KLINIČKO-TOKSIKOLOŠKE ANALIZE SKRIPTA - KONAČNO IZDANJE - 24.01.2024., Skripte od Toksikologija

Preuzmite KLINIČKO-TOKSIKOLOŠKE ANALIZE SKRIPTA - KONAČNO IZDANJE - 24.01.2024. i više Skripte u PDF od Toksikologija samo na Docsity! KLINIČKO-TOKSIKOLOŠKE ANALIZE KONAČNO IZDANJE Sandra Bogdanović Igor Vasić 2024. 1. Toksikovigilanca Toksikovigilanca je aktivni proces identifikacije i evaluacije toksikološkog rizika koji postoji u društvu i evaluacija mera koje treba preduzeti u cilju smanjenja identifikovanog rizika. Nosioci toksikovigilance su Centri za kontrolu trovanja (u okviru kojih su klinike i toksikološke laboratorije), gde se slivaju sve informacije u jednoj zemlji, vezano za trovanja. Toksikovigilanca se primarno odnosi na detekciju, validaciju i praćenje kliničkih toksičnih efekata koji se dovode u vezu sa različitim izloženostima hemikalijama. Analiza podataka centara za kontrolu trovanja obuhvata: • identifikaciju okolnosti ili agenasa za koje je zabeležen porast slučajeva trovanja (šta je to što se promenilo pa je broj slučajeva porastao, poznatom supstancom, ili novim supstancama), a kao posledica ovoga dalje se preduzimaju mere radi identifikacije i rešavanja nastalog problema • identifikaciju populacije sa povišenom incidencom trovanja, uz preduzimanje mera • Identifikaciju novih toksikoloških problema (reformulacija, promena u pakovanju, dostupnost nove PAS, kontaminacija životne sredine) i sprovođenje odgovarajućih mera Uočavamo da je toksikovigilanca kombinacija statističkog i medicinskog pristupa. Toksikovigilanca je internacionalni program o bezbednosti hemikalija (IPCS) i zajednički program tri tela UN: WHO, ILO, UNEP. IPCS program o prevenciji i upravljanju trovanja: izgradnja kapaciteta u svim zemljama, promocija uspostavljanja i jačanja centara za kontrolu trovanja. Uloga centara za kontrolu trovanja u procesu toksikovigilance je nezamenljiva (sistematski monitoring, komunikacija sa nadležnim institucijama koje preporučuju mere prevencije). Međutim, svega nekoliko zemalja u svetu ima jasno struktuiran sistem toksikovigilance. Toksikovigilanca vs. farmakovigilanca: ▪ Farmakovigilanca posmatra lekove i medicinska sredstva nakon dobijanja dozvole; toksikovigilanca posmatra sve supstance (lekove, hemikalije, sredstva koja se koriste u domaćinstvu, biljke, metale, PKS) bez obzira na postojanje dozvole. ▪ Farmakovigilanca posmatra neželjene efekte, dok toksikovigilanca posmatra toksične efekte! ▪ Toksikovigilanca se prvenstveno bavi trovanjima. Toksikovigilanca vs. procena rizika: ▪ Toksikovigilanca čini niz aktivnosti, u koje su uključeni kako medicinski profesionalci, tako i statističari koji primećuju poraste i promene. Toksikovigilanca pomaže u fazi identifikacije hazarda u toksikološkoj proceni rizika, odnosno u prvoj fazi procesa procene rizika, sakupljanjem podataka o slučajevima trovanja. ▪ Toksikovigilanca sakuplja validirane medicinske podatke (bazirane na toksikološkoj ekspertizi) upotrebom konsistentnih formata i pomaže stvaranju velikih baza podataka koje mogu značajno doprineti procesu identifikacije hazarda i celokupnom procesu procene rizika. ▪ Toksikovigilanca je koristan dodatak eksperimentalnoj toksikologiji i epidemiološkim studijama u kontekstu procene rizika. ▪ Procena rizika (identifikacija hazarda, doza-odgovor modelovanje, procena izloženosti, karakterizacija rizika) najčešće se zasniva na in vitro, in vivo i donekle podacima dobijenih iz studija na ljudima (epidemiološki podaci) Toksikovigilanca u Srbiji: Centar za kontrolu trovanja u Republici Srbiji je osnovan 1997. godine kao državna institucija sa zadatkom “da organizuje i sprovodi preventivne mere zaštite od trovanja, vrši informisanje o dejstvu otrova, pruža medicinsku pomoć u slučaju trovanja i otklanja posledice trovanja”. Dužnost Centra za kontrolu trovanja je da obavesti odgovarajuće zdravstvene i druge autoritete kako bi se preduzele neophodne preventivne i regulatorne mere. Pored lečenja akutnih trovanja i obezbeđivanja informacija vezanih za toksičnost hemijskih materija, kako za medicinsko osoblje tako i za građanstvo, stalni zadatak Centra za kontrolu trovanja je i oblast toksikovigilance i to identifikacija promene incidence trovanja, sezonske varijacija incidenca trovanja, procene efikasnosti i bezbednosti primene antidota, skladištenje i snabdevanje antidotima, kao i izveštavanje zdravstvenih i drugih relevantnih činilaca o potrebnim merama, kada se ukaže potreba za tim. VMA je centar zadužen za terapiju trovanja starijih od 14 godina. Za decu su zaduženi Tiršova i Institut za majku i dete. Primeri aktivnosti u svetu: - Nejasne informacije na pakovanju koje rezultuju u predoziranju – nakon obaveštavanja proizvođača, proizvođač je promenio oznaku na ampuli kako bi ukupan sadržaj N-acetilcisteina bio jasnije izražen. - Reformulacija spreja za kožnu obuću koja je dovela do oštećenja pluća korisnika, naređeno je povlačenje proizvoda sa tržišta i upozoreni su javno mnjenje, zemlje članice EU RAPEX-sistemom (Rapid Alert System for non-food consumer product) kao i evropski centri za kontrolu trovanja Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 1 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 5. Organizacija kliničko/sudsko-toksikološke laboratorije Organizacija laboratorije zasniva se na principima Dobre laboratorijske prakse, koja predstavlja koncept organizacije procesa rada u laboratoriji i uslove pod kojima se vrši planiranje, izvođenje, zapisivanje i prikazivanje rezultata. Ona treba da zadovoljava standard ISO 17025 I ISO 15189. Standard ISO 17025 uopšteno se odnosi na sve ispitne laboratorije i reguliše problematiku samo jednog dela rada, i to analitičke faze rada laboratorije. Standard ISO 15189 odnosi se na medicinska laboratorijska ispitivanja, pa samim tim opisuje sve što medicinska laboratorija specifično mora da ispuni u pogledu: osoblja, smeštaja i uslova okoline, laboratorijske opreme, preanalitičkog procesa rada, analitičke faze, osiguranja kvalititeta rada laboratorije, postanalitičke faze, izdavanja rezultata itd. Laboratoriju koja funkcioniše u saglasnosti sa DLP standardima čine rukovodilac, služba obezbeđenja kvaliteta, standardne operativne procedure (SOP), saradnici, oprema i kontrolni i test uzorci. Prednosti: Proces rada se bolje kontroliše i rezultati su kvalitetniji, služba interne kontrole kvaliteta obezbeđuje da se sve obavlja prema SOP-ovima, smanjena je potreba za ponavljanjem... Nedostaci: Uvođenje je skupo, značajno se povećava obim pisane dokumentacije, aktivnosti u laboratoriji postaju rutinske i stereotipne… Nivoi organizacije:  1. nivo – oblasni centar: za populaciju 20 000-100 000 stanovnika u radijusu 10-50 km;  2. nivo – regionalna laboratorija: za populaciju 1 000 000-2 000 000 stanovnika;  3. nivo – nacionalna laboratorija: za populaciju od oko 2 000 000 stanovnika (1-4 000 000) Organizacija kliničko-toksikološke službe u Srbiji:  stanice za hitnu pomoć i domovi zdravlja;  opšte bolnice i zdravstveni centri;  kliničko-bolnički centri;  nacionalni centar za kontrolu trovanja. 6. Program rada kliničko/sudsko-toksikološke laboratorije Formiranje liste otrova:  farmaceutski proizvodi;  pesticidi;  industrijske hemikalije. Lista sadrži:  naziv leka ili otrova;  tip analize (kvalitativna/kvantitativna), donja granica osetljivosti;  tip potrebnog uzorka (krv, urin, serum, lavat…);  količinu uzorka;  vreme obrade. Nivo Obim poslova Druge aktivnosti 1. Oblasni centar Identifikacija otrova in vitro (tablete, rastvarači), HbCO, MetHb, kvalitativna procena narkotika 2. Regionalna laboratorija 1. nivo + narkotici, drugi lekovi, alkohol u krvi, rastvarači Preporuke za 1. nivo; istraživanje 3. Nacionalna laboratorija Svi toksikološki testovi Preporuke za 1. i 2. nivo; istraživanje, edukacija Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 4 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Ljudi i oprema: Nivo Osoblje Oprema Kapacitet (slučajevi/godišnje) Analitičari Tehničari Otrovi Alkohol u krvi 1. Oblasni centar - 1 Fotometar (UV/VIS), TLC 50 - 2. Regionalna laboratorija 2-3 6 1. nivo + spektrofotometar (UV/VIS), GC, HPLC 200 2000 3. Nacionalna laboratorija 3-6 10-15 1. i 2. nivo + spektrofotometar (UV/VIS/IR), AAS, NMR, MS, imunoesej, ICP… 1000 5000 7. Dokumentacija u kliničko/sudsko-toksikološkoj laboratoriji  Toksikološki zahtev - formular (uputnica).  Informacije o pacijentu: ime, starost, pol, stanje svesti, istorija bolesti i dijagnoza, aktuelna terapija, znaci i simptomi, sumnja na lek ili otov, datum dobijanja uzoraka.  Informacije o lekaru: ime lekara, telefon ili lokal.  Zahtev za laboratoriju: traženi testovi.  Laboratorijski rezultati: šta je rađeno, u kom uzorku, rezultati, ime analitičara, datum. 8. Uzorci za kliničko-toksikološku analizu Pravilan izbor uzorka, pravilno obeležavanje uzorka i pravilno čuvanje i transport uzorka su preduslovi za dobijanje maksimalne količine informacija. Odabir uzorka se vrši prema prirodi supstance koju treba analizirati i prema kliničkom pitanju na koje treba dati odgovor. Serum Plazma (heparin ili EDTA): ne koristiti heparinizirane sudove za hipnotike i trankilizere; uzorke psihoaktivnih lekova (imipramin) zamrznuti. Puna krv (NaF/oksalat ili EDTA): Pb, CO, alkil nitrit, cijanidi, lako isparljivi otrovi. Važno je poznavati raspodelu supstanci eritrociti:plazma (serum)! CE= [CB – CP (1-H)]/H CE - koncentracija analita u eritrocitima CB - koncentracija analita u punoj krvi CP - koncentracija analita u plazmi H - hematokrit Primeri:  hlortalidon (diuretik) - conc. (eritrociti) 40 x > conc. (plazma): 1 % hemoliza  25 % povećanje conc. u plazmi;  plastifikator (tris-(2)-butoksi-etil-fosfat) - redistribucija supstanci u eritrocite;  fenitoin - bolje vezivanje za proteine plazme na nižoj temperaturi. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 5 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Urin: lekovi i metaboliti, lako isparljivi otrovi. Želudačni sadržaj: peroralno uneti lekovi. Saliva: kanabinoidi, lako isparljivi otrovi, alkohol, benzodiazepini...  mehanizmi transporta supstanci iz krvi u salivu: pasivna transcelularna difuzija, paracelularni transport (ultrafiltracija) i aktivni transport.  brzina difuzije leka iz krvi u salivu zavisi od: osobina leka, osobina salive, cirkulišućih nivoa leka u slobodnom obliku, doze i klirensa leka.  uticaj oralne kontaminacije: prisustvo samog leka u usnoj duplji nakon oralne ili intranazalne primene utiče na saliva/plazma odnos.  