназную активность определяли по содержанию оксипролина в

смеси, образовавшегося в результате действия фермента на нативный

коллаген. С этой целью готовили реактив для окисления: 28,2 г хлорамина Т

растворяли в 40см3 воды для получения 0,05М концентрации, добавляли

60см3 ацитат-цитратного буфера с рН 6,0. К 2см3 анализируемой пробы,

содержащей 2 - 20 см3 оксипролина, приливали 1мл реактива для окисления,

встряхивали и оставляли на 20 минут при комнатной температуре. Затем в

смесь вносили 2 – 1 см3 4М хлорной кислоты, встряхивали и через 5 минут

приливали 3см3 10% раствора n-диметиламинобензальдегида в

метилцеллосольфе. Пробу нагревали 15 минут в водяной бане при 150оС и

после охлаждения фотометрировали с зелёным светофильтром на ФЭК-56М

(555нм).

Гидролиз коллагена вели в следующих условиях: 20 мг нативного

коллагена обрабатывали исследуемым ферментным препаратом в присутствии

буферной системы с рН 7,0 так, чтобы общий объём составил 25см3. Смесь

инкубировали в течение 1 часа при 37oС. Контролем служили пробы,

инкубированные в тех же условиях, но без фермента, предварительно

остановив реакцию внесением 0,5см3 этанола и центрифугированием смеси в

течение 15 минут при 6000 чмин-1.

Активность коллагеназы выражали либо в ммолях оксипролина на 1 мг

белка за 60 минут, либо в процентах растворения.

2.4 Определение молекулярной массы фермента.

1

Молекулярную массу определяли с помощью гель-фильтрации на

сефадексе У-100. Расчёт проводили по формуле:

LgM=5,941-0,847 (V/V0),

где V – объём выхода фермента;

V0 – свободный объём колонки.

2.5 Определение содержания аминного азота.

Метод основан на образовании цветного комплекса при взаимодействии

аминогрупп аминокислот с гидроксидом меди. В пробирку, содержащую 100

мг сухого медного реактива, вносили 4см3 анализируемой пробы,

предварительно нейтрализованной сухим бикарбонатом натрия, выдерживали

15 минут периодически встряхивая. Затем центрифугировали и измеряли

оптическую плотность на ФЗКе КФК-2 при 590 нм. В контроле вместо 4см3

пробы присутствовало 4см3 дистилированной воды. Содержание аминного

азота рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для известных

аминокислот.

2.6 Электрофоретические исследования.

2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов.

Электрофорез проводили по методу Дэвиса на приборе фирмы Reanol

(Венгрия) в щелочной буферной системе, рН 8,9. Концентрация акриламина в

мелкопористом геле составила 5%. Длина мелкопористого геля в трубочке

составила 5,5 см. Растворы для полимеризации готовили обычным способом.

Исследуемый образец, содержащий 20 – 30 мкг белка смешивали в

1

соотношении 1 : 1 с 40% раствором сахарозы и наносили на трубочку с гелем.

Объём образца не превышал 0,2 см3. Поверх образца осторожно наслаивали

электродный буфер, который содержал в 1 л 0,6 г

трис-(гидроксиметил)-амино-метана и 2,88 г глицина.

В верхний резервуар прибора вносили 1 см3 0,001% раствора

бромфенолсинего для контроля за движением фронта подвижных ионов. В

первые 10 – 15 минут сила тока составила 1мА на трубочку, а затем 2,5мА.

После окончания электрофоретического разделения гели вынимали из

трубочек и проводили окрашивание. Окрашивание проводили раствором

амидочерного с массовой долей 0,5, приготовленного с массовой долей 7

уксусной кислоты. Окрашивание проводили 20 – 30 минут. Краситель

отмывали с массовой долей 7 уксусной кислотой с многократной сменой

раствора.

2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ [16].

Для проявления в гелях полос с протеиназой их выдерживали в

денатурированном растворе гемоглобина 2% концентрации в течение 15 – 30

минут при температуре 30oС. Затем промывали несколько раз

дистиллированной водой и переносили в раствор амидочерного. Проводили

окрашивание в течение 20 – 30 минут. Краситель отмывали 7% уксусной

кислотой. Если в гелях присутствовала протеиназа, то появлялись белые

полосы.

Все опыты, описанные в работе, проводили 3 –4 раза, аналитические

определения для каждой пробы проводили в двух – трёх повторностях. В

таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое

1

значение есть среднее из двух или трех определений. Обсуждаются только те

результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте.

