Análisis del perfil de proteínas extraídas desde procariotas y eucariotas mediante electroforesis denaturante en geles de poliacredamida (SDS-PAGE), Guías, Proyectos, Investigaciones de Biología Celular
trinidad-curtze-laja
trinidad-curtze-laja

Análisis del perfil de proteínas extraídas desde procariotas y eucariotas mediante electroforesis denaturante en geles de poliacredamida (SDS-PAGE), Guías, Proyectos, Investigaciones de Biología Celular

PDF (648 KB)
13 páginas
2Número de descargas
52Número de visitas
Descripción
En el siguiente práctico se realizó una extracción de proteínas desde células eucariotas y procariotas: hígado de pollo, Escherichia coli E. (Enterobacteriaceae ) y hojas. Posterior a esta extracción, las muestras fuer...
20 Puntos
Puntos necesarios para descargar
este documento
Descarga el documento
Vista previa3 páginas / 13
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 13 páginas totales
Descarga el documento
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 13 páginas totales
Descarga el documento
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 13 páginas totales
Descarga el documento
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 13 páginas totales
Descarga el documento

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

ANÁLISIS DEL PERFIL DE PROTEÍNAS EXTRAÍDAS DESDE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS MEDIANTE ELECTROFORESIS DENATURANTE EN GELES DE

POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) Laboratorio de Biología Celular II

Trinidad Curtze

Josefa Divasto

Profesor: Dr. Daniel Laporte

Ayudante: Axel Navarrete

Viernes 6 de octubre del 2017

Introducción

Las biomoléculas, es decir, proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos son las

moléculas que constituyen a los seres vivos. Sin embargo, las más importantes por

excelencia corresponden a las proteínas, macromoléculas compuestas por cadenas de

aminoácidos, formados por un carbono central que enlaza a un hidrógeno, una cadena

lateral que le entrega la naturaleza al monómero, un grupo amino y un grupo carboxilo.​(1) La

importancia de estas recae en la cantidad de procesos celulares en las que participa; formar

parte de la estructura de la piel y los huesos en el caso del colágeno, de transporte en el

plasma en el caso de la albúmina, enzimática en el caso de la rubisco, etc, por lo que su

estudio se hace primordial en diversos campos de las ciencias biológicas y químicas.

Para poder llevar a cabo el estudio de estas macromoléculas se pueden ocupar diversos

métodos como electroforesis y cuantificación por Bradford. La primera corresponde a una

técnica de separación, donde el extracto proteico es depositado en un gel, que puede ser de

poliacrilamida o agarosa, el cual se somete a la acción de un campo eléctrico. Las proteínas

antes de entrar al gel son tratadas con agentes químicos como el SDS, desnaturandolas y

concediéndoles carga, lo que se traduce en una migración de las mismas cuando el campo

eléctrico es encendido. En el caso particular de la electroforesis en gel denaturante de

poliacrilamida, las proteínas tienen una relación carga/masa similar a uno, por lo que, al

comparar la migración, o cuánto avanzó cierta proteína del extracto, en relación a un

estándar comercial, es posible calcular el peso de la proteína y de esta forma, inferir acerca

de su identidad.​(2)

Por otro lado, el segundo método se basa en la unión del colorante hidrofóbico azul brillante

de Coomassie G-250 con los residuos, también hidrofóbicos, de arginina, fenilalanina,

triptófano, tirosina e histidina, pasando de un color café a uno azul. La concentración

proteica puede ser evaluada determinando la cantidad de colorante y midiendo la

absorbancia de la solución a 595 nm en un espectrofotómetro.​(3)

En el siguiente práctico se realizó una extracción de proteínas desde células eucariotas y

procariotas: hígado de pollo, ​Escherichia coli E. (​ Enterobacteriaceae​) y hojas. Posterior a

esta extracción, las muestras fueron sometidas a una electroforesis en gel de poliacrilamida

y a una cuantificación por Bradford, donde la mayor concentración de proteínas deberá

proceder del tejido hepático producto de la alta función metabólica de este.

Objetivos - ​General: ​Visualizar las diferencias entre las concentraciones proteicas de origen

eucariota (hígado de pollo en célula animal y tejido foliar de hojas en célula vegetal)

y procariota (E. ​coli​ en bacteria).

- ​Específicos: ​Determinar la concentración de proteínas de diferente origen mediante el uso de cuantificación por método de Bradford. Separar y observar el

bandeo obtenido en diferentes muestras proteicas mediante electroforesis

denaturante.

Materiales y métodos

1. Extracción de proteínas 1.1 Extracción de proteínas desde planta Se masaron 100 mg de tejido foliar, los cuales fueron depositados en un mortero

previamente congelado con nitrógeno líquido. Posteriormente, se vertió nitrógeno líquido a

la muestra y se pulverizó con la ayuda de un pistilo con el fin de obtener un polvo. A éste se

le agregó 1,6 mL de buffer de extracción (Tris-HCL 50 mM, pH 7.5, 5 mM de

b-mercaptoetanol y 0.01% de PMSF).

Una vez homogeneizada la muestra en buffer, se transfirió a un tubo Eppendorf y se

centrifugó (​Hettich Mikro 22R​) a 5500 rpm durante 5 minutos a 4°C. Por último, se recuperó

el sobrenadante proteico.

