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Klausurvorbereitung Genetik
1. Klassische Genetik und Stammbäume
Gregor Mendel: 1822-
- Mendelsche Regel: Nachkommen rezeproker Kreuzungen reiner Linien besitzen einheitlichen Phänotyp → Uniformitätsregel
- Kreuzungen der heterozygoten Nachkommen (F 1 ) zweier reinrassiger Elternlinien untereinander führen zur Aufspaltung der Phänotypen in bestimmten Zahlenverhältnis → Spaltungsregel
- Allele verteilen sich im Prinzip unabhängig voneinander und unabhängig von den Allelen anderer Gene auf die Nachkommen → Unabhängigkeitsregel
Allel : eine von zwei oder mehr alternativen Formen eines Gens, das sich am selben Genlocus zweier homologer Chromosomen befindet.
1.1. multiple Allelie
Mehrere Allele eines Merkmals vorhanden.
1.2. Kodominanz:
beide Phänotypen nebeneinander nachweisbar
1.3. Dominanz:
ein Allel überwiegt & ist für Ausprägung des Merkmals allein maßgebend ‡ Merkmalsträger geben Gen an Hälfte der Nachkommen weter ‡ Keine Bevorzugung eines bestimmten Geschlechts ‡ Unter Nachkommen merkmalsfreier Personen kein Auftreten Beispiele autosomal dominanter Krankheiten:
- Familiäre Hypercholesterinämie
- Marfan-Syndrom (lange Gliedmaßen)
- Retinoblastom
1.4. Penetranz:
Durchschlagskraft eines Gens, angegeben in Prozent der Häufigkeit
1.5. Expressivität:
Grad der phänotypischen Ausprägung eines penetranten Gens Grund für unregelmäßige Dominanz z.B. Spätmanifestation → z.B. Chorea Huntington (große Penetranz, sofern bestimmtes Alter erreicht, aber große Variabilität in Expressivität)
1.6. Pleiotropie / Polyphänie:
ein Gen für mehrere Merkmale zuständig → Marfan-Syndrom, Mukoviszidose, PKU
1.7. Rezessivität:
Phänotyp nur im homozygoten Zustand ausgeprägt (klinisch gesehen, nur wenn es zu einer äußerlich sichtbaren Fehlbildung kommt) → praktisch alle Stoffwechseldefekte Beispiel autosomal rezessiver Krankheiten:
- PKU → Schwachsinn durch gehemmte Myelinisierung
1.8. Pseudodominanz:
wenn hetereozygoter und homozygoter zusammen Kinder kriegen, ist Aufspaltungsmuster wie bei dominantem Erbgang
1.9. Heterozygotentest:
- Bestimmung der Enzymaktivität
- abgeschwächte Manifestation des Merkmals
- Belastung eines Probanden mit der abzubauenden Substanz
- gentechnologisch durch DNA-Sonden
1.10. X-chromosomale rezessive Vererbung:
- Hemizygotie : beim Mann gibt es bei X-chromosomaler Vererbung weder Hetero- noch Homozygotie → Hemizygotie Erkennung X-chromosomal rezessiver Erbgänge:
- hemizygoter Mann bekommt mit homozygot gesunder Frau nur gesunde Söhne, und alle Töchter sind Konduktorinnen
- Konduktorinnen (mit gesundem Mann) übertragen das kranke Gen auf die Hälfte ihrer Kinder → Hälfte der Söhne krank & Hälfte der Töchter Konduktorinnen
- Homozygotie bei Frauen, wenn hemizygoter Vater mit heterozygoter Mutter
- homozygote Frau mit gesundem Mann hat nur kranke Söhne und Konduktorinnen als Töchter
- hemizygoter Mann mit homozygoter Frau → nur befallene Kinder Beispiel: Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Defekt
1.11. X-chromosomal dominate Vererbung:
- bei Frauen doppelt so häufig wie bei Frauen Erkennung X-chromosomal dominanter Erbgänge:
- Söhne befallener Männer sind merkmalsfrei, alle Töchter krank
- hetrozygot erkrankte Frauen haben zur Hälfte kranke Kinder (unabhängig vom Geschlecht)
- Elternteile beide krank → alle Töchter krank, Hälfte der Söhne krank
- bei homozygot erkrankter Mutter → alle Kinder krank, egal ob Vater hemizygot oder nicht Kranke Männer sind i.a. schwerer betroffen. Beispiel: VitaminD-resistente hypophosphatämische Rachitis (Phosphatdiabetis)
1.12. Mitochondriale Vererbung
Mitochondrien schwimmen nicht einfach so in der Zelle rum, sie sind an das Cytoskelett assoziiert, aber trotzdem noch flexibel beweglich. Mitochondriale DNA 37 Gene → 22 tRNAs, 2rRNAs, 13 polyadenylierte Transkripte für die oxidative Phosphorylierung (größerer Anteil der Untereinheiten ist nukleär kodiert). bei menschlichen Mitos keine Introns (bei Hefe schon) → sehr kompakt, veränderter genetischer Code D-loop : in vielen Vertebratenzellen ein Dreistrangabschnitt, Replikationsstart Es gibt nur einen Promotor (bei Hefe hat jedes Gen eigenen Promotor) Größe: Mensch: ~17kb
Genkarten werden erstellt, indem man Bakterien gegenseitig ihr Genom übertragen lässt und sie dabei unterbricht. Die Einheit einer Genkarte ist die Minute (Genkarte von E. coli hat 100 Minuten).
