Oplemenjivanje voćaka i vinove loze-Skripta-Genetika biometrika i eksperimentisanje-Poljoprivreda, Rezime od Genetika

Preuzmite Oplemenjivanje voćaka i vinove loze-Skripta-Genetika biometrika i eksperimentisanje-Poljoprivreda i više Rezime u PDF od Genetika samo na Docsity! Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu Zavod za oplemenjivanje bilja, genetiku, biometriku i eksperimentiranje ____ Mr. sc. Aleš Vokurka INTERNA SKRIPTA vježbe za kolegij OPLEMENJIVANJE VOĆAKA I VINOVE LOZE Voditelj kolegija: prof. dr. Ivan Pejić Napomena: skripta je nerecenzirana i nelektorirana, i kao takva služi isključivo za internu upotrebu prilikom spremanja ispita svibanj 2006. 2 Pojam fenotipa, genotipa i svojstva u oplemenjivanju voćaka i vinove loze Genotip je cjelokupna naslijedna osnova koju organizam dobiva od roditelja. To je suma svih genetičkih informacija (gena). Genotip određuje razvojni put organizma, ali se pri tome ne ostvaruju sve njegove mogućnosti i potencijali. Fenotip je skup svih svojstava organizma koja nastaju zajedničkim djelovanjem genotipa i okoline u kojoj se organizam razvija, tj. organizam kakav se ispoljava u stvarnosti (Slika 1. i 2.). F = G + E Slika 1: Različite sorte jabuka su rezultat različite genetske konstitucije Svojstvo je određena karakteristika fenotipa (komponenta fenotipa) koja je (kao i fenotp u cjelini) uvjetovana genetičkim činiocima i činiocima okoline u kojoj se organizam razvija. Prema broju gena koji kontroliraju pojedina svojstva, razlikujemo kvalitativna i kvantitativna svojstva. Slika 2: Različit fenotipski izgled ploda i lista smokve 5 prirodna ravnoteža i korisna entomofauna, i ujedno se smanjuju troškovi proizvodnje. Ovo svojstvo može imati jaku marketinšku primjenu jer se proizvod može plasirati kao tzv. ''ekološku uzgojen''. Otpornost na povremene ili stalne stresne utjecaje okoline - niske ili visoke temperature, nedostatak vlage, prevelika vlažnost tla, salinitet tla i sl. Svojstva iz ove grupe dobivaju na sve većoj važnosti zbog globalnog povećanja potreba za hranom, a i zbog toga što se urbanizacijom gube poljoprivredne površine zbog kojih se proizvodnja mora izmjestiti u područja s posebnim uvjetima tla i klime gdje su okolinski stresovi stalna prijetnja sigurnosti proizvodnje. Prilagodba posebnim uvjetima klime može se postići indirektno korištenjem podloga adaptiranih na takve uvjete. Na slici 3. prikazan je uzgoj jabuke u sjevernim krajevima gdje niska (izrazito slabo bujna) podloga omogućuje prezimljavanje rodnih izboja pod snijegom. Ovakve podloge kreirane za posebnu svrhu također su dobivene oplemenjivanjem i selekcijom. Slika 3. Jabuka uzgojena na vrlo patuljastoj podlozi zbog prilagodbe uzgoja u ekstremnim uvjetima Kvaliteta ploda - oblik, veličina i boja ploda, tekstura i boja mesa, omjer kiselina i šećera, prehrambena vrijednost. U zadnje vrijeme se sve više ističe bogatstvo pojedinih sorata vitaminima, mineralima i antioksidansima. Mogućnost mehanizirane berbe - naročito važno za maslinu, vinovu lozu, višnju, tj. plodove koji su namjenjeni industrijskoj preradi (Slika 4. i 5.). Mogućnost mehanizirane berbe ovisi o čvrstoči i teksturi mesa ploda koja mora biti otporna na udarce i mehanička oštečenja. Slika 5. Strojno branje grožđa (Izvor: www.pacificpalate.com) Slika 4. Strojno branje maslina (Izvor: www. froc.com.au) 6 Opisivanje pojedinih svojstava u oplemenjivanju i selekciji voćaka i vinove loze Osnovna pitanja su kako pristupiti opisu pojedinih svojstva sa ciljem dobivanja vjerodostojnog opisa sorata (genotipova, klonova) koje želimo analizirati. Važno je odrediti metodiku i način prikupljanja podataka, a podatke treba prikupljati u za to odgovarajučem vremenu, ovisno o razvojnom stadiju voćke ili trsa. Proučavanje genotipa je posredno i uvijek se provodi preko fenotipa, bilo da se radi o proučavanju i opisivanju biljnog genetskog materijala koji će se koristiti za hibridizaciju (ulaznog materijala), materijala koji je rezultat hibridizacije (izlaznog materijala), ili materijala unutar kojeg se provodi klonska selekcija. U postupku pronalaženja genetskog materijala koji bi se mogao iskoristiti u stvaranju novih sorata potrebno je utvrditi razliku između negenetske varijabilnosti i varijabilnosti koja je proizlazi iz genetske konstitucije i koja je naslijedna. Svrha pravilnog pristupa i organizacije kod uzimanja podataka za analizu i opis pojedinih svojstava jest izbjagavanje negenetske varijabilnosti, odnosno njeno svođenje na najmanju moguću mjeru. Negenetska varijabilnost je varijabilnost koja je vidljiva na fenotipskom izgledu, ali je uzrokovana biotskim i abiotskim faktorima koji nisu genetske prirode, tj. ne proizlaze iz genetske konstitucije promatrane jedinke (stabla ili trsa). Čimbenici negenetske varijabilnosti su: 1. Virusi i viroidi, i opće zdravstveno stanje često mijenjaju izgled voćke, trsa ili ploda. Ovisno o vrsti virusa zaražena jedinka ima povećanu ili smanjenu bujnost (razlika u vigoru), može imati različit oblik ili veličinu ploda (Slika 6. i 7.), kvaliteta plodova je najčešće smanjena (sastav šećera, kiselina, nutritivnih tvari), a voćka ili trs je osjetljivija na napade drugih bolesti. Prisutnost virusa ponekad, kada to omogućuju ekološke prilike, može biti izražena na listu ili cijelom trsu(Slika 8. i 9.), no najčešće su virusi latentni i nevidljivi (za njihovu detekciju postoje biotehnološke metode: ELISA test, indeksiranje). Slika 6. Plod trešnje zaražene virusom Little Cherry Virus (LChV) i usporedba sa zdravom (Izvor: www.bocu.ac.at) Slika 7. Plod i list trešnje zaražene virusom Cherry Twisted Leaf Virus (ChTLV) (Izvor: www.bocu.ac.at) 7 Slika 8. List v. loze zaražene virusom Grapevine Fanleaf Virus (GrFV) (Izvor: www.agf.gov.ca) 2. Podloga na koju je cijepljena plemka sorte ima utjecaj na bujnost i vigor, ali i na vrijeme ulaska voćke ili trsa u pojedine fenofaze. 