komercijalne test trake - DOA MultiGnost S6 je imunohromatografski test koji se zasniva na principu kompetitivnog vezivanja; droge prisutne u uzorku salive kompetiraju sa specifičnim konjugatom za vezna mesta na antitelu prisutnom u testu. Cerebrospinalna tečnost: lako isparljivi otrovi, lekovi... Kosa  kosu (skupina dlaka debljine olovke, oko 100-200 dlaka) treba vezati pri korenu pamučnim navojem, zatim odseći oko 2 mm od temena zadnjeg dela glave. Osigurati da su makaze u nivou kože glave, a ne pod uglom. Vezivanje navojem pomaže u očuvanju poravnanja potrebnog za segmentnu analizu. Uzorak treba ravno postaviti u aluminijsku foliju proksimalno i jasno identifikovati. Uzorci za kliničko-toksikološku analizu: Uzorak Količina Povraćeni sadržaj 200 g ili 200 ml Sadržaj 1. ispiranja želuca Urin Dijalizat 20 ml Krv za ispitivanje lekova, drugih organskih, neisparljivih i neorganskih otrova (metali) 20 ml HbCO 5 ml MetHb 1 ml + 4 ml vode Etanol 5 ml Lako isparljivi otrovi 8 ml Kosa - As min 1 g Nokti - As min 0,2 g 9. Uzorci za sudsko-toksikološku analizu Pravilan izbor uzorka, pravilno obeležavanje uzorka i pravilno čuvanje i transport uzorka su preduslovi za dobijanje maksimalne količine informacija. Odabir uzorka se vrši prema prirodi supstance koju treba analizirati i prema kliničkom pitanju na koje treba dati odgovor. Lekovi i drugi sumnjivi materijali nađeni pored tela:  bočice lekova - odlična početna tačka, ali i gubitak vremena ako su namerno ostavljeni da skrenu pažnju;  pakovanja sredstava za čišćenje, zaštitu bilja (obično je dovoljan podatak sa pakovanja);  špricevi - analiza zaostalog sadržaja;  hrana i piće nađeni na mestu događaja. Urin • jedan od najviše upotrebljavanih uzoraka, • mnoge pozitivne karakteristike, nema ometajućih endogenih jedinjenja, proteina, • ne mora uvek ekstrakcija, • mnogo dostupnih kolor testova, • koncentracija alkohola - GC (HS, MS, FID). Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 6 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Uticaj karakteristika otrova na izbor metode pripreme:  lako-isparljivi otrovi - bez pripreme;  isparljive organske i neorganske supstance - destilacija;  organske i neorganske supstance, posebno anjoni - dijaliza;  gasoviti otrovi - mikrodifuzija;  metali - mineralizacija;  neisparljive organske supstance - ekstrakcija - najčešći slučaj u toksikološkoj analizi. “Minimalni set” analitičkih podataka - baza podataka o otrovima/lekovima: • mogućnost ekstrakcije iz vodene faze; • mogućnost deproteinizacije; • tačka mržnjenja; • retencioni faktor (standardni sistemi); • retencioni indeks (standardni sistemi); • reakcije sa standardnim detekcionim reagensima; • UV maksimum (0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, metanol, etanol); • IR spektar... Bez pripreme Lako isparljivi otrovi - materijal za analizu: krv U najvećoj meri se eliminišu iz organizma u nepromenjenom obliku putem izdahnutog vazduha Primer: određivanje etanola u krvi - gasnom hromatografijom sa head space-om - uzorak krvi se stavlja u head space bočicu gasnog hromatografa; sledi odabir uslova za pripremu uzorka (pH uzorka, jonska jačina, temperatura zagrevanja) i uslova hromatografskog određivanje (GC – T, kolona…). Destilacija, dijaliza i mikrodifuzija  destilacija/frakciona destilacija (t.k. do 90 °C – metanol, etanol, dietil etar, etilestar sirćetne kis., benzen, alifatični ugljovodonici (do heksana), hlorovani ugljovodonici, alifatični amini, HCN...)  destilacija vodenom parom (t.k. iznad 90 °C)  dijaliza - separacija supstanci male molekulske mase od koloidno rastvorenih supstanci i makromolekula procesom difuzije kroz membranu nepermeabilnu za velike molekule (anjoni za jonoizmenjivačku hromatografiju)  mikrodifuzija (CO, HCN - Conway ćelija; etanol - Widmark tikvica) Mineralizacija - uz različita oksidaciona sredstva Suvi i vlažni postupci (izbor postupka zavisi od vrste materijala, analiziranog metala, analitičke metode). Suva mineralizacija na T do 500 °C, dovodi do neznatnog gubitka Pb, Zn, Co, Fe (III), Sr, Cr, Cu, Sb; gubitak veći od 10 %: Cd, Ag; kompletni gubitak: Hg, As. Suva mineralizacija na T do 800 °C: veliki gubitak: Hg, B, Pb, Zn, Cd, Ga, In, Tl, As, Sb, Fe, Cr, Cu. Vlažna mineralizacija: različite kombinacije oksidacionih sredstava uz zagrevanje (generalno razaraju sve biološke uzorke - HNO3, HNO3+H2O2, HClO4, H2SO4+HClO4 - moguća eksplozija!, H2SO4+HNO3+HClO4, HCl+KClO3 - neprikladna za metale u tragovima, osim kombinacije HNO3 i HClO4 koja ne razara lipide). Mikrotalasna digestija - zatvoren sistem, smanjena kontaminacija, manja količina upotrebljenih kiselina, nema gibitaka isparljivih metala, brza, jednostavna i ekonomična priprema, bezbedna upotreba. Ekstrakcija Najčešće korišćena metoda pripreme uzoraka za toksikološku analizu - koristi se za detekciju, identifikaciju i određivanje neisparljivih organskih supstanci. Postoji više metoda ekstrakcije, najčešće korišćene su tečno-tečna i tečno-čvrsta ekstrakcija. Dodatak internog standarda: jedinjenje slične strukture ekstrahuje se i određuje istovremeno sa ispitivanim jedinjenjem - služi za kontrolu analitičkog postupka, bolja preciznost; dodaje se u koncentraciji između terapijske i toksične. Vrlo često je potrebno izvesti i pretpripremnu fazu. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 9 Ekstrakcija je hemijski proces koji obuhvata premeštanje komponenti smeše iz jedne faze u drugu (najčešće tečnu fazu). Princip se zasniva na različitim rastvorljivostima komponentni smeše u određenim rastvaračima ili određenom rastvaraču Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Pretpripremna faza obuhvata: • razblaženje uzorka (fosfatni pufer), • segmentaciju (uzorak kose), • spoljašnju dekontaminaciju (pranje uzorka kose organskim rastvaračem npr. izopropanolom i dva puta vodom), • usitnjavanje/pulverizaciju, • filtriranje/centrifugiranje uzorka nakon seckanja/homogenizacije uzorka (post mortem uzorci) ili držanja uzorka u ultrasoničnom kupatilu, • hidrolitičku razgradnju, najčešće radi praćenja konjugata II faze metabolizma: (kod određivanja fenola dodatkom perhlorne kiseline, radi odvajanja od glukuronida) o dodavanje jakih baza, kiselina ili enzima pre ekstrakcije - oprez da ne bi došlo do razgradnje analita i nastanka sporednih produkata koji bi dalje ometali analizu; o 37% HCl tokom 15 minuta na 100 °C – za hitne analize i brzo dobijanje rezultata; o β-glukuronidaza iz E. Coli i arilsulfataze - iz urina + interni standard (16 h na 37 °C, ili najmanje 90 minuta na 50 °C), • precipitaciju proteina: (pre svega kod etanola) o veći sadržaj proteina utiče na stvaranje emulzija kod tečno-tečne ekstrakcije; o sredstva za deproteinizaciju - etanol:aceton (glikozidi), aceton (β-blokatori), vinska kiselina:aceton (barbiturati), aceton:n-heptan (organohlorni insekticidi), HCl, HClO4, trihlorsirćetna kiselina, volframova kiselina, Na-volframat, amonijum-sulfat, Cu(II)-sulfat, uranil-nitrat, AlCl3, acetonitril; o toplota; o enzimska deproteinizacija - pepsin, tripsin, enterokinaze, lipaze. Vrste ekstrakcija:  tečno-tečna ekstrakcija (ekstrakcija organskim rastvaračem koji se ne meša sa vodom);  tečno-čvrsta ekstrakcija (ekstrakcija organskim rastvaračem na čvrstom nosaču);  mikro ekstrakcija na čvrstoj fazi;  mikrotalasna ekstrakcija. Tečno-tečna ekstrakcija (LLE) • brza, jeftina i efikasna metoda pripreme materijala, posebno biološkog materijala sa niskim sadržajem proteina; zametnija od TČ ekstrakcije • izvodi se u širokom opsegu pH vrednost (pH 2-3 i pH 8-9); • strogo kontrolisana pH vrednost: kisela sredina - Na-dihidrogen fosfat, slabo-bazna sredina - Na-hidrogen karbonat; za morfin ne sme da pređe pH 9; • zasićenje neutralnim solima (NaCl); • određen odnos faza organska/vodena 1:2 onemogućava koekstrakciju širokog opsega interferencija. Tipovi tečno-tečne ekstrakcije:  direktna ekstrakcija/jednostepena: velika brzina, velika efikasnost regenereacije analita, mala specifičnost usled koekstrakcije, osetljiva analitička metoda, selektivan način merenja;  višestepena ekstrakcija: neselektivan način merenja. Faze:  mešanje sa organskim rastvaračem,  odvajanje organske faze,  koncentrisanje (uparavanje) ekstrakta,  rekonstituisanje suvog ostatka. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 10 Sloj koji se penje nakon dodatka vode je vodeni sloj Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Optimizacija postupka ekstrakcije:  izbor organskog rastvarača,  odnos vodena-organska faza (1:10; 1:5; 1:3),  preporučene smeše rastvarača: dietil-etar/etilacetat (1:1, v/v), dihlormetan/izopropanol/etilacetat (1:1:3; v/v/v),  način i trajanje mućkanja (5-60 min; optimalno 15-30 min). Nedostaci LLE:  vremenski zahtevna: o mućkanje i vreme za razdvajanje, o vreme potrebno za uparavanje ekstrakata,  zahtevna u smislu rada i materijala: o faktor vreme, o veliki utrošak rastvarača, cene rastvarača, toksičnost,  uticaj na rezultat: o stvaranje emulzije, o loše razdvajanje faza, o slabo reproduktivna ekstrakcija, o niske recovery vrednosti,  neophodno uparavanje ekstrakata. Tečno-čvrsta ekstrakcija (SPE) Princip - razdvajanje ili uklanjanje jednog ili više analita iz smeše komponenata selektivnim razdvajanjem komponenata između čvrste (adsorbens) i tečne faze (rastvarač). Analit se rastvara u rastvaraču koji ima malu eluacionu moć i zadržava se na čvrstom nosaču; eluiranje se vrši malom zapreminom rastvarača velike eluacione moći. Čvrsta faza može biti: nemodifikovan silika gel, hemijski modifikovan silika gel (normalne faze, reverzne faze i jonoizmenjivači), stiren-divinil benzenske smole modifikovane jonoizmenjivačkim grupama, Al2O3... SPE ekstrakcija - faze izvođenja: Uobičajena SPE procedura:  kondicioniranje (aktiviranje pakovanja)  propuštanje uzorka  zadržava se analit i pojedine nečistoće  ispiranje nečistoća  eluiranje toksične supstance  reverzno-fazna - izolovanje nepolarnih jedinjenja iz polarnog matriksa: o kondicioniranje (metanol + dejonizovana voda/pufer), o propuštanje uzorka (1-5 mL/min), o ispiranje (polarni rastvarač, ako se analit zadržava), o eluiranje (nepolarni rastvarač)  normalno-fazna i jonoizmenjivači. Prednosti SPE:  jednostavnost i brzina izvođenja; ekonomičnost (mala zapremina i uzorka i organskog rastvarača, ne zahteva primenu višekomponentnih pufera, skupih rastvarača i reagenasa),  efikasnost (nema stvaranja emulzije, visoka selektivnost, čistiji ekstrakti, veliki prinos ekstrakcije – recovery >95%),  omogućava koncentrisanje uzorka - eluiranje malom zapreminom rastvarača, nije neophodno uparavanje (termolabilne supstance, olakšana analiza (povećana osetljivost),  veći prinos (min. transfer uzorka) i čistoća analita,  osetljivost, specifičnost, selektivnost,  ne zahteva posebnu pretpripremu uzorka,  nema problema emulzije,  smanjen kontakt sa štetnim materijama (min. isparavanja),  lakše se uklanja otpad, mogućnost uključivanja u proces automatizacije. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 11 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 14. Priprema uzorka urina Priprema uzorka urina za tankoslojnu hromatografiju - generalno Uzorak se pipetira u dve epruvete, pri čemu se u jednu dodaje sumporna kiselina, a u drugu natrijum hidroksid. U obe epruvete dodaje se dihlormetan, muća 5 minuta i centrifugira 5-10 minuta. Vodeni sloj iz obe epruvete se odbacuje. Ukloniti zaostalu vodu filtriranjem kroz filter papir i u bazni ekstrakt dodati malo vinske kiseline, kako bi se izbegao gubitak isparljivih supstanci. Upariti ekstrakte u struji vazduha ili azota, a onda ih rastvoriti u 0,1 ml metanola. Priprema za TLC benzodiazepina:  uzorak - 20 ml urina, pH 9 uz boratni pufer;  ekstrakcija: 20 ml metilen hlorid:izopropanol (75:25);  ekstrakt rekonstituisan u 200 µl metanola;  100 µl se nanese na svaku od dve TLC ploče (silikagel G). 