1

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕИНАЗЫ

PENICILLIUM WORTMANNII 2091 И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

Известно, что микроорганизмы синтезируют богатые набором

ферментов комплексы. Поэтому важным этапом в получении препаратов

направленного действия является изучение условий их выделения, очистки от

сопутствующих биологически активных и баластных веществ. В связи с малой

изученностью представителей грибов Penicillium этот этап представляет

особую важность.

3.1 Разработка условий выделения препарата

Penicillium wortmannii BKMF 2091.

Для выделения ферментов из различных сред в лабораторных условиях

и в промышленности чаще всего применяют органические растворители и

нейтральные соли.

Эффект осаждения белков органическими растворителями, как известно

[7], основан на явлении уменьшения сольватации полярных групп фермента.

Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности

белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При

этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение

белковых молекул.

В качестве осадителей использовали 96,5% этанол, 98,0% изопропанол,

химически чистый ацетон и сульфат аммония. Органические растворители и

сульфат аммония добавляли к охлажденной до 0 – 4oС культуральной

жидкости Pen. Wortmannii 2091 при различных значениях рН и постоянном

перемешивании. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием,

1

растворяли в небольшом объёме дистиллированной воды и определяли

протеолитическую активность.

Результаты исследования влияния рН на полноту осаждения

протеолитического комплекса при концентрации растворителей 60%

представлены на рис. 1, из которого видно, что оптимальным является

значение рН 7,5 при использовании всех видов органических растворителей.

Вероятно, изоэлектрическая точка для данного фермента лежит в этой области

рН.

В дальнейшем нами проводились исследования по влиянию

концентрации органических растворителей на выход фермента при

оптимальном значении рН. Наблюдалось монотонное осаждение фермента

при последовательном увеличении концентраций осадителей, выход фермента

возрастал до определённого предела (табл. 1).

Как видно из табл. 1, концентрация органических растворителей

значительно влияет как на выход протеолитического комплекса, так и на

степень его очистки. При использовании этанола наиболее эффективной для

выхода ПА была концентрация 72,0%. Степень очистки 1,27. Максимальный

выход 98,5% по активности.

Оптимальная концентрация ацетона 66,6% (в объёмных соотношениях

1: 2). Степень очистки была более высокой, чем для этанола (1,5 раза) –

однако выход по активности всего 62%. Лучшим органическим осадителем

для протеиназы Pen. Wortmannii 2091 явился изопропанол. При концентрации

его в смеси 50% выход протеиназы составил 90, 5%, степень очистки 2,78 и

удельная активность 3,06.

Таким образом, изопропанол избирательно осаждает протеолитические

ферменты, что повышает степень их очистки и снижает содержание

баластных примесей. Однако на практике вполне можно использовать и

этанол.

1

В дальнейшем проведены исследования по осаждению протеиназы

сульфатом аммония. Было установлено, что при оптимальных условиях

(степень насыщения 0,8 рН 7,5) выход фермента составил всего 23%. Низкий

вы-

1

1

Таблица 1

Получение препарата протеиназы из культуральной жидкости Penicillium wortmannii 2091

осаждением органическими растворителями.

Содержание осадителя

Общая

активность

, ед

Белок,

мг/см3 Общий

белок, мг

Вес

препаратов

, мг

Удельная

активность

, ед/мг

белка

Выход по

активности

, %

Очистка

В

объёмных

отношения

х

В %

Ацетон

Культуральная жидкость рН 7,5

- - 2,5 2,250 62,5 - 1,10 100,0 1,00

1:1 50 179,0 0,180 21,6 120 0,99 17,4 0,90

1:2 66,6 222,0 0,133 46,4 349 1,67 62,0 1,50

1:3 75,0 213,0 0,233 51,9 223 0,91 38,0 0,82

1:4 80,0 203,0 0,216 64,6 299 0,94 49,0 0,85

Изопропанол

Культуральная жидкость рН 7,5

- - 2,5 2,250 62,5 - 1,10 100,0 1,00

ПА , %

Рис. 1. Влияние величины рН на осаждение протеолитического комплекса различными растворителями: ось абсцисс – величина рН; ось ординат – выход по активности в %;