3. Ishranjenost voćke ili trsa u ekstremnim prilikama manifestira se kroz simptome vidljive na listu ili plodu koji su specifični za svako pojedino hranivo. Kod uobičajenih slučajeva pomanjkanje hraniva vidi se kroz smanjenu bujnost, veličinu i kvalitetu plodova. 4. Položaj - mikroreljef i mikroklima stvaraju razlike (modifikacije) u pojedinim svojstvima, npr. znatno viši sadržaj šećera u grožđu uzgojenom na južnim ekspozicijama u usporedbi sa manje povoljnim ekspozicijama. Procjena jednog genotipa preko njegovog fenotipa svodi se na opažanje svojstava većeg broja jedinki (klonova) kroz veći broj mjerenja (u više navrata kroz višegodišnje pokuse) na više lokacija. Većim brojem mjerenja kroz vrijeme i prostor smanjuje se utjecaj okoline na statistički opravdanu razinu, čime se povečava sigurnost i vjerodostojnost istraživanja. Opažanja na razini fenotipa uključuju: - fenotipska opažanja kojima se prate razvojne faze tijekom vegetacijske sezone (npr. kretanje vegetacije, početak cvatnje, puna zrioba i dr.), - opažanja morfoloških svojstava (npr. postojanje dlaćica na listu, oblik lista, oblik ploda, postojanje krilca na grozdu i dr.), - mjerenja kvantitativnih svojstava (npr. udio šećera i kiselina u plodovima, udio vitamina, antocijana, masa ploda, randman ploda, dužina peteljke i dr.), - opažanja otpornosti i tolerancije na bolesti i štetnike, - opažanja koja se odnose na okolinske stresove (npr. otpornost i tolarancija na izmrzavanje u fazi mirovanja, otpornost na mraz u vrijeme kretanja vegetacije i cvatnje, otpornost na sušu). Zbog dugotrajnosti procesa oplemenjivanja voćaka i vinove loze (višegodišnje kulture) samo pažljivo odabran i analiziran genotip može poslužiti kao početni materijal za kreiranje novih kultivara i podloga. Slika 9. Trs v. loze (Pinot crni) zaražen virusom Grapevine Leafroll Virus (GrLV) (Izvor: www.winegrapes.temu.edu) 10 Slika 12. Infekcija V. inaequalis na listu (Izvor: www.uky.edu; www.plante-doktor.dk) Veličina i oblik ploda Veličina plodova (Slika 14.) izravno utječe na njihovo svrstavanje u kategorije prilikom plasmana na tržište. Plodovi jabuka koji imaju manje od 60 mm u promjeru nisu pogodni za stolnu upotrebu (takvi plodovi mogu proći samo za industrijsku upotrebu), a za stolnu upotrebu nisu najpogodniji niti suviše krupni plodovi. Promjer ploda se mjeri po horizontalnoj osi ploda. Plod može biti različitog oblika (Slika 15., 16. i 17.), plosnat, više ili manje ovalan, izdužen (breskva), a ta karakteristika se opisuje omjerom visine i promjera ploda i izražava se u postotku. Na primjeru jabuke, ako je vrijednost manja od 65%, plod se smatra plosnatim, a ako je vrijednost oko 100% plod je izdužen. Slika 14. Razlike u obliku i veličini plodova masline Slika 15. Razlike u izduženosti plodova Slika 13. Infekcija V. inaequalis na plodu (Izvor: www.uky.edu; www.plante-doktor.dk) 11 Slika 16. Razlike u obliku i veličini plodova avokada Randman ploda, jezgre ili mošta Randman je važno svojstvo a predstavlja iskoristivi dio plodova voćaka i vinove loze. Kod vinove loze pod randmanom se smatra udio bobica u odnosu na peteljkovinu, ili udio mošta u odnosu na ukupnu masu grožđa. Kod koštičavog voća mjeri se randman (masa) mesa u odnosu na koštice, a kod lupinastog voća randman jezgre. Randman se uvijek izražava u postotcima. Kod oraha randman jezgre mora biti veći od 45%, što znači da od ukupne mase plodova na iskoristivi dio (jezgru) otpada 45%. Najbolje sorte oraha imaju randman jezgre oko 50%. Opća kvaliteta ploda Opća kvaliteta ploda sa stanovišta potrošača može se ocijeniti degustacijom koju prati anketa, a u anketama se ocjenjuju svojstva koja su zanimljiva potrošačima: izgled ploda (privlačan oblik, boja), miris i okus ploda, aroma i sklad okusa. Ankete obično imaju nekoliko postavljenih pitanja (ne smiju biti preopširne), a čest pristup je i rangiranje plodova (potencijalnih sorata) u kategoriji pojedinih svojstava. Pitanja su, npr: - ocjenite aromu ploda (a ocjene su od 1-3 ili 1-5) - rangirajte ponuđene plodove prema jačini arome (pri čemu su plodovi označeni brojevima) od najboljeg do najlošijeg Degustacije plodova u kojima sudjeluju potrošači su obično povezane uz izložbe (npr. ''Dani jagoda'' u Zagrebu ili ''Dani trešanja'' u Lovranu). Slika 17. Razlike u obliku plodova višnje i trešnje (Izvor: www.ipgri.cgiar.org) 12 Zaključak Oplemenjivački materijal za uvrštavanje u oplemenjivačke programe (ulazni materijal za križanja) ili oplemenjivački materijal koji je rezultat križanja ili klonske selekcije (koji ima potencijal sortnog ili klonskog priznavanja) može se izdvojiti samo na temelju točno opisanih i analiziranih svojstava. Izboru materijala treba pristupiti vrlo rigorozno, jer raditi sa manjim brojem kvalitetnih potencijalnih genotipova je puno jednostavnije, učinkovitije i financijski