15. Priprema uzorka želudačnog sadržaja Priprema uzorka želudačnog sadržaja za tankoslojnu hromatografiju - generalno Uzorak se pipetira u dve epruvete, pri čemu se u jednu dodaje sumporna kiselina, a u drugu natrijum hidroksid. U obe epruvete dodaje se dihlormetan, muća 5 minuta i centrifugira 5-10 minuta. Vodeni sloj iz obe epruvete se odbacuje. Ukloniti zaostalu vodu filtriranjem kroz filter papir i u bazni ekstrakt dodati malo vinske kiseline, kako bi se izbegao gubitak isparljivih supstanci. Upariti ekstrakte u struji vazduha ili azota, a onda ih rastvoriti u 0,1 ml metanola. 16. Priprema uzoraka salive i kose Saliva: kanabinoidi, lako isparljivi otrovi, alkohol, benzodiazepini...  mehanizmi transporta supstanci iz krvi u salivu: pasivna transcelularna difuzija, paracelularni transport (ultrafiltracija) i aktivni transport.  brzina difuzije leka iz krvi u salivu zavisi od: osobina leka, osobina salive, cirkulišućih nivoa leka u slobodnom obliku, doze i klirensa leka.  uticaj oralne kontaminacije: prisustvo samog leka u usnoj duplji nakon oralne ili intranazalne primene utiče na saliva/plazma odnos. komercijalne test trake - DOA MultiGnost S6 je imunohromatografski test koji se zasniva na principu kompetitivnog vezivanja; droge prisutne u uzorku salive kompetiraju sa specifičnim konjugatom za vezna mesta na antitelu prisutnom u testu. Kosa  kosu (skupina dlaka debljine olovke, oko 100-200 dlaka) treba vezati pri korenu pamučnim navojem, zatim odseći oko 2 mm od temena zadnjeg dela glave. Osigurati da su makaze u nivou kože glave, a ne pod uglom. Vezivanje navojem pomaže u očuvanju poravnanja potrebnog za segmentnu analizu. Uzorak treba ravno postaviti u aluminijsku foliju proksimalno i jasno identifikovati. Uzorak kose treba oprati, jednom ili dva puta. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 14 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 17. Priprema uzorka lešnog materijala Prvi korak u analitičkom postupku podrazumeva izdvajanje supstance od interesa iz biološkog matriksa. Urin i druge neviskozne tečnosti uglavnom ne zahtevaju tretman pre ekstrakcije. Tečno-tečna i tečno- čvrsta ekstrakcija su pogodne procedure za ekstrakciju iz krvi i urina. Zgrušana krv može se homogenizovati u vodi ili puferu. Ekstrakcija supstanci iz čvrstih tkiva zahteva da se ono razori, kako bi se otrov oslobodio. Ovo se može postići homogenizacijom, kiselom ili baznom hidrolizom, ili enzimskom digestijom. Upotreba reagenasa za precipitaciju proteina, ako što su barijum-hlorid i cink-sulfat se ne preporučuje, jer mogu dovesti do koprecipitacije analita od interesa. 18. Skrining analiza Brzi i jednostavni postupci izolovanja i identifikacije otrova u slučajevima kada je nepoznat uzročnik trovanja.  kvalitativni nivo - direktni testovi, postupci izolovanja i identifikacije; nekada je to zadovoljavajući odgovor: kod hitnosti zbrinjavanja trovanog, u prvom koraku KTA; kao smernica za dalji tok KTA u smislu kvanitifikacije uzročnika trovanja; nepouzdanost (oprez) - s obzirom da su dokazne reakcije (razne skrining tehnike) manje ili više (ne)specifične;  kvantitativni nivo. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 15 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Pristupi sveobuhvatnom skriningu: Grupa A Grupa B Grupa C Grupa D Sastav grupe Alkoholi i isparljive materije - acetaldehid, etanol, metanol, aceton... CO Supstance koje se analiziraju TLC tehnikom - amfetamin, barbitol, kofein, kodein, efedrin, morfin, nikotin, varfarin... Supstance za koje su potrebne specifične metode - acetaminofen, benzodiazepini, kokain, fenotiazini, cijanid... Primarni postupak skrininga GC CO-oksimetar TLC Conway difuzija, EMIT, kolorimetrijski i spot testovi... Sekundarni testovi ili testovi za konfirmaciju GC, HPLC, GC-MS GC, HPLC, GC-MS 19. Primarni skrining Primarni postupak skrininga varira od grupe do grupe:  grupa A - alkoholi i isparljive materije - acetaldehid, etanol, metanol, aceton... - skrining metoda je GC;  grupa B - CO - skrining metoda je CO-oksimetar;  grupa C - Supstance koje se analiziraju TLC tehnikom - amfetamin, barbitol, kofein, kodein, efedrin, morfin, nikotin, varfarin... - skrining metoda je TLC;  grupa D - Supstance za koje su potrebne specifične metode - acetaminofen, benzodiazepini, kokain, fenotiazini, cijanid... - skrining metode su različite: Conway difuzija, EMIT, kolorimetrijski i spot testovi... 20. Direktni testovi u skrining analizi Urin  test glukoze, ketona, pH;  salicilati - Trinderov test - ljubičasto obojenje;  isparljive redukcione supstance – test bihromata - narandžasto u zeleno;  fenotiazini - FPN reagens: HNO3, HClO4, FeCl3 - ljubičasto, crveno, roze, plavo, zeleno ili narandžasto obojenje;  triciklični antidepresivi - Forestov reagens: H2SO4, HNO3, K2Cr2O7, HClO4 - žuto u zeleno ili plavo;  trihloro jedinjenja - Fujiwara test (piridin, onečišćen trihlorsirćetnom kiselinom često, slepa proba!) - crveno obojenje;  paracetamol - krezol-amonijačni test - plavo obojenje;  ethlorvinol - difenilamin test - crveno obojenje;  parakvat i dikvat - ditionit test - plavo i zeleno obojenje  organofosfati - Elmannov reagens - smanjenje intenziteta žute boje. Želudačni sadržaj  miris, boja i pH;  salicilati - Trinderov test;  oksidacioni reagensi - difenilamin test;  fero i feri joni - test fericijanida i ferocijanida - plavo obojenje;  fenotiazini - FPN reagens;  triciklični antidepresivi - Forestov test;  trihloro jedinjenja - Fujiwara test; Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 16 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019.  Metabolizam: o biotransformacija do aktivnih/nekativnih metabolita (dobro poznavanje distribucije novonastalih jedinjenja); o aktivnost metaboličkih enzima je jedan od ključnih biomarkera ekspozicije ksenobioticima (meri se nastanak produkta ili utrošak supstrata).  Ekskrecija: o urin, feces, saliva, znoj – međuodnos analita (raspodela izmedju ovih ekskreta - koeficijenti su definisani za neke agense od toksikološkog značaja); ovi koeficijenti su direktno determinisani vremenskim periodom od unosa otrova do uzorkovanja (različiti su koeficijenti kod akutnih i hroničnih trovanja); o alternativni uzorci (manje invazivno uzorkovanje). Priprema uzorka Hromatografija Atomska apsorpciona spektrometrija  kisela/bazna ekstrakcija analita iz uzorka etrom ili CHCl2;  uparavanje do suva, pod strujom vazduha ili N2 (kod nestabilnih, lako-oksidirajućih jedinjenja);  rekonstituisanje ostatka mobilnom fazom ili metanolom;  iniciranje.  mineralizacija uzoroka: mikrotalasna prećnica, temperatura, hemijska: jake kiseline...; od količine biomaterijala koji treba da se mineralizuje i termičke stabilnosti pojedinih metala zavisi koji postupak mineralizacije će se primeniti;  rastvaranje suvog ostatka u 1M HNO3 i merenje. 23. Kolor testovi u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi Delom preuzeto iz Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition i VV Pillay - Modern medical toxicology, 4th edition. Kolor testovi se sprovode kao skrining testovi - brzi i jednostavni postupci izolovanja i identifikacije otrova u slučajevima kada je nepoznat uzročnik trovanja. Kvalitativnog su nivoa - direktni testovi, postupci izolovanja i identifikacije; nekada je to zadovoljavajući odgovor: kod hitnosti zbrinjavanja trovanog, u prvom koraku KTA; kao smernica za dalji tok KTA u smislu kvanitifikacije uzročnika trovanja; nepouzdanost (oprez) - s obzirom da su dokazne reakcije (razne skrining tehnike) manje ili više (ne)specifične. Izvode se u urinu (i želudačnom sadržaju). Prihvaćeni sistem prepoznaje deset osnovnih boja - boje spektra: crvenu, naranžastu, žutu, zelenu, plavu i ljubičastu, kao i ružičastu, braon, sivu i crnu. Testovi se izvode u staklenim epruvetama ili belim pločicama, koje omogućavaju uniformnu pozadinu za viđenje boja. Dve važne preporuke su:  u isto vreme kada i uzorak, treba testirati i uzorak za koji se zna da ne sadrži supstancu od interesa; ovo omogućava poređenje dobijene boje sa 'blank' uzorkom (on treba da ima isti matriks kao i uzorak; ako to nije izvodljivo, koristi se voda);  pre konačne odluke o rezultat testa, boju uzorka treba uporediti sa bojom koju proizvodi supstanca od interesa, pod istim uslovima izvođenja. Primeri kolor testova:  Trinder test - za identifikaciju salicilata - salicilne kiseline, salicilamida i metilsalicilne kiseline; ljubičasto obojenje;  ferihlorid test - za fenole, fenotiazine, fenilbutazon, oksifenobutazon ili salicilate; ljubičasto obojenje;  FPN test - za detekciju fenotiazina (tricikli mogu dati plavu ili zelenu boju); ljubičasto, narandžasto, crveno, roze ili plavo obojenje;  o-krezol test (krezol-amonijačni) - za detekciju paracetamola i fenacetina; plavo obojenje;  dihromat test - za detekciju etanola; zeleno obojenje;  Marquis test - za detekciju opijuma i derivata; ljubičasta prelazi u plavu boju;  Lee-Jones test - za detekciju cijanida (zeleno-plava boja) i salicilata (ljubičasta boja); Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 19 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019.  Reinsch test - za detekciju žive (srebrno), arsena ili bizmuta (crno), ili antimona (ljubičasto- crno);  desferoksamin test - detekcija toksičnih koncentracija gvožđa - narandžasto ili crveno obojenje;  Fujiwara test - detekcija trihloro jedinjenja; crveno obojenje. 24. Spektrofotometrijeske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi Preuzeto iz VV Pillay - Modern medical toxicology, 4th edition i Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition. Spektrofotometrijske metode u UV i VIS delu spektra široko se koriste u farmaceutskoj i biohemijskoj analizi u svrhe kvantifikacije i, sa određenim ograničenjima, karakterizacije lekova, nečistoća, metabolita i srodnih supstanci. UV/VIS spektrofotometrija pronalazi upotrebu primarno u kvantitativnoj analizi. Obim apsorpcije može se značajno povećati korišćenjem bojenih reakcija, koje često povećavaju osetljivost i specifičnost. Takođe, one često omogućavaju pomeranje spektra supstance u VIS region (400-800 nm), pri čemu analit osobađaju interferencija prisutnih u UV oblasti (200-400 nm), u kojoj najveći broj lekova i otrova apsorbuje. Metode se zasnivaju na Lamber-Berovom zakonu (zavisnost intenziteta apsorbancije od koncentracije). Uzorci su najčešće tečnosti - rastvori, ali mogu se analizirati i gasovi i čvrste supstance. Pri analizi tečnosti koriste se kivete (kvarcne, jer imaju sposobnost apsorpscije u UV delu spektra). Prema principima Dobre laboratorijske prakse, sve hemikalije, reagensi i rastvori treba da su obeleženi nazivom i koncentracijom, kao i da sadrže informacije o proizvođaču, datumu proizvodnje i stabilnosti. Najčešći način kvantifikacije analita od interesa je metoda kalibracione krive, koja podrazumeva pripremu višestrukih razblaženja standarda poznate koncentracije, merenje njihove apsorbancije i konstruisanje kalibracione krive (jednačina mora imati r>0,99), nakon čega se meri apsorbancija uzorka, i sa krive očitava, ili iz jednačine izračunava (češće) koncentracija analita od interesa. Glavni nedostatak ove vrste detekcije jesu interferencije prisutne u trovanjima većim brojem supstanci. 