1

2

3

1

1:1 50,0 392,0 0,128 36,9 288 3,06 90,5 2,78

1:2 66,6 385,4 0,232 67,4 290 1,65 92,0 1,50

1:3 75,0 215,0 0,282 211,5 350 0,76 60,0 0,69

1:4 80,0 183,0 0,132 42,2 320 1,39 46,0 1,26

Этанол

Культуральная жидкость рН 7,5

- - 2,5 2,250 62,5 - 1,10 100,0 1,00

1:1 48,0 320,3 0,396 85,1 215 0,80 55,0 0,73

1:2 64,0 366,7 0,340 90,1 265 1,08 77,6 0,98

1:3 72,0 385,4 0,276 135,2 320 1,40 98,5 1,27

1:4 80,0 349,6 0,250 160,0 335 1,40 93,7 1,27

1

ход фермента не позволил в дальнейшем использовать эту соль для получения

препарата Pen. Wortmannii BKMF 2091.

Из анализа вышеприведённых данных можно сделать вывод, что для

осаждения препарата протеиназы целесообразно применение этанола и

изопропанола. В зависимости от назначения препарата возможно применение

этого или иного растворителя с практически одинаковым эффектом.

3.2 Фракционирование протеолитического комплексного

препарата ферментов.

Полученный осаждением органическими растворителями препарат нами

назван „протовортманин Г10х”. В дальнейшем представляло интерес изучить

его компонентный состав и идентифицировать протеолитические фракции.

Для этого был использован метод дискового электрофореза в ПААГ.

Электорофорез вели с учётом „нейтральной’’природы протеолитического

комплекса.

Компонентный состав препарата представлен четырьмя фракциями,

отличающимися подвижностью в электрическом поле, размерами и

интенсивностью окраски белковых полос.

Идентификацию протеолитических фракций проводили двумя

способами: насыщением ПААГ денатурированным гемоглобином (pH 7,2)

после дискового электрофореза и последующим выявлением

прогидролизованных участков; экстракцией белкового спектра из ПААГ

дистиллированной водой с определением протеолитической активности в

экстрактах.

При гидролизе гемоглобина в ПААГ обнаружены две протеолитические

фракции, которые проявились в виде двух светлых полос. Это

свидетельствовало о том, что комплекс ферментов, гидролизующий белки в

1

нейтральной области pH сложен и представлен двумя фракциями.

Аналогичными были данные при использовании метода экстракции белковых

полос из геля.

Таким образом, используя методы дискового электофореза было

установлено, что компонентный состав полученного препарата представлен

четырьмя фракциями, две из которых протеолитические. Кроме активного

протеолитического комплекса препарат „протовортманин Г10х” содержал в

своём составе глюкоамилазу (ГЛА 20ед/г) и альфаамилазу (3ед/г),

сопутствующие ферменты, а также баластные вещества. Для получения

гомогенных протеолитических фракций необходимо ввести более глубокую

очистку.

3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента.

Нами была поставлена цель определить рН и температурные оптимумы

действия выделенных протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и дать их

сравнительную характеристику.

Нужное значение рН субстрата поддерживали с помощью 0,1М

универсального буфера. Гидролиз вели при температуре 30оС в течение 30

минут. Ферментативную активность определяли стандартным методом [12].

Как видно на рис.2, препарат проявляет определённую активность в

широкой зоне рН. Однако максимум активности наблюдается при различных

значениях рН. Протеиназа 1 имеет оптимальное значение рН 7,2, в то время

как протеиназа 2 – 10,0. Таким образом, протеиназа 1 имеет нейтральную

природу, а протеиназа 2 – щелочную.

Температурный оптимум действия ферментов определяли в интервале

температур 30 – 80оС при оптимальных значениях рН 7,2 и 10,0. На рис.3

1

показано влияние температуры на активность ферментов. Для протеиназы 1

максимальный гидролиз наблюдается при температуре 60оС, а протеиназы 2 –

40оС.

Таким образом, протеолитический комплекс Penicillium wortmannii 2091

представлен двумя ферментами, имеющими различные температурные и рН –

оптимумы.

1

ПА, %

Рис. 2. Влияние рН на активность протеолитических фракций протеиназ Pen. wortmannii BKMF 2091: Ось абсцисс: величина рН; Ось ординат: ПА, выход по активности, %; 1 – протеиназа I; 2 – протеиназа II.

1 2

комментарии (0)
не были сделаны комментарии
Напиши ваш первый комментарий
это только предварительный показ
консультироваться и скачать документ
Docsity не оптимизирован для браузера, который вы используете. Войдите с помощью Google Chrome, Firefox, Internet Explorer 9+ или Safari! Скачать Google Chrome