povoljnije. Materijal može biti vrhunski u pogledu pojedinih svojstava (npr. kvaliteta ploda ili adaptabilnost na nepovoljne uvjete klime i tla), ali ako je izrazito nepovoljan u drugim gospodarski važnim svojstvima (npr. osjetljiv na bolesti) on se odmah eliminira iz daljnjeg selekcijskog postupka. Eventualno, takav materijal se može sačuvati u kolekcijskim nasadima kao izvor gena povoljnih svojstava za buduće oplemenjivačke programe. Stvaranje sorte kod voćaka i vinove loze je dugotrajan rad koji od postavljanja oplemenjivačkog programa sa točno definiranim ciljevima, preko uzgoja križanaca i njihove selekcije u mikro i makropokusima, pa sve do administrativnog priznavanja sorte, može potrajati više od deset, pa i 15 godina. Nakon dugogodišnjeg oplemenjivačkog rada potreban je kvalitetan marketing da sorta bude prihvaćena na tržištu (Slika 18.). Kao primjer kvalitetnog marketinga može se spomenuti sorta jabuke Pink Lady (Slika 19.) (dobivena selekcijom križanaca sorata Zlatni delišes i Lady Williams), s tim da marketing mora biti utemeljen na vrhunskim svojstvima nove sorte (www.pinkladyapples.co.uk, www.pinklady- europe.com). Za sortu Pink Lady osmišljen je poseban zaštitni znak (logo): , uz sva zakonski zaštičena oplemenjivačka prava (intelektualno vlasništvo). Ova sorta se na tržištu tretira kao jaka robna marka i postiže cijene nekoliko puta veće u odnosu na uobičajene sorte. Slika 18. Prikaz sorte avokada sa naglaskom na svojstva koja imaju snagu privlačenja kupca (Izvor: www.unc.edu) Slika 19. Pink Lady (Izvor: www.pinkladyusa.com) 15 Slika 23. Ženski cvijet kivija (Actinidia sp.) Izvor: www.cornhillnursery.com Samooplodnja i stranooplodnja Samooplodnja (autofertilitet) je sposobnost sorte da nakon oprašivanja vlastitim polenom, tj. polenom sa istog stabla ili s bilo kojeg drugog stabla iste sorte (istog genotipa) zametne plod koji će imati razvijene sjemenke s embrijem. Autofertilitet je kod voćaka rijetka pojava, a javlja se kod breskve, marelice, maline, ogrozda i ribiza. Većina ostalih voćnih vrsta i vinove loza su autosterilne, što znaći da je za pravilan razvoj ploda i embrija potrebna sorta različitog genotipa i drugačije genetske konstitucije (sorta oprašivač). Autofertilitet je u pravilu isključen kod jabuke, kruške, oraha, badema i smokve i starih tradicionalnih sorata trešnje (one su autosterilne i stranooplodne), dok su sorte šljive i višnje autofertilne do određenog stupnja i samo za neke sorte je potreban oprašivač. Oplemenjivanjem je moguće unijeti gen za autofertilnost, a primjer su sorta jabuka Cox's Orange i novije sorte trešanja Lapins, Stella, Sweetheart. Mehanizmi stranooplodnje Stranooplodnja je u prirodi potrebna zbog osiguravanja genetske varijabilnosti i lakšeg prilagođavanja različitim okolinskim utjecajima. Stranooplodnja uzrokuje veću genetsku osnovu za prirodnu selekciju u procesu evolucije. Postoje različiti mehanizmi kojima je u prirodi osigurana stranooplodnja. 1. Morfološki Dvodomne biljke kod kojih su muški cvjetovi odvojeni od ženskih: orah, lijeska, pitomi kesten, kivi. Stranooplodnja, najčešće vjetrom i insektima, osigurana je fizičkom odvojenosti muških i ženskih cvjetova Slika 24. Ženski cvijet kivija (Actinidia sp.) Izvor: www.cornhillnursery.com 16 2. Dihogamija Dihogamija je svojstvo koje se odnosi na dinamiku sazrijevanja tučka i prašnika, kod kojeg ta dva osnovna dijela cvijeta sazrijevaju u različito vrijeme. Vremenskom odvojenošću osigurava se stranooplodnja Protaginija - sazrijevanje tučka prije sazrijavanja prašnika - takav cvijet prima polen drugih genotipova ili sorata koje koji je zreo u isto vrijeme Protandrija - sazrijevanje prašnika prije sazrijevanja tučka - polen tog cvijeta služi za oprašivanje cvjetova drugih genotipova. 3. Fiziološko-genetski Mehanizam stranooplodnje je postojanje multiplih S alela koji uzrokuje gametofitsku i sporofitsku inkompatibilnost. U daljnjem tekstu ćemo objasniti gametofitsku i sporofitsku inkompatibilnost (varijante fiziološko-genetske inkompatibilnosti) i djelovanje S alela. Gametofitska inkompatibilnost (Slika 25.) je genetsko svojstvo kontrolirano jednim lokusom (S-lokus) s više različitih alela (S-alela) koji se mogu nalaziti na tom lokusu u haploidnom tkivu polena. Do oplodnje može doći jedino u slučaju kada je S alel u haploidnom genomu polena različit od bilo kojeg S alela u diploidnom genomu tkiva njuške tučka. Postojanje S alela svojstveno je koštičavim vrstama: trešnja, šljiva, bajam. Geni na S lokusu su odgovorni za nastanak posebnih RNAza (enzimi koji razgrađuju RNA) iz skupine S-glikoproteina. Svojstvo samooplodnosti nastaje mutacijom gena koji kontroliraju sintezu RNAza i one gube svoju aktivnost. Slika 25. Shema gametofitske inkompatibilnosti (Izvor: www.sccs.swarthmore.edu) Mehanizam sporofitske inkompatibilnosti je složeniji (Slika 26.), a uzrokuje ju diploidno tkivo sporofitske generacije prije nastanka haploidnog polena tj. prije mejoze. U tom diploidnom tkivu (npr. S1S2) se stvaraju posebni proteini (SCR1 i SCR2) koji bivaju, budući da nastaju prije 17 trenutka mejoze, inkorporirani u ovoj oba haploidna polenova zrnca, i u S1, ali i u S2. U ovom slučaju S2 polen ne može proklijati na njuški tučka koja ima S1S3 genotip, i to upravo zato što S2 polen sadrži ne samo SCR2 protein, negi i SCR1 koji je identičan proteinu u vratu tučka