25. Imunohemijske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi Preuzeto iz VV Pillay - Modern medical toxicology, 4th edition i Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition. U toksikologiji se rutinski koriste mnogi heterogeni eseji. Ove tehnike uključuju ELISA, RIA, CIA (hemiluminiscentni imunoesej), FIA (fluorescentni imunoesej)... RIA - Radio immunoassay Ovo je spora i skupa metoda detekcije otrova u krvi, ali je izuzetno tačna. Uključuje mešanje poznate količine specifičnog antitela sa poznatom količinom radioaktivno obeleženog otrova i dodavanje uzorka. Usled kompeticije, javlja se smanjenje radioaktivnosti proporcionalno količini ispitivane supstance (obrnuta korelacija). Ovaj test je odličan za supstance koje se u krvi nalaze u jako niskim koncentracijama - kanabinoidi, digoksin, LSD, parakvat... Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 20 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. ELISA Generalni princip heterogenih imunoeseja EMIT - Enzyme mediated immunoassay technique Ovo je brza i skupa metoda, sa dobrom tačnošću, zasnovana na principu da je količina prisutnog otrova srazmerna nivou inhibicije reakcije supstrat-enzim. Poznata količina otrova obeležena je enzimom i dodata u medijum koji sadrži supstrat. Specifična antitela se dodaju i inhibiraju enzimsku reakciju. Slobodan otrov iz uzorka takmiči se sa enzimski-obeleženim za antitela, smanjujući na taj način inhibiciju. Enzimska aktivnost korelira sa koncentracijom otrova u uzorku i meri se kao apsorbancija proizvoda nastalog reakcijom enzima i supstrata. EMIT je metoda izbora u odnosu na RIA u hitnim situacijama zbog brzine i jednostavnosti izvođenja (1 uzorak/min). EMIT 26. Hromatografske metode u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi Hromatografske tehnike u toksikologiji se koriste i kao skrining (TLC, GC) i kao metode za postavljanje dijagnoze (analiza na osnovu koje se tačno utvrđuje uzročnik trovanja među nekoliko alternativnih dijagnoza - HPTLC, HPLC-UV, GC-FID, GC-ECD, GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC-MS/MS). Radi postizanja odgovarajućih performansi, biraju se adekvatni uzorci, uslovi razdvajanja, detektori... Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 21 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 29. Tumačenje rezultata u kliničko/sudsko-toksikološkoj analizi Preuzeto iz VV Pillay - Modern medical toxicology, 4th edition i Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition. Koraci u dobijanju i interpretaciji rezultata podrazumevaju:  inicijalno dobijene informacije - informacije sa mesta zločina/nesreće su vitalne i njih toksikolog najčešće dobija od policije ili medicinskih radnika koji su bili prisutni; takođe, on treba da bude informisan o svim okolnostima događaja, kako bi laboratorija imala preliminarne informacije o potrebnim testovima; ukoliko se sumnja na neke supstance, to treba iskazati, kao i doneti eventualno pronađene lekove (posebno ako te supstance nisu obuhvaćene rutinskim skriningom - mogu promaći); informacije od značaja su i ime, datum rođenja, tip uzorka, a kod post mortem uzoraka i način skladištenja;  toksikološke analize - često ih bira klijent (policija, forenzičar...) i neretko su određene budžetom; preporučuje se skrining na sve dostupne supstance; ukoliko ovo nije moguće, preporučuje se skrining na alkohol, amfetamine, kokain, opijate, kanabinoide i benzodiazepine, kao i na OTC lekove - antidepresive i antipsihotike;  finalni izveštaj treba da: o sadrži objašenjnje načina na koji su testovi izvedeni, o ukaže na supstance koje se racionalno mogu isključiti kao uzročnici trovanja, o pokaže koje su supstance detektovane u uzorku, o ukoliko su izvršene, sadrži rezultate ispitivanja tableta, praha i sl. Krajnji korisnik treba da razume koji su testovi izvedeni kao i limitacije metoda (ako su relevantne). I u kliničkim i sudskim okolnostima, veliki broj faktora utiče na koncentraciju supstance u uzorku. To, zauzvrat uteiče na krajnju interpretaciju rezultata. Najznačajniji faktori i pitanja koja utiču na interpretaciju su:  Može li supstanca ispoljiti značajne štetne ili toksične efekte i kojim mehanizmom? o nisu sve supstance pronađene tokom analize toksične, ili njihovo prisustvo nije relevantno za slučaj;  Koji je najverovatniji put ekspozicije? o prisustvo supstance u GIT-u ukazuje na oralnu administraciju, ubodi igle na i.v, visoke koncentracije u mišićnom tkivu na i.m...  Jesu li rezultati dobijeni post mortem analizom? o problematična interpretacija rezultata alkoholemije (bakterije produkuju alkohol), benzodiazepini, kao i supstance sa sumporom (tioridazin) ili estarskom grupom (diamorfin, kokain) u molekulu su nestabilne u post mortem uzorcima...  Da li se smrt dogodila kratko po ekspoziciji ili nakon određenog vremenskog perioda? o koncentracije nekih supstanci drastično se smanjuju tokom vremena;  Da li je supstanca uneta jednokratno, ili je u pitanju ponovljena izloženost? o mnoge supstance se akumuliraju pri ponovljenom unosu, do postizanja steady state-a; koncnetracije pri ponovljenom doziranju su samim tim više, i mogu navesti na razmišljanje da je uzeta jedna velika doza supstance;  Koliko osoba ima godina i ima li značajne bolesti srca, bubrega ili jetre? o godine su značajne zbog metabolizma i volumena distribucije, a hronične bolesti sa eliminacijom, pre svega;  Ima li osoba značajne povrede? o ako je upucana, to će biti uzrok smrti, iako možda ima i koncentracije supstance koje bi dovele do smrti;  Postoji li mogućnost genetskog poremećaja metabolizma supstance? o polimorfizam enzima, posebno CYP450 familije je značajan za metabolizam;  Postoji li mogućnost da se razvila tolerancija? o fenomen adaptacije na efekte supstance - viša doza potrebna za postizanje istog efekta - predoziranje;  Ukoliko su druge supstance prisutne, kakva je interakcija i ima li je uopšte? o sinergistički efekat (npr. alkohol i sedativi). Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 24 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 30. Najznačajniji otrovi sa aspekta kliničke toksikologije Specifična disciplina u toksikologiji koja se bavi izučavanjem toksičnih efekata agenasa koji se koriste u terapiji ali i hemijskih agenasa koji nemaju takvu primenu:  agensi u životnoj sredini,  alkohol i PAS,  hemijski agensi u industrijskoj upotrebi (gasovi, ugljovodonici itd)  esencijalne komponente urbane, poljoprivredne ili druge tehnologije (pesticidi, sredstva u domaćinstvu itd.) Klinički toksikolozi se bave identifikacijom, prevencijom, dijagnozom i lečenjem stanja, patologije ili oboljenja koja su posledica zadesne, namerne ekspozicije ili ekspozicije u životnoj sredini. Toksindrom: skup simptoma i znakova koji se javljaju u vezi sa izlaganjem određenom leku ili toksičnom agensu. Najčešći:  antiholinergički - antiholinergici (atropin), antihistaminici (benadryl), antipsihotici/neuroleptici (haldol), antidepresivi (TCA, amitriptilin), neke biljke (Datura stramonium, Hyosciamus niger, gyromitre);  holinergički - OFI, karbamati, neke gljive, nervni otrovi;  opijatni - opijati, barbiturati, benzodiazepini, etanol;  sedativno/hipnotički - antikonvulzivi, barbiturati, benzodiazepini, etanol;  simpatomimetski - kokain, MDMA, amfetamini, fenciklidin, teofilin, kofein;  serotoninski - antidepresivi (SSRI, MAOI), meperidin, dekstromorfan, ekstazi;  halucinogeni - LSD, neke gljive, kokain, fenciklidin. 31. Najznačajniji otrovi sa aspekta sudske toksikologije Najuži krug poznatih, uobičajenih, najčešće zastupljenih otrova:  gasovi,  lako isparljiva jedinjenja,  lekovi i droge,  metali,  pesticidi,  anjoni,  mešano. Najprikladnija podela u sudskoj toksikologiji, zasnovana na analitičkim potrebama, je prema metodi izolovanja, izdvajanja, otrova iz materijala:  gasovite i lako isparljive supstance koje se izoluju difuzijom ili destilacijom, o ugljen-monoksid: često uzročnik trovanja sa letalnim ishodom; dokazivanje u krvi u svim slučajevima trovanja u požarima, kolima, prikolicama itd; u određena doba godine (npr. na jesen začepljeni dimnjaci nakon perioda kada nije bilo grejanja); o cijanidi: požari ili unos kalijum ili natrijum-cijanida; i pored karakterističnog mirisa neke osobe ga ne zapažaju - zato kolor testovi; Conway posudice - mikrodifuzija;  organske, neisparljive supstance koje se izoluju ekstrakcijom sa organskim rastvaračima (lekovi i pesticidi), o najviše ispitivana grupa jedinjenja u sudskoj toksikologiji (sa izuzetkom alkohola); prisustvo u mnogim slučajevima, a da nema značaja za događaj; skrining analiza - veoma rasprostranjena; izolovanje otrova iz materijala - ekstrakcija- jedan od najvažnijih momenata u analizi; analiza tkiva: izolovanje otrova - metode tipa Stass-Otto… ili enzimska digestija;  metalni otrovi koji se izoluju mineralizacijom (suvim ili vlažnim postupkom) ili enzimskom degradacijom tkiva tj. organskog materijala, o u prošlosti veoma često, danas ređe, razlike među regionima; postoje grupni reagensi, ali ne obuhvataju sve metale; nisu osetljivi, ali ni metali ne spadaju u jake otrove te su kod Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 25 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. trovanja prisutni u visokim koncentracijama; danas ima dobrih analitičkih mogućnosti, ali su ti aparati retko u osnovnoj postavi sudsko-toksikološke laboratorije;  toksični anjoni koji se izoluju dijalizom, o ne postoji grupna analiza već se analiziraju pojedini anjoni; najčešće ne spadaju u jake otrove (osim hlorata i fluorida), ali se sreću u „zlonamernim trovanjima“ - analiza hrane, pića, želudačnog sadržaja, urin; različiti otrovi koji iziskuju specijalne tehnike ekstrakcije. Pesticidi ne spadaju u ovu podelu; analitičke metode odlično razvijene zbog stavljanja pesticida na tržište i kontrole rezidua u hrani i vodi; metode za pesticide u biološkom materijalu nisu tako dobro razvijene. Zločinačka trovanja ograničena su neprijatnim mirisom i ukusom, a koriste se jedinjenja arsena i talijuma, fosfora, strihnin (rodenticidi), nikotin (insekticidi), jedinjenja žive (fungicidi). Samoubilačka trovanja su češća. Bojene reakcije, TLC, GC-MS - analitika. 