2.2. Erkennung & Isolierung von Bakterien-Mutanten:
Züchtung der Bakterienkultur auf Vollmedium → Abdruck mit Samtstempel → Inkubation auf Minimalmedium → Mutante fehlt & kann auf dem Vollmedium (wegen Stempel) wiedergefunden werden. Prototroph : Bakterien, die benötigte Stoffe herstellen können Auxotroph : Mutanten, denen bestimmter Syntheseschritt fehlt
2.3. Erstellung von Genkarten durch Konjugation:
Gibt Donor- & Rezipientzelle; Donor hat F-Plasmid (fertility), das als DNA-Ring isoliert vorliegen kann (können bis zu 3 Plasmide enthalten) → Entstehung von Hfr-Zellen („high frequency of recombination“), die das F-Plasmid in ihr Hauptchromosom integriert haben. F- Plasmid enthält auch Gene für Aufbau des Sex-Pilus. Bei dem Transfer wird jeweils nur ein Strang der DNA übertragen, gleichzeitig wird sowohl bei Donor als auch bei Rezipient der jeweils andere Strang repliziert. F’-Plasmid sind ehemals integrierte Plasmide, die wieder rausgeschnitten (exzisiert) worden. Dabei können benachbarte Gene mitrausgeschnitten worden sein bzw. Gene des ursprünglichen F-Plasmids vergessen worden sein → verändertes F’-Plasmid. Wenn diese F’- Plasmide übertragen werden, sind Rezipienten in Bezug auf Hauptchromosomale F’-Gene diploid → können auch heterozygot sein. Diese partiell diploiden Stämme nennt man Merodipoide oder Heterogenote. Wenn man nun die Konjugation zu verschiedenen Zeitpunkten unterbricht, so kann man die Reihenfolge der Gene bestimmen, die unmittelbar hinter der Insertionsstelle des F-Plasmids liegen. Um das vollständige Bakteriengenom zu kartieren, muss man unterschiedliche Hfr- Stämme nehmen, die das F-Plasmid jeweils an verschiedenen Stellen einbauen. Methode der unterbrochenen Konjugation ist aber ungenau. Analyse der Rekombinationshäufigkeit oder Methode der Transduktion genauer.
Episomen : DNA-Strukturen, die sowohl in Hauptchromosom integriert als auch isoliert sein können → Plasmide.
2.4. Genkartierung durch Transduktion:
Transduktion beschreibt den Vorgang, dass Bakteriophagen genetisches Material von einer Wirtszelle auf eine andere übertragen können. Der Abschnitt des Wirtsgenoms, der dabei übertragen wird, ist so lang, wie das Phagengenom. Zur Genkartierung benutzt man meist das Prinzip der Cotransduktion : Wie häufig wird Marker1 mit Marker2 übertragen? Wenn sehr oft, liegen die beiden Marker nah beieinander im Wirtsgenom. Die Cotransduktionsfrequenz steht also in einer Beziehung zum Abstand der beiden Markergene abhängig von der Länge des Phagengenoms.