i koji sprečava razvoj polenove mješinice. Slika 26. Shema sporofitske inkompatibilnosti (Izvor: www.sccs.swarthmore.edu) Čest morfološki marker za sporofitsku inkompatibilnosti jest heterostilija. Heterostilija sama po sebi nije uzrok samoinkompatibilnosti, ali je vezano svojstvo koje uvijek ide zajedno sa svojstvom samoinkompatibilnosti. Sve autofertilne sorte mogu, osim sa polenom vlastitog genotipa, biti oplođene i polenom drugih sorata (što je važno u nastanku sorata), ali i kod samoinkompatibilnostii uvijek nalazimo manji stupanj autofertilnosti, što je uglavnom zanemarivo. Samooplodnja u voćarskoj praksi Samooplodnja je poželjna u voćarskoj praksi jer: − omogućuje podizanje voćnjaka samo sa jednom sortom, što omogućuje smanjivanje manipulativnih i organizacijskih troškova kod sadnje i eksploatacije voćnjaka − oprašivanje, a time i prirod, manje ovisi o vremenskim prilikama u vrijeme cvatnje - vremenske prilike se mogu u kratkom periodu cvatnje znatno pogoršati što onemogućuje let insekata (kiša, vjetar) − samooplodnja se praktično koristi u selekciji i proizvodnji generativnih podloga (npr. vinogradarska breskva kao generativna podloga), a oplemenjivački postupci sa samooplodnim vrstama i sortama su drugačiji jer kod provedbe umjetne hibridizacije zahtijevaju emaskulacija. 20 Čuvanje polena Polen se stavlja u plastične ''tubice'' (Slika 30.) (npr. Eppendorf tubice) ili papirne vrećice. Polen se kratkotrajno, do nekoliko tjedana, može čuvati u desikatoru (uz anhidrirani CaSO4) (Slika 31.) na temperaturi hladnjaka od +4ºC (desikator se smješta u hladnjak). Pri temperaturi od -20ºC polen se može čuvati nekoliko godina bez značajnog gubitka vijabilnosti. U cjelokupnom postupku sakupljanja, čuvanja i rada sa polenom potrebno je biti sistematičan, pažljivo voditi bilješke i paziti da se polen različitih genotipove ne pomiješa, tj. da ne dođe do kontaminacije različitim polenom. Planska hibridizacija voćaka Provedba planske hibridizacije zahtijeva ne samo poznavanje biologije (fiziologije cvatnje i građe cvijeta), nego i razumijevanje niza ekoloških čimbenika koji djeluju na vrijeme, dužinu i dinamiku cvatnje. Za izvođenje svih postupaka u planskoj hibridizaciji (sakupljanje polena, emaskulacija, izolacija cvijeta, umjetno oprašivanje) potrebno je pravilno odrediti vrijeme u kojem se svaka pojedina operacija izvodi. Vrijeme izvođenja ovih postupaka određuje se prvenstveno na temelju biologije cvatnje. Emaskulacija i izolacija cvijetova su osnovni postupci kojima se sprečava dolazak (prirodno donošenje) polena sa biljaka koje nisu predviđene u planskoj hibridizaciji. Izolacijom se sprečava alogamno križanje, tj. dolazak polena nepoznatog porijekla na cvijet biljke koje je planom oplemenjivanja određena da bude majčinska. Izolacija cvjetova se provodi neposredno pred otvaranje cvijetova. Ako u vrijeme izolacije pokoji cvijet bude otvoren, potrebno ga je ukloniti jer nam nije poznato da li je već alogamno oprašen polenom nepoznatog porijekla koji je do cvijeta došao anemofilno (vjetrom) ili entomofilno (insektima). Slika 30. Plastične ''tubice'' u kojima je moguće držati sakupljen polen. Izvor: www.spexcsp.com Slika 31. Desikator Izvor: www. ecs.umass.edu 21 Za izolaciju se koriste papirnate vrećice različitih veličina koje je moguće lako pričvrstiti na granu voćke sa cvijetom (Slika 32. i 33.). Papirnate vrećice su prozračne, kroz njih prodire toliko svjetla koliko je potrebno za razvoj zametnutih plodova, a na jih se grafitnom olovkom mogu zabilježiti podaci o križanju (Slika 34.). Slika 32. Izolacijske vrećice mogu se spojnicama pričvrstiti na granu voćke (Foto: A. Vokurka) Slika 34. Na izolacijske vrećice mogu se grafitnom olovkom napisati podaci o broju izoliranih cvjetova i križanju (Foto: A. Vokurka) Emaskulacijom (Slika 39.-40.) se sprečava oplodnja cvijeta majčinske biljke vlastitim polenom (samooplodnja) tako da se pravovremeno odstrane prašnici (ili samo antere). Emaskulacija je nužna kod autofertilnih sorata voćaka i kod vinove loze. Emaskulaciju je moguće izvesti: - odstranjivanjem antera (polenovnica) ili cijelih prašnika: češljem, odnosno malim škarama ili pincetom. Ovaj pristup zahtjeva brzinu jer postupak treba provesti u kratkom vremenskom roku kada su svjetovi već otvoreni, ali prije otvaranja (pucanja) samih antera. Slika 33. Izolacijske vrećice mogu stajati na stablu nekoliko tjedana (Foto: A. Vokurka) 22 Pri vrlo toplim i suhim vremenskim prilikama antere pucaju vrlo brzo, pa je i rok za provedbu emaskulacije vrlo kratak. - odstranjivanjem latica i prašnika: škaricama ili pincetom, ili jednostavno prstima. Koristi se kad su cvjetovi neposredno pred otvaranjem, a da bi se uklonili prašnici potrebno je prije toga ukloniti i latice. Pri emaskulaciji potrebno je odstraniti nedovoljno razvijene cvjetove i cvjetove koji su već otvoreni, čime se ujedno postiže i prorijeđivanje cvatova. Nakon emaskulacije samooplodnih cvjetova potrebno ih je izolirati jer samooplodni cvjetovi se također mogu oploditi i polenom koji dolazi sa strane. Međutim, ako se prilikom emaskulacije odstranjuju i latice, tada izolacija nije nužna jer cvjet bez latice ne može privući insekte - ali je ipak preporučljiva zbog zaštite cvijeta. Slika 39. - 40. Prikaz emaskulacije cvijeta jabuke (Foto: A. Vokurka i studenti gen. 2005./06.) 