32. Najznačajniji uzročnici hemijskih udesa Hemijski udes ili hemijski akcident je iznenadni i nekontrolisani događaj koji nastaje oslobađanjem, izlivanjem ili rasipanjem opasnih materija, obavljanjem aktivnosti pri proizvodnji, upotrebi, preradi, skladištenju, odlaganju ili dugotrajnom neadekvatnom čuvanju – Zakon o zaštiti životne sredine. Najčešći uzročnici hemijskih udesa su: CO i CN (požari), hlor, amonijak, hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, benzen, dioksini. Amonijak 1986. - Šabac, 2013. Novi Beograd, 2014. Novi Sad, 2017. - Pančevo... Tečnost - vodeni rastvor gasa amonijaka (10-33%). Široko se upotrebljava u proizvodnji veštačkog đubriva, kao rastvarač, za odmašćivanje... Ima karakterističan jak miris - otkriva se prisustvo u vazduhu u niskim koncentracijama. Najčešći akcidenti – izlivanje u fabričkim postrojenjima ili prilikom transporta (saobraćajna nezgoda). Inhalacioni unos - nadražajni i korozivni efekat - koža, oči, respiratorni trakt. Snižava pH zemljišta i vode - štetan uticaj na organizme u životnoj sredini. Opasnost je posledica zapaljivosti, korozivnog efekta, akutne toksičnosti i dejstva na životnu sredinu. Ugljen monoksid i cijanidi - uzročnici trovanja ljudi u požaru Nekontrolisano širenje vatre u prostoru koje izaziva velike materijalne štete, zagađenje životne sredine i veliki broj ljudskih žrtava. Uzroci: visoke temperature, neispravne instalacije, kvarovi, ljudski faktor,... Pet klasa požara: A, B, C, D i E. Mere protiv požara (detektori dima i povišenih koncentracija toksičnih gasova; obeležavanje zapaljivih materija; adekvatna protivpožarna oprema; edukacija). Dugotrajne posledice požara (hronična ekspozicija) podrazumevaju oslobađanje brojnih supstanci u životnu sredinu koje imaju toksične efekte po čoveka i živi svet (npr. usporivači gorenja “flame retardant” - polobromovani difeniletri). Lista osam faktora koji mogu izazvati smrt u požaru: • direktno gorenje u vatri, • veoma visoke T (opekotine), • smanjenjena koncentracija O2, • prisustvo CO, • prisustvo drugih toksičnih gasova, • prisustvo dima, • šok i panika, • sekundarni efekat usled mehaničkih posledica (trauma, frakture,...). Vrste trovanja u požaru su slučajna, profesionalna i samoubilačka i zločinačka. Glavni uzročnici trovanja u požaru su: • gorenje materijala: o prirodni - drvo, celuloza, pamuk, svila, vuna; o veštački (sintetski polimeri) - guma, plastika (topi se), poliuretan, najlon. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 26 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Vrste materijala za procenu alkoholisanosti • izdahnuti vazduh - saobraćajna policija u trijaži - odnos sadržaja etanola u alveolarnom vazduhu i krvi je definisan - alko test; • klinička praksa - krv (venska), urin (svež), želudačni sadržaj; • sudska praksa - krv femoralne vene, urin mokraćne bešike, želudačni sadržaj, tkiva i organi, tečnost staklastog tela... Metode Gasna hromatografija (head space) - metoda izbora, i hemijske metode - oksido-redukcione (npr. K2Cr2O7). Alkoholemija - koncentracija etanola u krvi. Osobine molekula - mala molekulska težina, rastvara se u vodi i nepolarnim rastvaračima. Količina resorbovanog alkohola determiniše nivo alkohola u krvi, a time i količinu etanola koja dospeva u mozak i stepen postignute intoksikacije. Kriva alkoholemije - grafički prikaz koncentracije alkohola u krvi u zavisnosti od vremena. Napomena: brzina eliminacije etanola je 0,15 – 0,20‰/h (prosečna vrednost 0,18‰/h) Kriva alkoholemije Primena u praksi Izračunavanje koncentracije alkohola u trenutku nesreće. Brzina eliminacije etanola je konstantna i ne zavisi od sadržaja etanola u krvi – iznosi 0,15 do 0,20 ‰ na sat (srednja vrednost 0,18 ‰) - faktor β (Widmarkov faktor). Samo pri veoma niskim dozama etanol se eliminiše kinetikom prvog reda. Faktor β može biti znatno viši u prvim satima pri jako visokim alkoholemijama, kao i kod alkoholičara (0,3 ‰ /h-0,4 ‰/h). Interpretacija postmortem rezultata Pri izračunavanju alkoholemije u postmortalnoj krvi uzima se u obzir:  stanje tela pri autopsiji,  vreme između smrti i autopsije,  uslovi okruženja (temperatura i vlaga),  vrsta uzorka. Faktori koji utiču na koncentraciju alkohola u post mortem materijalu Endogeni etanol - dijabetičari 10 puta veća vrednost; Japan Candida albicans – „auto-brewery syndrome” – sindrom sopstvene pivare; sinteza postmortalnog etanola - mikroorganizmi Candida albicans; postmortalna degradacija ALDH enzima; primena manitola; čuvanje leša na niskoj temperaturi - odsustvo postmortalne sinteze alkohola. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 29 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Dobijanje lažno većih koncentracija etanola u krvi Post mortem sinteza alkohola zbog mikrobiološke aktivnosti i fermentacije glukoze (leš u stanju raspadanja); postmortalna difuzija akohola iz želuca (osoba umrla odmah nakon teškog opijanja); kontaminacija bioloških uzoraka etanolom ili drugim alkoholom u toku spasavanja života... Iz ovih razloga radi se analiza alternativnih uzoraka - tečnost staklastog tela. Veštačenje alkoholisanosti Od sudskog veštaka se zahteva da pruži odgovor kolika je bila alkoholemija u momentu kritičnog događaja, čak iako nije blagovremeno uzet ili nije uopšte uzet uzorak krvi. Procena alkoholemije posle konzumiranja određene količine alkoholnog pića: A=(V x Q x J)/100 A - masa unetog čistog alkohola, V - zapremina popijenog alkoholnog pića (mL), Q - specifična težina etanola 0,789~0,8 (1 mL etanola ima masu 0,8 g) J - jačina alkoholnog pića izražena u zapreminskim procentima (vol%). C=A/p x r C - alkoholemija u promilima, A - količina resorbovanog alkohola u gramima, p - telesna težina, r - redukcioni faktor (♂-0,7, ♀-0,6) Csn=Ct+β x t Csn - alkoholemija u vreme kritičnog događaja u promilima, Ct - alkoholemija u vreme uzimanja uzorka za analizu u promilima, β - Widmarkov faktor t - vreme proteklo od momenta događaja do uzimanja uzorka (u satima). 1. april - Svetski dan borbe protiv alkoholizma. 35. Toksikološki značaj i analiza barbiturata Prvi barbiturat je sintetisan 1903. god. od barbiturne kiseline. Uvedeni su kao hipnotici i zamenili su opijate, bromide, hloral hidrat, alkohol... Od uvođenja benzodiazepina (krajem '70-ih) retko se koriste kao sedativi. Toksikološki značaj Vrste trovanja: • samoubilačka (polimedikamentozna trovanja), • medicinska trovanja (ponovno posezanje za lekom, doziranje), • slučajna. Upotreba: sedacija, hipnoza, anestezija; antikonvulzivi, akutni konvulzivni napadi; glavobolje. Tržište Srbije: fenobarbiton (tablete 100 mg, ampule 220 mg) Zloupotreba: courage pills; downers; F-40s; goof balls (sa amfetaminima); gorilla pills; mexican yellows; pink ladies; lutkice... Podela barbiturata • ultrakratkodelujući – do 1 h (tiobarbiturati), • kratkodelujući – do 6 h (pentobarbiton, sekobarbiton), • srednjedelujući – do 10 h (amobarbiton, butabarbiton, butalbital), • dugodelujući – do 24 h (barbiton i fenobarbiton). Toksikološke karakteristike barbiturata • dugodelujući - manje toksični: manje lipofilni, sporije se distribuiraju, manje se vezuju za proteine (fenobarbiton 20%) i brže se ekskretuju preko bubrega (u nepromenjenom obliku: fenobarbiton 20-30%, barbiton i do 100%); t1/2>40 h. • kratkodelujući - toksičniji: više lipofilni, više se vezuju za proteine (sekobarbiton 40%), imaju veći pKa i efekat se ispoljava brzo i kratko traje. t1/2<40 h. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 30 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Metabolizam barbiturata Metabolišu se uglavnom u jetri do neaktivnih metabolita, koji se u obliku glukuronida ekskretuju putem urina. Indukuju hepatičnu citohrom P-450, multifunkcionalnu oksidazu mikrozomalnog enzimskog oksidirajućeg sistema. Eliminacija barbiturata Spontana eliminacija - barbiturati i metaboliti su slabe kiseline - smanjena jonizacija i pojačana tubularna reapsorpcija - smanjena renalna eliminacija. Forsirana eliminacija primenom bikarbonata - pojačana jonizacija, smanjena tubularna reapsorpcija - pojačana renalna eliminacija. Mehanizam dejstva (i toksičnosti) Vezuju se za specifična mesta na jonskim kanalima GABAA, drže ih otvorenim, čime omogućavaju ulazak Cl- i posledičnu hiperpolarizaciju membrane postsinaptičkih neurona. Blokiraju glutamatne receptore u CNS (ekscitatorni neurotransmiter) i inhibiraju glutamat-indukovanu depolarizaciju (potenciraju i produžuju delovanje GABA). Toksični efekti: progresivna depresija CNS (posledica depresije polisinaptičkih sinapsi), efekat na pluća, efekat na kardiovaskularni sistem. Odnos doze i efekta - u niskim dozama deluju sedativno, u nešto višim hipnotički, a nakon toga anestetički ili izazivaju smrt; toksična doza iznosi 3-5 terapijskih, a letalna varira u zavisnosti od dužine delovanja - za kratkodelujuće je 2-3 g, a za dugodelujuće 6-10 g. Klinička slika trovanja Prvo se javljaju neurološki simptomi: ataksija, poremećaj govora (dizartrija), nistagmus i konfuznost, a zatim poremećaj svesti (od somnolencije do duboke kome). Zenice su u početku sužene, a sa produbljivanjem kome one se šire. Depresija centra za disanje se manifestuje sporim i površnim disanjem koje se završava apnejom. Posledice centralne depresije na kardiovaskularni sistem su slab i ubrzan puls, hipotenzija, cijanoza i na kraju šok. Prisutne su hipotermija, acidoza, rabdomioliza; na koži se javljaju bule i posledica su epidermolize. Javlja se oligurija do anurije; depresija disanja je najteža posledica → uzrok brze smrti. Pneumonija, cirkulatorni kolaps, zastoj bubrežne funkcije, edem mozga i pluća → uzroci odloženog letalnog ishoda. Tretman trovanja Nema specifičnog antidota; terapija je suportivna - gastrična lavaža, aktivni ugalj, velike količine tečnosti, vazopresorni agensi - noradrenalin i dopamin, antibiotici, forsirana alkalna diureza - za kratkodelujuće, hemodijaliza. Analitika Određivanje barbiturata u krvi: • praćenje efikasnosti hronične terapije, (antikonvulzivi, antiepileptici), • potvrda trovanja barbituratima, • odluka o forsiranoj diurezi, • kontrola efikasnosti terapije trovanja. Nivo barbiturata u krvi nije pouzdan za procenu težine i ishoda trovanja (razvijena tolerancija). Materijal: krv, želudačni sadržaj, urin, organi. Kvalitativna analiza: • komercijalne test trake (urin), • kolor testovi - Dille-Koppanyi test - plavo ljubičasta boja; Hg(NO3)2 test - siva boja, • TLC - dietiletar, 10 % vinska kiselina (pH 4); reagens za identifikaciju: 1% Hg-nitrat, • EMIT (osetljivost 0,5 mg/L). Kvantitativna analiza:  GC-FID, GC-MS,  HPLC-UV, LC-MS. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 31 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 38. Toksikološki značaj i analiza fenotiazina 1950. sintetisan hlorpromazin; 1954. primenjen kod psihijatrijskih bolesnika. Upotreba • antipsihotici, neuroleptici. Toksikološki značaj • samoubilačka, medicinska, slučajna, • pratioci svih vrsta suicida, • veza sa iznenadnom smrću • deca! Hemijska struktura i podela • sa alifatičnim aminom u bočnom nizu (hlorpromazin, levomepromazin) • sa piperazinom u bočnom nizu (flufenazin, trifluperazin) • sa piperidinom u bočnom nizu (tioridazin) Farmakokinetika • maksimalna koncentracija u plazmi nakon 2-3 h, Vd 20 L/kg, vezivanje za proteine >90 %, akumulacija - masno tkivo, mozak (10x veće koncentracije). Mehanizam dejstva • blokada svih dopaminskih receptora u mozgu. • periferne aktivnosti: o blokada alfa-adrenergičkih receptora, o antiholinergički i antihistaminski efekti. Efekat na CNS: centralna sedacija i antiholinergički efekti → depresija CNS. Alfa-adrenergička blokada - mioza (prevladava nad antiholinergičkim efektom); ekstrapiramidalni sindrom već pri terapeutskim koncentracijama, izazvan centralnom blokadom dopaminskih receptora. Snižavanje praga za konvulzije je nepoznatog porekla. Efekat na KVS: antiholinergički efekti - tahikardija; alfa-adrenegrička blokada - ortostatska hipotenzija; visoke doze fenotiazina - hinidinu sličan efekat na miokard. Metabolizam: N-oksidacija, aromatična hidroksilacija, N-demetilovanje, sulfoksidacija; konjugacija. Terapija trovanja  lavaža želuca, aktivni ugalj,  korekcija acidobaznog statusa i elektrolita,  korekcija hipotenzije: noradrenalin - deluje samo na alfa-adrenergičke receptore (dopamin - ne, jer deluje i na alfa- i na beta-adrenergičke receptore),  korekcija aritmije: lidokain ili fenitoin,  tretman antiholinergičkog efekta – fizostigmin,  privremeni pejsmejker. Analitika  kvalitativna analiza: o bojene reakcije - FPN, o test trake (imunoesej tehnike), o TLC - reagensi - PdCl2; sumporna kiselina:voda:etanol;  kvantitativna analiza: o ekstrakcija - hloroform:n-heksan (pH 11, fosfatni, karbonatni pufer), o GC (MS, FID), o HPLC (UV, MS). Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. Uzorak: krv, lavat, urin, organ prethodne probe 34 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 39. Toksikološki značaj i analiza tricikličnih antidepresiva Podela antidepresiva  TCA: amitriptilin, imipramin, doksepin, klomipramin, dosulepin;  Neselektivni antidepresivi: maprotilin, mianserin, amoksapin, viloksazin, trazodon, mirtazapin, nefazodon, venlafaksin;  SSRIs-selektivni inhibitori preuzimanja serotonina: fluoksetin, fluvoksamin, paroksetin, citalopram, sertralin;  inhibitori MAO: moklobemid, fenelzin, izokarboksazid. Farmakokinetika  brza resorpcija iz GIT-a,  vezivanje za proteine plazme i preko 95%  enterohepatična cirkulacija osnovnog jedinjenja i metabolita. Metabolizam  tri najznačajnija puta: N-oksidacija, hidroksilacija alicikličnog i aromatičnog prstena (C2 i C10), N- dealkilacija dialkilamino grupe - najznačajniji metaboliti (N-demetilovani metaboliti su farmakološki aktivni) Eliminacija: konjugovani hidroksi metaboliti dominiraju u urinu. Mehanizam dejstva:  inhibira preuzimanje serotonina i noradrenalina,  antiholinergičko (neželjeno dejstvo) i hinidinu slično dejstvo. Mehanizmi toksičnosti:  centralni i periferni antiholinergički efekat;  razlike među predstavnicima u mehanizmu i intenzitetu (amitriptilin - najjači efekat; imipramin dodatno povećava nivo dopamina… ). Toksični efekti  neurotoksični efekat: o CNS: konfuznost, agitiranost i halucinacije, konvulzije, poremećaj svesti, koma; o periferni antiholinergički efekat: crvenilo lica, suvoća usta, midrijaza, tahikardija…  kardiotoksični efekat (deca) o antiholinergički efekat - sinusna tahikardija, o simpatomimetički efekat - tahikardija, hipertenzija, o hinidinu sličan efekat - smanjenje kontraktilnosti, frekvencije, koronarnog protoka, v. ekstrasistole, v. tahikardija i fibrilacija. Tahiaritmija - najčešća manifestacija → do prestanka rada srca. Teška akutna trovanja - koncentracije veće od 1 mg/L, čest letalan ishod (izrazit efekat na KVS). Posebna pažnja kod dece, srčanih bolesnika i osoba na dugogodišnjoj terapiji antipsihoticima. Terapija trovanja:  lavaža, laksativi;  aktivni ugalj (više puta) - zbog enterohepatične cirkulacije TCA i aktivnih metabolita;  korekcija acidobaznog statusa (bikarbonat) i elektrolita (značajno zbog srčanih aritmija);  fizostigmin, diazepam, antiaritmici;  hemoperfuzija. Analitika  kvalitativna analiza: o TLC - Dragendorff-ov reagens ili jodoplatinat;  kvantitativna analiza: o GC (FID, MS), o HPLC (UV). Određivanje i aktivnih metabolita! Postmortem redistribucija visokoliposolubilnih supstanci (krv iz femoralne vene). Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 35 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. 40. Toksikološki značaj i analiza β-blokatora i kardiotoničnih glikozida Kardiotonični glikozidi Izvor: Digitalis lanata. Sastav: tri šećera i aglikonski digoksigenin. Terapijske indikacije:  kongestivna srčana insuficijencija (ima pozitivn inotropni i negativni hronotropni efekat),  supraventrikularna aritmija (u lečenju hronične atrijalne fibrilacije). Mehanizam dejstva  inhibira Na+-K+ ATP-aznu membransku pumpu - povećanje intracelularnog Na; zauzvrat, Na+-Ca2+ - izmenjivač pokušava da izbaci Na iz ćelije, na račun upumpavanja Ca; povećan intracelularni Ca aktivira kontraktilne proteine (aktin, miozin),  deluje na električnu aktivnost srca (povećava nagib 4. faze depolarizacije, skraćuje trajanje akcionog potencijala) i smanjuje maksimalni dijastolni potencijal. Farmakokinetika digoksina  apsorpcija: GIT (60-100 % zavisno od formulacije); t1/2 - 3,5-5 dana (digoksin), a za digitoksin je veće (zbog čega toksični efekat traje duže);  depozicija: 25% se vezuje za proteine;  metabolizam - nedovoljno proučen: digoksin - I faza: 3-b-digoksigenin, 3-keto-digoksigenin (hidroksilacija, oksidacija, nezavisno od CYP450); II faza: glukuronid i sulfat.  ekskrecija: urin - digoksin 50-70%, nepromenjen, digitoksin 10-50%, nepromenjen. Klinička slika akutnog trovanja - srce, nervni sistem, GIT  disbalans elektrolita, hiperkalijemija;  poremećaji srčanog ritma - v.ekstrasistole, bigeminija, v. tahikardija i fibrilacija, atrijalna tahikardija sa blokom;  glavobolja, konfuzija, dezorjentacija, amnezija, poremećaji svesti (koma);  neuralgični bolovi u ekstremitetima, grčevi ekstremiteta;  oftalmološka simptomatologija - smetnje vida, diplopija, fotofobija, neraspoznavanje boja;  mučnina, povraćanje, bol u trbuhu, dijareja. Terapija trovanja  stabilizacija vitalnih f-ja,  povraćanje/lavaža, aktivni ugalj, simptomatska terapija,  specifična Fab-antitela. Analitika  Identifikacija: o antimon pentahlorid; ekstrakcija - metilen hlorid; o TLC: m.f. benzen:etanol; reagens: dil. HClO4 (fluorescencija pod UV lampom)  Kvantitativna analiza: o HPLC (fluorescentni detektor, UV), o RIA, o fluoroimunoesej. β-blokatori Predstavnici - acebutolol, alprenolol, atenolol, betaksolol, metipranolol, metoprolol, nadolol, oksprenolol, pindolol, propranolol, timolol, nebivolol. Receptori  β1 receptori mahom se nalaze u srcu i deluju posredstovm aktivacije adenilat ciklaze uz delovanje G proteina; za njega se podjednakim afinitetom vezuju noradrenalin i adrenalin,  β2 receptori najzastupljeniji su na nivou pluća i vezuju adrenalin 30 puta više od noradrenalina. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 36 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Rejov sindrom Kliničke karakteristike su obimne i široke - kod dece do 15 godina koja imaju virusnu infekciju i koja su uzela aspirin (ali dešava se i bez upotrebe aspirina). Ovaj sindrom prouzrokuje hepatičku steatozu sa veoma slabom upalom i teškom encefalopatijom. Jetra je neznatno povećana i tvrda, a dešavaju su i određene promene u izgledu bubrega.  prva faza - stalno i preterano povraćanje, letargija, konfuzije i noćne more;  druga faza - stupor uzrokovan manjom upalom mozga, hiperventilacija, "masna jetra", hiperrefleksija;  treća faza - progresija navedenih simptoma, moguća koma i cerebralni edem;  četvrta faza - dublja koma, midrijaza (na svetlost), disfunkcija bubrega;  peta faza - brzo pogoršavanje simptoma četvrte faze, duboka koma, otkazivanje brojnih organa, mlitava paraliza, ekstremna koncentracija amonijaka u krvi (preko 300 mg/dL krvi), smrt. Terapija trovanja  nema specifičnog antidota;  aktivni ugalj;  tretirati komu, napade slične epileptičkim, plućni edem, hipoglikemiju i hipertermiju;  tretiranje metaboličke acidoze i.v. NaHCO3;  forsirana diureza;  hemodijaliza i hemoperfuzija. Analitika salicilata  spektrofotometrija: o uzorci: urin, krv, serum, plazma (metanolni ekstrakt); meri se salicilat, glavni metabolit acetilsalicilne kiseline. Fenolska grupa salicilata sa feri jonom (Fe(NO3)3) daje jedinjenje ljubičaste boje (Trinder-ov reagens). Intenzitet boje se meri na kolorimetru. I analizi i slepoj probi dodaje se sirupasta fosforna kiselina – da se izbegnu interferencije drugih supstanci koje reaguju sa feri jonom. Ova reakcija se može izvoditi direktno iz urina, bez prethodne ekstrakcije, te je svrstana u prethodne probe. Acetilsalicilna kiselina ne reaguje, potrebno je izvršiti prethodnu hidrolizu estra 43. Toksikološki značaj i analiza psihoaktivnih kontrolisanih supstanci Psihoaktivne kontrolisane supstance su:  opojne droge, odnosno narkotici;  psihotropne supstance;  proizvodi biološkog porekla koji imaju psihoaktivno dejstvo;  druge psihoaktivne kontrolisane supstance. Opojna droga je svaka supstanca biološkog, odnosno sintetičkog porekla koja deluje primarno na centralni nervni sistem smanjujući osećaj bola, izazivajući pospanost ili budnost, halucinacije, smetnje u motornim funkcijama, kao i druge patološke ili funkcionalne promene centralnog nervnog sistema. Npr. narkotični analgetici: morfin, metadon, petidin,fentanil, pentazocin, tramadol… Psihotropna supstanca je svaka supstanca biološkog, odnosno sintetičkog porekla koja deluje primarno na centralni nervni sistem i menja moždane funkcije, zbog čega se menja percepcija, raspoloženje, svest i ponašanje. Postoje različite podele ovih supstanci. Na primer, podela na osnovu farmakološkog dejstva tj. medicinske upotrebe, prema potencijalu izazivanja fizičke i psihičke zavisnosti, prema kazni zatvora za posedovanje i snabdevanje, itd. Podela koju daje Svetska zdravstvena organizacija i zasniva se na potencijalu izazivanja fizičke, odnosno psihičke zavisnosti podrazumeva podelu ovih supstanci u 8 grupa:  alkoholno-barbituratni tip,  opijatsko-morfinski tip,  kokainski tip,  kanabinoidni tip,  khat tip (izaziva euforiju slično kokainu), Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 39 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019.  