DNA-Analytik, Zusammenfassungen von Analytik

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DNA-Analytik

SS 2013

Dr. Holger Klapproth

3. Vorlesungsstunde: Die Geheimnisse der PCR 5´ 2´ O OH N HN O O P O OH O HO P O P OH O OH O N N H 2 N Guanin

Was brauche ich zur PCR

• Eine DNA-Vorlage := Template
• Zwei kurze DNA Abschnitte, die an das Template binden := Primer
• Die thermostabile DNA-Polymerase
• Desoxyribonukleotidtriphosphate:= dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• Das Gerät zur Durchführung := Thermocycler

Was ist das Template?

• Das Template ist eine DNA.
• Die Template-DNA kann doppelsträngig (Normalfall) oder einzelsträngig sein.
• Die DNA sollte eine Länge von 60-5000 Nukleotiden haben.
• Besondere Enzymgemische (Long-PCR) können auch bis zu 50000 Nukleotide lange Templates amplifizieren.

Was sind Primer

• Primer sind kurze DNA-Stränge
• Die an die Template-DNA binden
• Die ca. 20 Nukleotide (nt) Länge aufweisen
• Deren Schmelzpunkt bei ca 60° C liegt
• Die Primer binden bei geeigneten Temperaturen (z.B. 60°) an je einen Template-Strang
• Bei der Extension baut die Polymerase von den Primern an den neuen DNA-Strang auf

Was sind PCR-Primerpaare

• Kurze DNA-Sonden, die an jeweils einen Strang eines DNA-Doppelstranges bei gleicher Temperatur binden, so daß der jeweilige Strang von einer Polymerase 5´-3´ verlängert werden kann und die beiden Primer maximal 5000 Basenpaare auseinander liegen
• Primerpaare haben annähernd den gleichen Tm

Prinzip der Basenpaarung

Das Geheimnis des Schmelzpunktes

• Der Schmelzpunkt einer doppelsträngigen DNA ist die Temperatur bei der 50% der DNA als Einzelsträge vorliegen!
• Berechnung der Schmelztemperaturen von DNA- Oligonukleotiden:!
• %GC-Methode:!
• tm = 81.5 - 21.59 - (675 / length) + (0. *** %GC)!**
• wobei -21.59 = 16.6 x log10 [K
  • ]!

Schmelzpunkt per Hand

• Pro A oder T: 2°C
• Pro G oder C: 4°C
• Einfach aufaddieren
• Gilt für kurze DNA-Stränge

Wie weise ich die DNA nach der PCR nach?

Interkalierende Farbstoffe

• färben Nukleinsäuren unspezifisch an
• ändern das Fluoreszenzverhalten bei Bindung an Nukleinsäuren
• Nachweisgrenzen bei ca. 10 ng - 100 fg DNA je nach Farbstoff
• kann in das Gel mit hinzugegeben werden oder aber das Gel wird nach der Elektrophorese in dem Farbstoff gebadet

Wo bekomme ich die Information über ein Gen her?

Es gibt Datenbanken mit allen

bekannten Genen.