25 Dormantnost i stratifikacija sjemena Dormantnost je jedan od najvažnijih faktora koji utječu na uspjeh klijanja sjemena i u proizvodnji križanaca je potrebno razumjeti fiziološke mehanizme koji djeluju na njeno trajanje. Dormantnost je svojstvo sjemena da neko vrijeme nakon zriobe miruje - privremena nesposobnost klijanja u periodu jarovizacije (vernalizacije). Ovaj period se još naziva period naknadnog dozrijevanja sjemena (afterripening). Dormantnost je fiziološki mehanizam prilagodbe razvijen kod biljaka umjerenog klimatskog područja kako bi u ranijim stadijima razvitka izbjegle nepovoljne prilike tijekom kasne jeseni, zime i ranog proljeća. Priroda dormantnosti nije u potpunosti razjašnjena - ranije se smatralo da je glavni uzrok dormantnosti čvrst endokarp (kod koštičavog voća - Prunoideae) (Slika 41 ), što je samo djelomično točno. Tvrd endokarp samo donekle usporava klijanje, jer otežava upijanje vlage i disanje, a glavni uzrok dormantnosti je kemijsko-fiziološke prirode. Slika 41: Građa ploda koštičavog voća (Izvor: http://waynesword.palomar.edu) Unutar sjemena nalaze se specifične tvari koje inhibiraju klijanje (koje se zajednički nazivaju dormeni), a pod utjecajem niskih temperatura te se tvari postupno razgrađuju. Dvije vrste dormantnosti: primarna i sekundarna. Dormantnost ima ulogu prevencije klijanja u nepovoljnim zimskim uvjetima što omogućuje preživljavanje potomstva. 26 Primarna dormantnost je dormantnost prisutna u zrelom sjemenu u trenutku ubiranja ploda (kad je plod fiziološki zreo). To je endogena dormantnost, koju uzrokuju kemijski činioci koji se nalaze u samom sjemenu - dormeni - kemijske tvari koje se nalaze u integumentima sjemenog zametka (iz kojeg nastaje zaštitni omotač sjemena), ali ih ima i u samom embriju. Sjeme kojemu je dormantnost u primarnoj fazi ne može proklijati kad bi se i našlo u uvjetima pogodnim za klijanje (temperatura, vlaga, tlo) zato što su dormeni fizički prisutni u sjemenu (nisu se još razgradili pod utjecajem niskih temperatura). Dormeni sprečavaju klijanje, ali se pod utjecajem niskih temperatura tijekom zimskog perioda razgrađuju što omogućuje klijanje sjemena nakon što temperature porastu. Tvari koje uzrokuju dormantnost su po kemijskom sastavu vrlo raznolike, a produkt su fizioloških i biokemijskih reakcija metabolizma: derivati benzojeve kiseline: ABA, salicilna i cimetna kiselina, kumarin, apscisinska kiselina i dr. Sekundarna dormantnost je dormantnost koja onemogućuje klijanje i nakon razgradnje dormena, a uzrokovana je nepovoljnim ekološkim uvjetima kao što su previsoka ili preniska temperatura, ili nedostatak vlage u tlu. U ovakvim uvjetime sjeme ne može proklijati unatoč tome što su dormeni (primarna dormantnost) već razgrađeni utjecajem niskih temperatura. Čim ekološki uvjeti za klijanje sjemena postanu povoljni, a nakon što sjeme prođe stadij vernalizacije (jarovizacije) ili stratifikaciju, sjeme može proklijati. Vernalizacija (jarovizacija): je period u kojem je sjeme dormantno i tijekom kojeg postupno dolazi do gubitka dormantnosti u prirodnom okruženju. Stratifikacija: je biotehnički postupak kojim se skraćuje period dormantnosti i pospješuje brže i ujednačenije klijanje sjemena za potrebe rasadničarske proizvodnje (npr. generativnih podloga breskve) ili oplemenjivanja voćaka Metode stratifikacije • Čuvanje sjemena na suhom i hladnom mjestu. • Čuvanje sjemena na vlažnom i hladnom mjestu - ova metoda se najviše koristi jer je učinkovita i jednostavna. Sastoji se od naizmjeničnog slaganja redova vlažnog pijeska ili piljevine i redova sjemena u plastične ili drvene sanduke koji se ostavljaju stajati od nekoliko tjedana do nekoliko mjeseci uz povremeno polijevanje. • Natapanje sjemena u kemijskim razrijeđenim otopinama (tiourea, KNO3, polietilen glikol, sumporna kiselina, natrijev hidroksid, aceton, etanol) • Mehaničko razbijanje tvrdog endokarpa • Mehaničko struganje i grebenje sjemena - skarifikacija • Kratko potapanje sjemena u kipućoj vodi • odvajanje embrija od ostatka sjemenke 27 U praksi se koristi metoda držanja sjemena na hladnom i vlažnom mjestu, i eventualno skarifikacija (za što su konstruirani posebni uređaji), dok ostale metode imaju ograničenu i uglavnom eksperimentalnu primjenu. Niske temperature mogu imati različit efekt ovisno o tome koliko sjeme upije vlage. Svi postupci kod kojih nije uključena niska temperatura ne mogu zamijeniti djelovanje niskih temperatura na sjeme, već samo donekle omogućuje klijanje. Praksa je pokazala da sjeme nakon perioda od 2-3 godine ima bolju klijavost nego sjeme koje je prošlo kroz proces stratifikacije i koje je posijano iduće vegetacijske sezone, ali u proizvodnji se ne može čekati. Kod temperature od 0-10 ºC, prirodno mirovanje sjemena pojedinih vrsta traje od 36 do 180 dana, ali pojedine sjemenke i znatno dulje. Prema različitim literaturnim navodima, prirodno trajanje dormantnosti sjemena pojedinih vrsta je varijabilno, a ovisi i o genotipu (genetski je uvjetovano svojstvo): Jabuka 76 - 120 dana Kruška 74 - 119 dana Trešnja 90 - 143 dana Višnja 180 dana Šljiva bistr. 