halucinogeni tip (LSD),  amfetaminski tip,  rastvarači. Na listi psihoaktivnih kontrolisanih supstanci se nalaze i duvan i alkohol. Ministarstvo unutrašnjih poslova za terenske analize koristi tzv. "komplet za analizu praškastih supstanci" i eventualno rastvora. Radi se o kompletu reagenasa koji su specifični za određenu grupu supstanci. To su jednostavni kolor testovi. Ovakvi kompleti se ne koriste za biološki materijal, već isključivo za praškaste supstance i rastvore. Služe za preliminarnu detekciju, tj. identifikaciju supstanci. Konfirmatorna tehnika koja se koristi za analizu praškastih supstanci je infracrvena spektroskopija. Kada govorimo o biološkom materijalu, razlikujemo dve vrste metoda. Prva grupa su skrining metode, a druga grupa su konfirmatorne metode. Kao konfirmatorne metode se u najvećem broju slučajeva koristi HPLC i gasna hromatografija sa masenim spektrometrom (GC-MS), kao najpouzdanijom potvrdom identiteta neke supstance. Kada govorimo o skrining tehnikama, onda su u upotrebi test trake za detekciju psihoaktivnih kontrolisanih supstanci. Postoje test trake koje su namenjene profesionalnoj upotrebi od strane zdravstvenih profesionalaca, a takođe postoje i test trake koje mogu da se nabave u slobodnoj prodaji u apoteci i koje su našle upotrebu kada roditelji žele da prekontrolišu svoju decu. U zavisnosti toga koliko supstanci pokriva jednom analizom, odnosno može da detektuje jednom analizom, razlikuju se višekomponentne i jednokomponentne test trake. Test trake rade na principu imunohromatografskog eseja, odnosno kombinuje se imunska reakcija i hromatografija. Biološki materijal koji se koristi za analizu obuhvata urin (zlatni standard), saliva, kosa (specifična za kokain). Princip Na uranjajućem delu test trake naneta su antitela specifična za drogu. Kada se test traka uroni u uzorak doći će do vezivanja supstance za antitelo, ukoliko je u uzorku prisutna ta supstanca. Antitela okupirana tom supstancom bivaju nošena kapilarnim silama na suprotan deo test trake i stižu do tzv. T-regiona (test region) u kojem se dešava reakcija i očitava rezultat. Na T-regionu su nanete čestice supstance imobilisane u obliku jedne linije. U slučaju pozitivnog rezultata pristigla antitela su okupirana drogom i ne reaguju sa česticama droge u test regionu (izostaje promena boje, odnosno pojava linije u test regionu). U slučaju negativnog rezultata pristigla antitela nisu okupirana drogom i reaguju sa česticama droge u test regionu (dolazi do promene boje i pojave linije u test regionu). U sledećem kontrolnom regionu do kojeg stižu antitela nošena kapilarnim silama naneta su i antitela i droga, i dovoljno je da taj deo bude samo nakvašen uzorkom i omogući kontakt antigen-antitelo da bi došlo do reakcije (promena boje, odnosno pojava linije u kontrolnom regionu). U kontrolnom regionu uvek mora da se pojavi linija, jer je to znak da traka dobro radi. Ako se u kontrolnom regionu ne pojavi linija, rezultat nije validan. Svaka test traka ima cut off vrednosti koncentracija, ispod kojih ne može više da detektuje supstancu. Slične supstance, lekovi i hrana mogu biti uzrok lažno pozitivnih rezultata (heroin, kodein, morfin - štrudle sa makom). Lažno negativni rezultati su najčešće posledica manipulacija uzorcima (zamena, razblaživanje opterećenjem vodom ili pojačanjem diureze, dodatak maskirajućih supstanci). U Drajzerovoj postoji Centar za prevenciju i terapiju bolesti zavisnosti, koji pruža pomoć i u savetodavnom smislu i u terapijskom smislu. 44. Toksikološki značaj i analiza opioida Morfin Aktivni metabolit heroina (diacetilmorfin) i kodeina. Metabolizam  N-demetilacija, O-metilacija, N-oksidacija;  morfin → morfin-3-glukuronid i morfin-6-glukuronid (eliminacija); t1/2 plazma:2-3 h; Ekskrecija  urin (90%) i žuč. Toksiči efekti  depresija CNS-a, depresija disanja (edem pluća), bradikardija i hipotenzija, mioza, hipotermija. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 40 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Terapija trovanja narkotičnim analgeticima  lavaža, aktivni ugalj;  nalokson (ne kod tramadola, ne deluje primarno na µ receptore); ako ne deluje - sumnja na druge depresore. Heroin - diamorfin, diacetilmorfin Heroin 40-60% + šećer, paracetamol, kofein (hinin, mleko u prahu, skrob). Uzrok smrti - čist heroin. Depresija disanja, izrazito sužene zenice, koma → trovanje opijatima. Specifični antidot - nalokson. Heroin ima kratak poluživot u plazmi i metaboliše se deacetilacijom do morfina i 6-monoacetilmorfina - dokaz zloupotrebe heroina. Analitika narkotičnih analgetika Materijal: krv, urin, organi, kosa, koža, nepoznata supstanca...  kvalitativna analiza: o bojene reakcije - Dragendorff - narandžasto obojenje, o test trake, o TLC - acidifikovani jodoplatinat.  kvantitativna analiza: o GC (MS), o HPLC (UV, MS). Tramadol  (+/-)-tramadol - sintetski analog kodeina;  centralni analgetik (6000 puta slabiji od morfina), smanjen razvoj zavisnosti;  noradrenalinski i serotoninski efekat: (-) enantiomer inhibira preuzimanje noradrenalina, a (+) inhibira preuzimanje serotonina;  selektivno deluje na µ opiodne receptore; analgetski efekat se parcijalno inhibira naloksonom (što ukazuje na druge mehanizme delovanja). Metabolizam  N- i O- demetilacija; metaboliti se eliminišu u obliku glukuronida i sulfata;  O-dezmetil metabolit je aktivniji od samog tramadola, za N-dezmetil nije poznato. Toksični efekti  prvenstveno potiču od inhibicije preuzimanja serotonina i noradrenalina, a znatno manje od efekta na opioidnim receptorima;  znatno slabiji od opioda, respiratorna depresija, disforija i konstipacija;  konvulzije - najozbiljniji problem - pacijenti sa sklonošću ka konvulzijama;  kombinacije sa antidepresivima – opasne po život. 45. Toksikološki značaj i analiza kanabinoida Marihuana, najčešće korišćena ilegalna droga, produkt konoplje, Cannabis sativa. THC deluje umereno depresorno i halucinogeno. Metabolizam  Δ-8-THC - mala aktivnost,  Δ-9-tetrahidrokanabinolna kiselina (neaktivna),  Δ-9-tetrahidrokanabinol (delta-9-THC) (aktivni princip). THC → 11-hidroksi-delta-9-THC (aktivni metabolit) → 11-nor-delta-9-THC-delta-9-karbonska kis. → glukuronid. Kinetika - Δ-9-THC  t1/2 (plazma) - 26 do 36h, Vd - 10 L/kg,  vezivanje za proteine plazme: 94 do 99%,  ekskrecija: feces (65% doze), 11-hidroksi-Δ-9-THC karbonska kiselina (konjugat). Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 41 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Analitika  kvalitativna analiza: o test trake (lažno pozitivne reakcije), o bojene reakcije - Liebermann - crveno-narandžasto, Marquis - narandžasto u braon, ninhidrin - roze-narandžasto; o TLC;  kvantitativna analiza: o GC (ECD, MS), o HPLC (UV). 49. Toksikološki značaj i analiza novih psihoaktivnih supstanci Delom preuzeto sa sajta United Nations Office on Drugs and Crime - Sistema ranog upozoravanja. Nove psihoaktivne supstance su supstance zloupotrebe u čistom obliku ili preparati, koje nisu obuhvaćene Konvencijom o narkoticima (1961.) ili Konvencijom o psihotropnim supstancama (1971.), a koje mogu predstavljati pretnju po javno zdravlje. Termin 'nove' ne odnosi se na to da su novosintetisane (neke od njih su sintetisane i pre godina), već da su nove na tržištu. Mnoge od njih imaju efekte slične kanabisu, kokainu, heroinu, MDMA ili metamfetaminu. Posmatrajući efekte, većina njih su stimulansi, sintetički agonisti kanabinoidnih receptrora i klasični halucinogeni. Glavne grupe supstanci su aminoindani, sintetički kanabinoidi, sintetički katinoni, α- pirolidinopentiofenoni, supstance tipa fenciklidina, fenetilamini, piperazini i supstance na biljnoj bazi. Prodaju se u „head shop-ovima”, internet - kao osveživači vazduha, soli za kupanje, vitamini... Inicirale su Sistem ranog upozoravanja - kad se neka supstanca identifikuje kao nova psihoaktivna, informacija postaje dostupna u sistemu koji to prijavljuje kancelarijama zemalja članica. Podela novih psihoaktivnih supstanci • feniletilamini - veliki broj jedinjenja, • triptamini - veći broj supstanci, prvenstveno halucinogeni, • piperazini - najznačajniji predstavnici m-hlorfenilpiperazin (mCPP) i benzopiperazin (BZP), • stimulansi CNS (slično npr. ekstaziju), • sintetski katinoni - stimulansi, • sintetski kanabinoidi. Feniletilamini • analozi amfetamina, sintetski amfetamini, prve „dizajnerske droge“; • veliki broj jedinjenja; • stimulansi (osećaj empatije, entaktogeni efekat, halucinogeni efekat); • mehanizam dejstva - posledica izrazite sličnosti feniletilamina i amfetamina (alfa-metil- feniletilamin) sa dopaminom, noradrenalinom i serotoninom. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 44 Sintetski katinoni • po strukturi slični katinonu, aktivnom sastojku biljke Catha edulis, • najznačajniji polusintetski predstavnik je metkatinon, a sintetski mefedron, metilon i metilendioksipirovaleron (MDPV), alfa-PDP; • soli za kupanje, sredstva za prihranjivanje biljaka; • najčešće se unose ušmrkavanjem ili pušenjem, ređe oralno i i.v. • stimulansi - pojačavaju oslobađanje serotonina, dopamina i noradrenalina i dodatno blokiraju preuzimanje noradrenalina. Sintetski kanabinoidi • načešće se koriste kao biljne smeše, pušenjem, • sličnog dejstva kao Δ9- tetrahidrokanabinol (THC); • različite hemijske strukture koje ne moraju biti slične THC; • efekat na GIT (mučnina, povraćanje), CNS (agitacija, halucinacije, somnolencija, konvulzije, konfuznost i akutna psihoza), KVS (tahikardija, dispnea, bol u grudima); • simptomi se brzo povlače, sem akutne psihoze (može trajati nekoliko dana). Flunitrazepam (Rohipnol®) • terapija nesanice i uvod u anesteziju; • tablete su bez ukusa i mirisa, jeftine, brzo se rastvaraju u alkoholu (laka intranazalna i peroralna primena); • “date-rape drug” - euforija, halucinacije, gubitak inhibicija, amnezija; • pojačava heroinsku i kokainsku euforiju; • dejstvo se javlja za 20 do 30 min i traje do 12 h; • efekat na GABA receptore i do 10 puta jači od diazepama; • pospanost, dezorjentisanost, vrtoglavica (drowsiness, disorientation, dizziness-“DDD”), nepovezan govor, nauzeja, psihomotorni poremećaji, depresija disanja, koma; • flumazenil u slučaju depresije disanja (samo ako nisu korišćeni stimulansi). 50. Toksikološki značaj i analiza pesticida Vrste trovanja 1. Suicidalna trovanja - peroralno, intramuskularno, intravenski (usled lake dostupnosti) 2. Akcidentalna – inhalaciona trovanja radnika u polju, akcidentalna ingestija (deca ili poljoprivrednici), depoziciona trovanja Izloženost o upotreba pesticida u zatvorenom prostoru (preveliki nivoi pesticida u vazduhu, depozicija na površinama posteljina ili dečijih igračka) usled npr. prskanja sobnih biljaka o nepropisno čuvanje pesticida može dovesti do slučajne ingestije, posebno kod dece (čuvanje u bocama koje liče na boce u kojima se čuvaju sokovi i druga pića) o visoko koncentrovani pesticidi su problematični po pitanju rekonstitucije o kontaminacija pesticidima koji se koriste u domaćinstvu (za sanitarije ili kontrola štetočina), a pre svega u pogledu odlaganja i korišćenja koje nije adekvatno o usled lake dostupnosti značajna su adolescentna samoubilačka trovanja Dijagnoza trovanja Ukoliko je moguće, kao i za većinu drugih trovanja, ukoliko je osoba svesna ili je neko bio pored nje, saznati podatke o pesticidima koji su bili dostupni i o vremenu koje je prošlo od ingestije. 