Genetische Karten geben meist die Reihenfolge der Gene an, aber nicht deren genaue Länge und den genauen Abstand zwischen den verschiedenen Genen. → Genetische & physikalische Karten sind zwar colinear, aber nicht kongruent.
3. Untersuchungen an komplexen Genomen wie dem des
Menschen
Zunächst muss erkannt werden, auf welchem Chromosom sich das Gen befindet. Zuordnung von Genen zu ihren Chromosomen erfolgt über in-situ-Hybridisierung oder über Herstellung von Fusionszellen.
3.1. In-situ-Hybridisierung:
Durch Renaturierung komplementärer DNA-Stränge. Dabei liegt einer de Stränge im Chromosom (in situ) vor, der andere als DNA-Sonde, die i.a. radioaktiv markiert ist. Dabei wird die DNA denaturiert, die DNA-Sonden eingeführt und dann wieder renaturiert. Radioaktiv ist aber nicht so genau → Fluoresenz-In-situ-Hybridisierung (FISH). FISH hat eine höhere Auflösung.
3.2. Zell-Fusion:
Es gibt Stoffe, die die Verschmelzung von Membranen benachbarter Zellen fördern. Dabei entstehen zunächst Zellen mit 2 Kernen. Bei der nächsten Mitose vermischen sich die Chromosomen und gelangen am Ende der Mitose in einen Kern. Bei allen darauffolgenden Mitosen gehen „überschüssige“ Chromosomen verloren, weil z.B. Menschzellzyklus gegenüber Mauszellzyklus verzögert ist. Meist fusioniert man menschliche Lymphozyten mit mauslichen Fibroblasten. Dann muss man dafür sorgen, dass die Vermehrung der Eltern- Zellarten unterdrückt wird. Wenn man nun guckt, welche Merkmale in der Hybrid-Zelle übriggeblieben sind und welche Chromosomen, so kann man die Gene für diese Merkmale auf den entsprechenden Chromosomen lokalisieren.
3.3. Bestrahlungs-Hybridzellen:
Dabei wird das menschliche Chromosom in Bruchstücke „gestrahlt“, und man guckt dann anschließend, wie häufig zwei Gen-Orte zusammen auf einem Stück liegen. Hybrid-Zellen werden dabei mit Röntgenstrahlen beschossen, das hat zur Folge, dass die Zelle stirbt. Um die DNA-Fragmente zu retten, werden die Zellen mit lebendigen Mauszellen fusioniert. Dort werden dann die DNA-Fragmente in das Genom eingebaut.
3.4. Erstellung biologischer Genkarten:
Einheit hier ist centiMorgan. Die Nukleotid-Sequenzen einzelner Humangenome unterscheiden sich in den nicht-kodierenden Regionen stärker → Sequenzpolymorphismus. Je größer der Sequenzpolymorphismus, desto informativer für Kopplungsanalyse. 2 Methoden: Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) & Mikrosatelliten- Polymorphismus
3.5. Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP):
Dabei wird die DNA mit Restriktionsenzymen behandelt. Durch die Sequenzpolymorphismen wird die DNA bei verschiedenen Personen in unterschiedlich viele Fragmente geteilt, weil Restriktionserkennungsstellen entstehen können. Da diese Sequenz-Polymorphismen nach den Mendelschen Regeln vererbt werden, kann man die Kopplung ermitteln. Je öfter zwei Marker zusammenbleiben, desto enger sind sie gekoppelt.
3.6. Mikrosatelliten-Polymorphismus:
Mikrosatelliten-DNA besteht aus Kopien von 1-6 Basenpaaren. AC-Dinucleotide kommen sehr häufig vor und viel vor oder hinter Genabschnitten. Zwei Allele unterscheiden sich mit
5.3. Lambda-DNA als Vektor (mit Phagen)
- Die Fremd-DNA wird vorsichtig duch Restriktions-Nukleasen in lange Fragmente (10 - 20kb)geschnitten.
- Die lineare Lambda-DNA wird so prepariert, dass nur noch die Enden (cos- Elemente) übrigbleiben und anschließend mit den Fremd-DNA-Stücken vereinigt.
- Verpackung der DNA in Phagen-Partikel.