100 - 149 dana Breskva 70 - 117 dana Stratifikacija sjemena Prunoidea Tijekom stratifikacije simuliraju se prirodni uvjeti kojima je sjeme inače izloženo u prirodi preko zime. Optimalna temperatura za stratifikaciju Prunoidea je u interval između 3 i 5 ºC, u trajanju od nekoliko mjeseci. Prema nekim autorima ovu temperaturu treba u nekoliko intervala izmjenjivati sa višom temperaturom zbog uspostave ravnoteže između rasta korjenčića i hipokotila (na nižim temperaturama korijen puno brže raste od hipokotila). Osim toga, topli intervali omogućuju slabije razvijenim embrijima da se u potpunosti razviju. Stratifikacija sjemena Pomoidea Dormantnost je u Pomoidea zbog nepostojanja tvrdog endokarpa nešto slabije izražena nego kod koštičavog voća, pa su i postupci za njeno uklanjanje blaži. Dormantnost svježeg sjemena jabuka i krušaka se gubi ukoliko ga podvrgnemo hladnoj stratifikaciji na 3-5 ºC u trajanju od 6 mjeseci. Za sjeme izdvojeno iz potpuno zrelih ili čak natrulih jabuka dovoljan je kraći period stratifikacije nego za sjeme iz plodova nižeg stupnja zrelosti. Kod krušaka je ustanovljena jača dormantnost sorata koje su porijeklom iz klimata sa hladnijim zimama, dok stratifikacija sorti iz toplijeg klimata traje kraće i odvija se pri nešto višim temperaturama, što je logična pojava jer dormantnost i služi za sprečavanje klijanja tijekom zime. Dormantnost se kod sjemena jabuke može prekinuti uklanjanjem ovojnice sjemena a da se sjeme ne podvrgne hladnoj stratifikaciji. Biljke iznikle iz takvog sjemena pokazuju patuljast ili rozetast rast, sa kratkim internodijima - nakon nekoliko mjeseci poprimaju normalan rast. Za većinu sorata krušaka i jabuka skidanje ovojnice nije dovoljno za prekid dormantnosti - ono može samo skratiti dormantnost. 30 Primjena citokinina na reguliranje cvatnje: Dodatak citokinina u ranim fazama nastanka embrionske vreće može promjeniti ravnotežu inhibitora (kod staminalnih cvjetova), tako da se tučak ipak može normalno razviti, što može imati praktičnu primjenu u oplemenjivanju. Primjena citokinina kod pistilarnih cvjetova da bi se dobili hermafroditni, ne daje rezultate. Dinamika cvatnje vinove loze Cvatnja (otvaranje cvjetova) je najintenzivnije između 6 i 11 sati prije podne, a popodne samo sporadično. Emaskulacija i kontrolirana hibridizacija (praktična vježba): Postupak je prikazan na slikama 45. - 48. 1. emaskulacija: prije otvaranja cvjetova otkinuti pincetom kapicu i prašnike na 20-30 cvjetova po grozdu, a ostale ukloniti (prorijeđivanje cvata) 2. izolirati grozdove emaskulirane cvatove (cvatove majke) 3. čekati 1-2 dana za oplodnju kako bi tučak bio zreo za primanje polena 4. oprašivanje nanošenjem prethodno sakupljenog polena kistom ili prstima Slika 45. Skidanje kapica i emaskulacija Izvor: www.nysaes.cornell.edu Slika 47. Izgled grozda (cvat) kojem su uklonjene polenovnice. (Izvor: www.nysaes.cornell.edu) Slika 46. Nanošenje polena kistom Izvor: www. www.nysaes.cornell.edu Slika 48. Polen se može nanositi i izravno sa cvijeta očinske biljke Izvor: www. www.nysaes.cornell.edu 31 O križanjima vinove loze može se više saznati na: www.nysaes.cornell.edu/hort/faculty/reisch/breeding/crossing1.html Skraćivanje juvenilnog stadija kod vinove loze Juvenilni stadij je vremenski period koji počinje nicanjem sjemenjaka iz sjemena, a završava zametanjem prvih generativnih (cvjetnih) pupova i uolaskom u rod. Upravo juvenilni stadij je najvažniji čimbenik dugotrajnosti u oplemenjivanuju voćaka i vinove loze, i cilj je skratiti ga na najmanju moguću mjeru prilikom ispitivanja sjemenjaka. Juvenilni period kod vinove loze traje od 3 - 6 godina, a može se skratiti na različite načine. 1. U uvjetima staklenika uz rezidbu koja stimulira nastanak rodnih pupova. 2. Okuliranje - uzimanje pupova i plemki juvenilnih biljaka i njihovo okuliranje na trsove koje su u fazi rodnosti 3. Primjena citokinina - na vegetativni vrh biljke križanca uzgojene u loncu djeluje se citokininima što dovodi do nastanka fertilnih cvatova, na mjestima gdje bi se inače razvile vitice. Na taj način moguće je dobiti cvjetove već 4 tjedna nakon klijanja sjemena. Somatske mutacije i klonska selekcija vinove loze Prirodne i inducirane mutacije su važan izvor varijabilnosti kod vinove loze. Prirodni mutanti su rezultat promjene u genimu stanica meristemskog tkiva iz kojih započinje razvoj organa (vidljive mutacije) - pojava novog svojstva ili poboljšanje postojećeg svojstva često je razultat pozitivne mutacije. Klonske sorte su sorte nastale kao vegetativni potomci jednog genotipa. Takve sorte, pogotovo ako su već dugo u uzgoju (stotinu i više godina) i ako su rasprostranjene na širem geografskom području nakupile su veliku količinu mutacija (vidljivih ili latentnih). Takve sorte su somatski heterogene i dobar su izvor genetske varijabilnosti unutar kojeg se može provoditi klonska selekcija. Slika 49. Pinot crni Slika 50. Pinot sivi 32 Mutacije se najvidljivije kao promjene u boji bobica, razlike u obliku lista, obraslosti dlačica, promjeni veličine ploda, i ovakve mutacije je lako uočiti unutar polazne populacije. Grupa sorata Pinot (Bijeli, Sivi, Crni) (Slika 49. i 50.), kao i neki besjemeni mutanti koji su zanimljivi kod stolnog grožđa, nastali su uočavanjem prirodnih mutacija unutar postojećih populacija. Postoje i mutacije koje imaju utjecaj na fenološka svojstva (npr. ranija ili kasnija zrioba) ili svojstva koja utječu na kvalitetu (sadržaj šećera i kiselina, visina prinosa). Promjene u ovakvim svojstvima teže se uočavaju, ali ih je moguće zapaziti redovitim promatranjem fenofaza ili mjerenjima (kemijske analize mošta, vaganje). Ponekad male