1. Istorija trovanja (dostupnost pesticida i vreme od primene) 2. Znaci i simptomi trovanja (koji mogu biti nekarakteristični) 3. Laboratorijski testovi Uzorci ✓ Krv ✓ Urin ✓ Lavat Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 45 Epidemiologija trovanja Studija iz 1990. godine Prema podacima iz 1990. godine (kada je rađena poslednja velika studija) akcidentalna trovanja čine 1 milion godišnje, dok samoubilačka čine 2 miliona godišnje. Od toga smrtni ishod akcidentalnih čini oko 20 hiljada godišnje, a smrtni ishod samoubilačkih 370 hiljada godišnje. Trovanja završavaju ili letalno ili češće hospitalizacijom i lečenjem. Najveću stopu trovanja beleže nerazvijene ili zemlje u razvoju usled veće dostupnosti ili neadekvatnog čuvanja pesticida. Putevi izloženosti su profesionalna upotreba, hrana, zemljište, voda, vazduh i direktna ingestija (samoubilačka ili usled ingestije iz neadekvatne ambalaže npr. pri čuvanju u flašici soka). Studije iz 21. veka Tokom 2006-2018. godine rađena je studija koja je ustanovila da 740 hiljada akcidentalnih godišnjih trovanja završi sa 7,5 hiljada letalnih ishoda, ili od 385 miliona letalni 11 hiljada. Pre svega, trovanja farmera čine oko 50 % trovanja godišnje. Glavni problem čini slučajna izloženost pesticidima. Potrebno je preduzeti bolje mere prevencije i uraditi nove, sveobuhvatnije studije. Izveštaj Američke asocijacije za kontrolu trovanja iz 2021. godine: • trovanja pesticidima su zajedno sa lekovima među top 3, a u svetu među top 10 supstanci • po pitanju izloženosti, 1. mesto zauzimaju analgetici (usled velikih pakovanja), pri čemu su pesticidi u gornjem delu lestvice top 25. supstanci (ne odnosi se nužno na razvijanje trovanja) • po pitanju trovanja dece, 1. mesto zauzima kozmetika, drugo sredstva za čišćenje, pa analgetci, pri čemu su pesticidi u gornjem delu lestvice top 25. supstanci • po pitanju trovanja odraslih, 1. mesto zauzimaju analgetici (usled velikih pakovanja), pri čemu su pesticidi u gornjem delu lestvice top 25. supstanci Podaci kod nas (2020. godina) Po pitanju poziva upućenih Centru za kontrolu trovanja, lekovi si na prvom mestu, trovanja pesticidima su bila na drugom mestu, za njima su sledili korozivi. Kod ambulantnih i hospitalizovanih bolesnika, pesticidi su bili odmah za korozivima, pri čemu je stopa zadržavanja bila 50% usled ozbiljnih simptoma trovanja (najčešće su dovoženi usled zloupotrebe PAS – alkohola i opojnih droga, zatim lekova i korozivima). Muškarci se češće truju, usled učestalijeg kontakta na polju, pre svega poljoprivrednici najčešće tokom sezone radova od aprila do septembra meseca, sezonski. Najčešći su glifosfat (teži se zabrani, ali trenutno ne postoji efikasniji pesticid, iako pokazuje karcinogenost, čeka se prelazno rešenje), inhibitori holin-esteraze, piretroidi i rodenticidi. Klinička slika je najčešće laka do srednja, iako je dolazilo i do letalnog ishoda dimetoatom suicidalno. ▪ Bolesnica lečena psihijatrijski zbog depresije popila je nepoznatu količinu organofosfornog insekticida u cilju suicida (dimetoata). U regionalnoj bolnici intubirana i rađena je lavaža želuca, nakon čega je započeta infuziona terapija. Na VMA primljena u stanju kome sa muskarinskim i nikotinskim znacima intoksikacije (posledica inhibicije acetil-holinesteraze i oslobađanja acetilholina). Dokazan preparat u krvi i urinu kao i inhibicije enzima holin-esteraze teškog stepena sa teškom metaboličkom acidozom i akutnom bubrežnom slabosti. Sve vreme na mehaničkoj ventilaciji. Primenjena je trojna antidotska terapija (1 – atropin kao antidot acetilholina, 2 – oksim za istiskivanje organofosfata iz kompleksa sa acetilholin-esterazom, 3 – diazepam da spreči efekte na CNS) i simptomatska terapija. Došlo je do letalnog ishoda. Kada su u pitanju naše kolege, farmaceuti specijalisti toksikološke hemije, oni dobijaju zahteve za analizu od lekara na osnovu anamneze i opšteg stanja pacijenta, da se utvrdi prisustvo određene supstance ili da se prati metabolit radi praćenja terapije. Najčešće analize su PAS i lekovi, dok pesticidi i eritrocitna holinesteraza (sumnja na trovanje pesticidima) zauzimaju 3% analiza. Godišnji slučajevi trovanjima pesticidima kod nas su u padu, ali verovatno je prisutan uticaj COVID- epidemije na dostupne podatke, te je broj slučajeva možda i veći. Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 46 51. Specifičnosti trovanja sa više hemijskih agenasa Preuzeto iz Clarke's analysis of drugs and poisons, 4th edition. Trovanje većim brojem supstanci je pravilo u toksikologiji odraslih. Najčešće se u pitanju kombinacije alkohola i lekova, ili većeg broja lekova istovremeno. Kada se ovo dogodi, nije neobično da se jave drastičnije promene u ponašanju ili veći rizik od letalnog ishoda, nego kada je u pitanju trovanje jednom supstancom. U najvećem broju slučajeva, neto efekat upotrebe većeg broja supstanci jednak je zbiru njihovih pojedinačnih efekata (kada govorimo o psihoaktivnom delovanju), što uglavnom rezultira depresijom centralnog nervnog sistema.  sinergistički efekat alkohola i heroina snižava fatalnu dozu heroina, upotreba alkohola i kanabisa pojačavala je sedativne efekte na CNS, dok interakcije alkohola i kokaina nisu primećene. Nekada kombinacije supstanci dovode do većeg od očekivanog efekta, za šta uzrok može biti inhibicija enzima koji metaboliše jednu od supstanci (što rezultira nagomilavanjem u tkivu) ili neka druga farmakokinetička ili farmakodinamička interakcija.  dobro je poznato da upotreba inhibitora MAO (npr. moklobemid) sa supstancom koja inhibira preuzimanje serotonina, može dovesti do potencijalno fatalnog serotoninskog sindroma;  inhibitori CYP 450 usporavaju metabolizam većine supstanci, što je slučaj sa npr. SSRI i antigljivičnim (ketokonazol) ili antiretrovirusnim lekovima (aciklovir);  u slučaju kombinacije fenobarbitona i kokaina, indukcija enzima dovodi do povećanja toksičnosti, tako što fenobarbiton pojačava aktivnost enzima CYP 450 familije, zaduženih za metabolizam kokaina N-oksidativnom bioaktivacijom i N-demetilacijom, što dovodi do nastanka hepatotoksičnih metabolita. Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 49 DODATNA PITANJA ZA ISPIT (POTPITANJA NA ISPITU) RELEVANTNE BAZE U TOKSIKOLOGIJI Podaci o svim aspektima toksičnosti nekog jedinjenja su naučno zasnovani i evaluiraju ih i objavljuju međunarodno priznata tela i organizacije.  ATSDR – Agencija za toksične supstance i registar bolesti o Toksikološki profili (Tox Profiles): jedinstvena sinteza informacija o toksičnosti određene supstance. o Svaki recenzirani toksikološki profil: odraz sveobuhvatne i opsežne evaluacije i interpretacije dostupnih toksikoloških i epidemioloških podataka o supstanci.  ECHA – Evropska agencija za hemikalije o Evropska agencija za hemikalije (ECHA) – centralna baza dosijea sa podacima o toksičnosti hemikalija i o održivom upravljanju hemikalijama. o Služi širokom spektru pravnih okvira EU kao i globalnim inicijativama, sa ciljem upravljanja rizikom od opasnih supstanci po zdravlje ljudi i životnu sredinu.  EPA – Američka agencija za zaštitu životne sredine o Misija: zaštita zdravlja ljudi i životne sredine o Svoju misiju sprovodi, između ostalog, smanjenjem rizika od toksičnih supstanci sledstveno uvid u najkvalitetnije dostupne naučne informacije o Integrisano upravlja prirodnim resursima, ekonomskim razvojem, energetskim i industrijskim resursima, i time i bezbednim upravljanjem hemikalijama  IARC – Međunarodna agencija za istraživanje raka o Najčešće korišćena klasifikacija karcinogena je prema Međunarodnoj agenciji za istraživanje raka (eng. International Agency for Research on Cancer – IARC). o Supstance se na osnovu potencijala da izazovu karcinom kod ljudi razvrstavaju u četiri grupe: ➔ Grupa 1 – karcinogen za ljude (formaldehid, busulfan, fenacetin, lindan, PCB, TCDD) postoji dovoljno dokaza o kancerogenim efektima za humanu populaciju ➔ Grupa 2A – verovatno karcinogen za ljude (tetrabromobisfenol A, akrilamid, malation, hloralhidrat, cisplatin, PBB, hloramfenikol) postoje ograničeni dokazi o kancerogenosti za čoveka, a dovoljni dokazi o kancerogenosti za eksperimentalne životinje, pri čemu brojni dokazi ukazuju na to da je mehanizam kancerogeneze isti kod životinja i čoveka ➔ Grupa 2B – mogući karcinogen za ljude (bleomicin, oksazepam) postoje ograničeni dokazi o kancerogenosti za čoveka, a nedovoljni dokazi o kancerogenosti za eksperimentalne životinje ➔ Grupa 3 – nije klasifikovan kao karcinogen za ljude (saharin, antracen, toluen) dokazi o kancerogenosti kod čoveka su nedovoljni, a kod životinja su nedovoljni ili limitirani ➔ Grupa 4 – verovatno nije karcinogen za ljude postoje dokazi koji ukazuju na nepostojanje kancerogenih efekata kod ljudi i životinja  IPCS INCHEM – Međunarodni program za bezbednost hemikalija o Baza podataka o toksičnim supstancama nastala saradnjom Međunarodnog programa za bezbednost hemikalija, SZO i Međunarodne organizacije rada (ILO). o Omogućava brz i jednostavan elektronski pristup velikom broju dokumenata koji sadrže različite podatke o toksičnim supstancama. o Dokumenti navode metode sinteze toksičnih supstanci, podatke o putevima unosa u organizam, toksikokinetici, metodama analize, vrstama uzoraka za analizu toksične supstance, epidemiološke podatke o toksičnosti za ljude i dr. Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 50  OECD – Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj o Zemlje članice sarađuju na globalnom nivou preko OECD sa ciljem usmeravanja zakonodavnih okvira i postupanja za potrebe vremena u kom živimo i izazova sa kojima se srećemo. o Deo standarda postavljenih u okvirima OECD se odnosi na ispitivanje opasnih svojstava supstanci. LD50 / LC50 Srednja smrtna doza / koncentracija (LD-50 / LC- 50) – statistički dobijena doza (koncentracija) koja izaziva smrtnost 50% ispitivanih životinja. Mera je akutne toksičnosti! Zavisi od puta izloženosti. Ove vrednosti se izračunavaju preko probit jedinica i prvi su korak u proceni toksičnosti novootkrivenog i novosintetisanog jedinjenja. Klasična ispitivanja LD50 se vrše na pacovima, pri čemu se koristi test visokih doza gde se kao najviša doza uzima ona koja dovodi do smrtnosti. Grafički, dobija se sigmoidna kriva (x-osa: doza, y-osa: % odgovora), koja se prevodi u semilogaritamski sistem. LD50 – procenjuje oralnu i dermalnu akutnu toksičnost, a postoje još i LD25 i LD100. Opseg doza se procenjuje na osnovu: (a) hemijske strukture, (b) prethodnih iskustava i (c) pilot istraživanja. Nedostaci LD su: (a) veliki broj eksperimentalnih životinja, (b) velike inter- i intraindividualne varijacije, (c) prati se samo letalitet kao odgovor pri unošenju pojedinačne doze i (d) problem ekstrapolacije na čoveka. LC50 – procenjuje inhalacionu akutnu toksičnost – primena u ekotoksikologiji voda kod riba, dafnija i algi merenjem koncentracije supstance u vodi. Kada je u pitanju histogram, prvi stubić se dobija primenom doze i beleženjem % smrtnosti, a drugi primenom sledeće doze i beleženjem % smrtnosti od kog se oduzima % smrtnosti prethodne doze i tako dalje. Probit jedinice zamenile su ručno računanje smrtnosti zasnovano na crtanju histograma. Program za stopu smrtnosti na 4 decimale izbacuje probit jedinicu, zasnovanu na statističkim tabelama. Sa grafika se zatim čita smrtna doza odgovarajuće probit jedinice. NED jedinice su normalni ekvivalenti standardnih devijacija, a sabiraju se arbitarno sa 5 kako se ne bi dobile negativne vrednosti. NED + 5 = Probit, pri čemu se vrednosti Probit jedinica kreću u rasponu od 2 do 8, za smrtnost od 0,1% do 99,9%. SISTEMATSKI TOK ANALIZE Po Kohn-Abrestu, prema sistematskom toku analize, prvu grupu otrova čine gasoviti otrovi, druga su lako isparljivi, treća mineralni otrovi, dok četvrtu grupu čine prirodni i sintetski otrovi. smrtnost 16 % NED -1 Probit 4 smrtnost 50 % NED 0 Probit 5 smrtnost 84 % NED 1 Probit 6 Kliničko-toksikološke analize 2018/2019. Kliničko-toksikološke analize 2023/2024. 51