- Auf Bakterien-Nährböden werden die Phagen ausgesetzt. Wenn eine Phage ein Bakterium infiziert, so bilden sich dort ganz viele Phagen mit genau der gleichen DNA → Phagen-Plaques. Das ermöglicht eine leichte Auftrennung der Phagen nach der eingeschleusten Fremd-DNA.
5.4. Cosmide als Vektoren
Haben die Vorteile von Plasmiden → Einfache Handhabung und die Vorteile von Lambda- Vektoren → Möglichkeit des Einschleusens von langer Fremd-DNA. Cosmide sind Plasmide, die die Cos-Elemente von der Lambda-DNA besitzen. Es können DNA-Fragmente von 40-50kb eingebaut werden. Der Vektor wird anschließend in Phagen- Partikel gepackt, und dann werden Bakterien damit infiziert und können sich auf Nährböden vermehren.
5.5. YACs
YAC = yeast artificial chromosome; Hierbei werden Vektoren genommen, die Elemente enthalten, die für die spätere Replikation und Mitose in Hefezellen unentbehrlich sind. In diese Vektoren wird die Fremd-DNA, die diesmal sehr sehr vorsichtig geschnitten wurde → ~100 kb, eingesetzt. Zusätzlich wird der Vektor linearisiert, indem ihm ein Teil rausgeschnitten wird. So kann die DNA als Chromosom in eine Hefezelle eingesetzt werden und wird dort wie auch alle natürlichen Chromosomen bei der Mitose repliziert und an die Tochterzellen weitergegeben. YACs werden besonders gern bei der Untersuchung des menschlichen Genoms verwendet.
5.6. cDNA-Bibliotheken
Mit Hilfe von reverser Transkriptase wird mRNA in DNA umgeschrieben → cDNA. Diese kann dann auch wieder in Plasmide oder Lambda-Vektoren eingeschleust werden. Man kann so die Genaktivität von Zellen beobachten.
5.7. Sequenzieren nach dem Kettenabbruch-Verfahren von Sanger
Es wird zunächst einsträngige Ring-DNA erzeugt, die mit der Hilfe von einem Primer angefangen wird zu replizieren. Die Replikation wird aber immer abgebrochen, weil zu den normalen Nukleotiden außerdem Dideoxynukleotide gegeben werden, die nicht mehr verlängert werden können. Dadurch entstehen DNA-Ketten verschiedener Längen, die dann in der Gelelektrophorese verglichen werden können.
6. Physical Mapping
Physikalische Karte : Beschreibung der Nukleotidsequenz, Einheit ist hier bp oder kb. Erfolgt meist über 2 Wege: Aneinanderreihung von Restriktionsfragmenten und eine lineare Ordnung von klonierten DNA-Fragmenten.
6.1. Ordnung klonierter DNA:
Man nennt eine Reihe von DNA-Klonen aus Klon-Bibliotheken, die einen definierten Abschnitt eines Chromosoms darstellen Contig. Diese erhält man, indem man sich einen oder
mehrer Klone als Sonden nimmt, damit den nächst benachbarten Klon findet, der dann wiederum als Sonde zur Identifizierung des nächsten Klons dient. Dabei gibt es 2 Methoden:
- Fingerprint-Methode : Herstellung von DNA-Fragmenten mit häufig schneidenden Nucleasen → Muster in Gelelektrophorese; Überprüfung, ob in anderen Klonen auch Elemente dieses Muster auftauchen.
- Vohandensein spezifischer Einzelkopie-DNA-Sequenzen : mit Hilfe von ESTs und STSs und PCR
snRNP : “small nuclear ribonucleoprotein”, binden an wachsende RNA-Ketten bei der Transkription und verrichten Spleißarbeit. Enthalten RNA-Komponenten, die man snRNAs nennt.
Kleine Arme des Chromosoms werden mit p, große mit q bezeichnet.
Satelliten-DNA : repetetive DNA-Elemente, die in der Centromer-Gegend liegen.
Heterochromatin : Chromatin, das sich meist nicht vollständig entpackt. Meist genleer (in Centromerregionen).
6.2. Radiation hybrid mapping
Schon oben bei Gene-Mapping beschrieben. Dienen wie die Klon-Bibliotheken.
7. Positionelles Klonen (positional cloning)
→ Identifizierung von Genen, deren Produkte man nicht kennt und deren Wirkungsweise man nur am Phänotyp / Auftreten von Krankheiten erkennen kann.