fenotipske razlike slične klonskim proizlaze i od djelovanja virusa i viroida ali i zbog djelovanja abiotskih faktora. Ovo je negenetska varijabilnost koju treba razlikovati od genetske naslijedne varijabilnosti. Ocjenjivanje svojstava i odabir potencijalnih klonova za priznavanje provodi se po razrađenim shemama klonske selekcije tijekom koje se većina početno odabranih kandidata eliminira. Nova ili poboljšana svojstva moraju imati ekonomsku važnost - u početnim koracima klonske selekcije izabiru se superiorni "potencijalni klonovi", a nakon višegodišnjeg ocjenjivanja njihovih svojstava eventualno se pristupa proceduri administrativnog priznavanja klona i puštanju u proizvodnju. Tijekom klonske selekcije potrebno je eliminirati materijal koji je zaražen virusima i virusima sličnim organizmima, jer klonovi koji će se priznati i uvrstiti u rasadničarsku proizvodnju kao matični trsovi moraju biti bezvirusni (virus free). Unutar populacija koje su se tradicionalno razmnožavale cijepljenjem plemki uzetih iz proizvodnih vinograda (a ne od matičnih trsova koji su rezultat klonske selekcije), osim trsova sa pozitivnim mutacijama postoje i trsovi zaraženi virusima kakve je potrebno eliminirati. Eliminacija takvih genotipova provodi se sanitarnom selekcijom, koja je uz genetsku selekciju jednakovažna komponenta klonske selekcije. Ako među genotipovima koji imaju neka dobra gospodarska svojstva ima onih koji su zaraženi virusima, može se pristupiti biotehnološkim metodama njihova ozdravljivanja (termoterapija, kultura tkiva). Ove metode su ponekad skupe, pa dobra gospodarska svojstva i potencijal genotipa mora opravdati njihovu primjenu. Ozdravljivanju nekom od biotehnoloških metoda može se pristupiti i u slučaju očuvanja starih sorata koje su na granici izumiranja, što je čest slučaj kod hrvatskih autohtonih sorata. Klonska selekcija Genetska selekcija Sanitarna selekcija Eliminacija genotipova zaraženih virusima, ili njihovo ozdravljivanje Odabir genotipova pozitivnih svojstava 35 Princip izolacije DNA Priprema za izolaciju nakon sakupljanja i čuvanja uzoraka može se odvijati na dva načina: Sušenje lisnog tkiva odvija se u vakuumu u uređaju koji se zove liofilizator (Slika 52.), a traje od jednog do nekoliko dana. Sušenje u vakuumu sprečava degradaciju DNA čime se postiže visoka koncentracija uzorka DNA nakon izolacije. Suhi uzorak se samelje u fini prah (Slika 53.) koji se inkubira u izolacijskom puferu, ovisno o daljnjem protokolu izolacije. Drugi način pripreme uzoraka je njihovo tretiranje tekućim dušikom koji prilikom isparavanja ima temperaturu od -196ºC na kojoj se tkivo trenutno smrzne i moguće ga je lagano zdrobiti. Slika 51. Čuvanje uzoraka lista na temp. od -80ºC (Foto: S. Bolarić) Sakupljanje uzoraka i čuvanje na -80ºC Liofilizacija Mljevenje suhog lista Protokol izolacije Tretiranje tekućim dušikom Usitnjavanje smrznutog tkiva Protokol izolacije Slika 52. Liofilizator (Foto: S. Bolarić) Slika 53. Uređaj za mljevenje suhog lista (Foto: S. Bolarić) 36 Slika 54: Osnovni princip izolacije DNA Slika 55. Inkubacija uzoraka u izolacijskom puferu (Foto: S. Bolarić) Osnovni princip izolacije DNA (Slila 54.): 1. inkubacija u izolacijskom puferu (deterđent - CTAB, DTAB i dr.) (Slika 55.) 2. odvajanje DNA od ostalih komponenti (proteini, RNA, polifenoli i polisaharidi) 3. daljnje ispiranje DNA u alkoholu 4. resuspendiranje u puferu i provjera čistoće i koncentracije DNA 5. čuvanje uzorka DNA na -20 ºC 37 Uvod u molekularne markere Molekularni markeri: proteini, enzimi ili dijelovi kromosoma (fragmenti DNA) koji su specifični za neki genotip i imaju specifičnu mobilnost u električnom polju. Još 1970ih godina su se razvile tehnologije molekularnih markera koje se baziraju na proteinima i na DNA, ali bez njenog umnažanja u lančanoj reakciji polimeraze (PCR - Polymerase Chain Reaction). Izoenzimi: • Izolacija proteina (ne DNA) • Elektroforeza proteina - razdvajanje proteina prema veličini u električnom polju • Ova metoda se napušta jer postoje nove metode zasnovane na PCR-u koje su jednostavnije, informativnije i preciznije RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • Potrebna je veća količina DNA (jer nema PCR amplifikacije) koja se tretira DNA endonukleazama koje cijepaju lanac DNA • Elektroforezom se u gelu razdvajaju fragmenti - dobiva se neprekidan “razmaz” koji sam po sebi ne nosi korisnu informaciju • U gelu se u postupku “southern blot” označuju pojedini fragmenti, i to pomoću specifičnih radioaktivno označenih proba koje se “lijepe” na njima komplementarne fragmente u gelu • Tako označen gel se vizualizira radiogramski - rendgenska slika Molekularni markeri Ne zasnivaju se na PCR-u Zasnivaju se na PCR-u Proteinski markeri: izoenzimi DNA markeri: RFLP Svi su DNA markeri: RAPD, SSR, ISSR i dr. 40 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) Kod ove metode umnažamo (amplificiramo) fragmente DNA, i to randomizirano, ''napamet'', i nije nam unaprijed poznato koliko ćemo fragmenata dobiti, koje su oni dužine..., i da li ćemo ih uopće dobiti. Kod različitih uzoraka (genotipova) dolazi do amplifikacije DNA na različitim mjestima pri čemu nastaju fragmenti različitih dužina koji u elektroforezi prevaljuju različite putove. Ovo je primjer slike koja nastaje primjenom RAPDa, a slična je i za ISSR i AFLP • Manja količina DNA se amplificira PCR reakcijom • Početnice su nespecifične, slučajno odabrane, što znači da amplificiraju nepoznatu regiju DNA • Elektroforeza produkata na agaroznom gelu (Slika 58.) • Bojanje gela u ethidium bromidu, vizualizacija fregmenata preko UV transiluminatora (Slika 59. i 60.) i očitavanje fotogrefije (Slika 61.). Slika 59. Namještanje agaroznog gela na UV transiluminator (Foto: A. Vokurka) Slika 61 Izgled gela sa RAPD markerima nakon elektroforeze, bojanja i osvjetljivanja UV svjetlom. Zvjezdicama su označeni genotipovi koji imaju pojedine specifične markere ** * * * Slika 60. Priprema za fotografiranje Polaroid kamerom (Foto: A. Vokurka) 41 SSR (Simple Sequence Repeats) Ovom metodom se amplificira tzv. mikrosatelitska DNA . Primjer mikrosatelitske DNA jest npr AGAGAGAGAGAGAGAG... ili ATATATAT... n puta, pri čemu je n=50 - 150, što se označava kao (AG)n ili (AT)n. Mikrosatelitska regija ima 100 do 300 baza. Za pojedine mikrosatelite potrebno je unaprijed dizajnirati početnice koji će nalijegati neposredno uz mikrosatelit i omogućiti amplifikaciju samog mikrosatelita. Dizajniranje početnica je poseban postupak koji se zasniva na određivanju slijeda baza u DNA (sekvencioniranje). ACTCGGGCTTTTAATGGCATATATATATAT... Početnica: TGAGCCCGAAAATTACCG Mikrosatelitska regija kod diploidnih organizama može biti istovjetna na oba kromosoma (AA ili aa = dominantni ili recesivni homozigot), ili različita (heterozigot = na jednom kromosomu A što predstavlja duži lanac, a na drugom kromosomu a, ili kraći lanac). Varijabilnost se detektira na osnovu dužine mikrosatelita: sorte se razlikuju u broju parova mikrosatelitskih baza, a mogu biti heterozigoti ili homozigoti - pomoću ove činjenice moguće je dokazivanje očinstva Na donjoj shemi vide se tri uzorka, prvi je dominantni homozigot (AA), zatim heterozigot (Aa), i zadnji je recesivni homozigot (aa). U elektroforezi kraci lanac (142 baze) prevaljuje duži put u el. polju, dok duži lanac (144 baze) u istom vremenu prevaljuje kraći put. Heterozigot (Aa) sadrži oba lanca, duži i kraći, što se vidi na gelu nakon razdvajanja fragmenata. • Manja količina izolirane DNA se amplificira u PCRu • Početnice su specifične, amplificiraju regiju mikrosatelita • Elektroforeza produkata na poliakrilamidnom gelu, ili na sintetskom Spreadex gelu • Bojanje gela Sybr-gold ili Sybr-green bojama i vizualizacija fregmenata preko UV transiluminatora AA - homozigot 144/144 Aa - heterozigot 144/142 aa - homozigot 142/142 __ __ __ __ Sm jer u el. polju 144 bp 142 bp Slika 62: Analiza mikrosatelita (SSR) i princip određivanja roditeljskih veza A a A A a a SSR regija 42 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) U metodi se koriste primeri koji naliježu na mikrosatelitsku regiju, dakle za razliku od mikrosatelita, ne amplificiraju se mikrosateliti, nego regije DNA između mikrosatelita, dok mikrosatelitska regija služi kao ''sidro'' za primer. Dobiva se slika slična RAPDu. AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) Ova metoda je nešto zahtjevnija jer se izolirana DNA prvo tretira restrikcijskim enzimima (MseI i EcoRI su najčešći) - nastaje čitav niz fragmenata nepoznatih slijedova na čije krajeve se ''nakače'' adapteri poznatog slijeda. Adapteri su potrebni jer je njihov slijed poznat, a svrha im je da se na osnovu adaptera u reakciji koriste homologni primeri koji na njih nalijegnu, i od kojih dalje kreće amplifikacija pojedinih fragmenata. • Zahtjeva DNA velike čistoće i nefragmentiranu • DNA se prvo tretira restrikcijskim endonukleazama, npr. MseI i EcoRI, ali postoje i druge • Pomoću specijalnih adaptera amplificira se zona neposredno uz područje djelovanja endonukleaze tako da početnice prepoznaju adapter • Vertikalna elektroforeza u poliakrilamidnom gelu • Početnice su označene radioaktivno (radiogramska vizualizacija), ili se poliakrilamidni gel boji u srebrnom nitratu Da li fragmenti (''crtice'' ili markeri) nastali u PCRu predstavljaju i pojedina svojstva? Odgovor je i DA i NE, ali ipak najčešće ne. Naime, svojstva ili fenotip kao rezultat djelovanja okoline i gena je rezultat samo jednog malenog dijela genoma koji predstavlja gene i koji se transkribira u proteine. Najveći dio genoma ne predstavlja gene, nego ima neku drugu funkciju, za sada nepoznatu (to je evolucijski zaostatak DNA, i moguće je da takva DNA koja se ne transkribira ima ulogu u npr. strukturi kromosoma i dijeljenju stanica). Ipak, jedna ''crtica'' u gelu može predstavljati svojstvo u slučajevima kad se amplificirana regija nalazi u zoni dijela DNA koji predstavlja gen, ili ako je dovoljno blizu njega tako da crossing- overom ne dolazi do razdvajanja (vezana svojstva). Takvi markeri su iznimno važni u oplemenjivanju bilja, naročito u višegodišnjih vrsta, jer omogućuju brži oplemenjivački rad i brže izdvajanje pojedinih genotipova samo na osnovu DNA analize. Zašto su ipak važni i ostali fragmenti koji nužno ne predstavljaju svojstva? Važni su zbog toga što služe kao ''osobna karte'' ili ''fingerprint'' svakog pojedinog genotipa na osnovu kojih se obavlja identifikacija sorata - važno je u kontroli sadnog materijala i u rasadničarstvu. Mogu poslužiti i u oplemenjivačke svrhe za procjenu genetskih sličnosti i različitosti pojedinih populacija, što može biti važno prilikom odabira roditelja. Molekularni markeri se koriste i za stvaranje genskih mapa.