Die jeweiligen Schritte sind vom bestimmten Gen abhängig, diese werden aber grundsätzlich eingehalten:
- Durch Kopplungsanalysen wird das Gen auf der Gen-Karte lokalisiert.
- DNA-Marker, die möglichst auf beiden Seiten des Gens liegen, werden identifiziert.
- Die DNA-zwischen diesen Markern wird aus einer Genom-Bibliothek isoliert. Das Gen muss ja da drauf liegen!
- Vergleich des Gens mit dem eines gesunden Menschen. 8. Genetik & Statistik
8.1. Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
Bedingungen dafür (Mendel-Population):
- Alle Organismen sind diploid.
- Sie pflanzen sich sexuell fort.
- Keine Beschränkung in der Fortpflanzungsfähigkeit
- Mendelsche Regeln gelten.
- Möglichst große Population (am besten unendlich groß)
Hardy-Weinberg-Regel : In einer Mendel-Population bleiben Allelenfrequenz (Häufigkeit, mit der Allel in Population vorkommt) und Allelenverteilung in aufeinanderfolgenden Generationen gleich. Sei p die Allelfrequenz von Allel A, q die von Allel a. In der Elterngeneration gilt: p + q = 1
Im Beispiel in der Vorlesung waren die beiden Möglichkeiten der Kopplung gleichwahrscheinlich (man wusste die Phasenverteilung nicht), deshalb: L(Θ) = 0.5 Θr^ + 0.5 (1 - Θ)r, wobei Θ die Rekombinationsrate, r die Anzahl der rekombinierten. Mit Hilfe der Maximum- Likelihood-Estimation gucke ich nun, welches der Θ am wahrscheinlichsten ist.
8.7. Maximum-Likelihood-Estimation
Sei Θ die Rekombinationsrate. Ich möchte nun herausfinden, wie wahrscheinlich meine Beobachtungen (der Stammbaum!) sind bei einem gegebenen Θ bzw. L(Θ). Der lod score ist dann folgendermaßen definiert: Lod = Z(Θ) = log(L(Θ) / L(0.5)). Nun muss ich diesen Ausdruck auf dem Intervall [0, 1] maximieren. Bekomme ich als Maximum einen Wert > 3 heraus, gilt die Kopplung als sicher. Bei einem Wert < -2 gilt die Nicht-Kopplung als sicher. Der Vorteil der lod-scores ist, dass sie über Familien summiert werden können.
9. Molekulare Pathologien
Wie führt eine genetische Veränderung zu einer Pathologie?
- Loss of function bzw. gain of function
- Dosage effects
- Dominant-negative Effekte
9.1. Chromosomale Pathologien
Numerische Anomalien = Aneuploidie; Beispiele dafür sind die Trisomie und die Monosomie.
9.2. Strukturelle Pathologien
Jene sind:
- Brüche
- Inter- und Intrachromosomale Rearrangements (Translokationen)
- Punktmutationen, die zu folgendem führen können o Nonsense → Erzeugung eines Stop-Codons o Missense → dabei entsteht eine veränderte Aminosäuresequenz o Frameshift
- Kleine Insertionen oder Deletionen
- Speißeffekte: Mutationen in Introns, die das Spleißen beeinflussen
- Promotormutationen können Effekte auf das Expressionslevel, die Expressionszeit als auch auf den Ort der Expression haben.
9.3. Dominant-negativer Effekt
Beispiel: Huntington Bei Huntington werden G-Repeats in die DNA eingebaut. Das dadurch veränderte Protein verdrängt das normale.
10. Location scores
Gemeinsame Likelihood von Markern und einem Krankheitsgen in Abhängigkeit der genetischen Distanz: d = -0,5 ln(1 - 2Θ)
Location scores dienen der Anordnung mehrerer Gene / Marker.tg
11. Assoziation
Identical by descent (IBD) = haben gleiches Allel, weil sie es von der gleichen Person geerbt haben. Identical by state (IBS) = haben gleiches Allel, aber jeder von einem anderen Elternteil bekommen.
**_12. Polygene Modelle
- Praktikum – Stammbaumanalyse
- comparative Genomics_**
14.1. HOX-Gene