1.2 Extracción de proteínas desde bacterias Se raspo con una espátula el contenido bacteriano de un tubo falcon previamente

entregado, el cual contenía una concentración de 1x108 de E​. coli​ , y se depositó en un

mortero congelado con nitrógeno líquido. Con la ayuda de un pistilo se trituró ​la muestra y se le añadió ​1 mL de buffer de extracción (Tris-HCL 50 mM, pH 7.5, 5 mM de b-mercaptoetanol y 0.01% de PMSF). Se extrajeron 400 μL del homogeneizado obtenido,

los cuales fueron transferidos a un tubo Eppendorf y agitados en el vortex ​a velocidad máxima durante 5 minutos. La mezcla fue centrifugada a 5500 rpm durante 5 min a 4°C.

Finalmente se recuperó el sobrenadante proteico en un tubo Eppendorf nuevo y se descartó

el pellet en solución de hipoclorito de sodio.

1.3 Extracción de proteínas desde hígado de pollo Se masaron 500 mg de hígado de pollo. La muestra fue depositada en un potter de vidrio,

se trituró y homogeneizó junto con 5 mL de buffer de extracción (Tris-HCL 50 mM, pH 7.5, 5

mM de b-mercaptoetanol y 0.01% de PMSF). Se recuperó 1 mL de la mezcla obtenida y se

transfirió a un tubo Eppendorf. Se centrifugó a 5500 rpm durante 5 min a 4°C. Luego, se

recuperó el sobrenadante proteico y se descartó el pellet.

2. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Se prepararon seis tubos Eppendorf con 1 mL de reactivo de Bradford cada uno. Se le

añadieron 2, 4, 8, 12 y 20 μL de seroalbúmina bovina (BSA) a los tubos, del 1 al 6,

respectivamente. Se homogeneizaron por inversión y se dejaron reaccionar a temperatura

ambiente. Simultáneamente, se prepararon diluciones de los sobrenadantes proteicos de

bacteria e hígado de pollo con buffer de extracción a una razón de 1:10. Posteriormente, se

extrajeron 4 μL de las diluciones de bacteria e hígado de pollo y se introdujeron en un tubo

Eppendorf con 1 mL de Bradford. Con respecto a la muestra proteica de tejido foliar, se

ocupó un nuevo sobrenadante preparado por el profesor ya que no se obtuvo lo suficiente

de la muestra original. De este se tomaron 10 μL y se añadieron en un nuevo tubo

Eppendorf que contenía 1 mL de Bradford. Se homogeneizó.

Finalmente, 100 μL de cada una de las muestras fueron introducidos dos veces, en

diferentes pocillos, en una placa microtiter y luego se se midió la absorbancia a 595 nm en

un espectrofotómetro (Thermo Spectronic Genesys 5).

Los datos de absorbancia obtenidos más las concentraciones de BSA fueron utilizados para

realizar ​la curva de calibración con la que se calculó la concentración de cada extracto proteico.

3. Preparación de proteínas para SDS-PAGE En tres tubos Eppendorf se colocaron 7,1 μg/μL, 3,3 μg/μL y 10 μg/μL de extracto proteico

de tejido hepático, bacteria y tejido foliar, respectivamente. Se les añadió agua destilada,

con la ayuda de una micropipeta, hasta que cada tubo llegará a los 10 μL. Luego se

agregaron 10 uL de buffer de extracción por tubo. Estos fueron calentados a 90°C por 5

minutos (baño termorregulado Memmet). Finalmente se extrajeron 15 μL de los tubos y

fueron cargados en los pocillos del gel.

4. Preparación del gel de poliacrilamida Se prepararon 5 mL de gel separador al 8% con los siguientes reactivos:

2,3 mL de agua destilada; 1,3 mL de solución acrilamida-bisacrilamida (30%-0.8%); 1,3 mL

de tampón Tris-HCl 1,5 M; 50 uL de SDS 10%; 50 μL de persulfato de amonio al 10% y 3 μL

de TEMED. Estos reactivos fueron puestos entre placas de vidrio, ocupando ⅘ del volumen

total entre estas, y se esperó a que solidificase. Finalmente se puso un poco de etanol. En

segunda parte se prepararon 2 mL de gel concentrador al 5% con los siguientes reactivos:

1,4 mL de agua destilada; 330 μL de solución de acrilamida-bisacrilamida (30%-0.8%); 25

μL de tampón Tris-HCl 0.5 M pH= 8.8); 20 μL de SDS 10%; 20 μL de persulfato de amonio

al 10% y 2μL de TEMED. Finalmente se llenaron las placas de vidrio y se esperó a que se

solidificase.

Por último, se prepararon 800 mL de tampón de electroforesis mezclando 2,4 gr Tris; 11,6 g

de glicina en 760 mL de agua destilada y se agregó 8 mL de SDS. Luego se tomaron

alícuotas de 5 y 10 μL y se depositaron en los distintos pocillos del gel, más tarde se realizó

una electroforesis a 120 Volts. Finalmente se desmontaron los vidrios y se incubó el gel en

solución de tinción durante toda la tarde, para una posterior decoloración al dia siguiente. ​(4)

Resultados

1. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford Para determinar la concentración de los extractos proteicos se utilizó una curva de

calibración en base a [BSA] con los datos de la tabla a continuación. La experiencia se

realizó dos veces con las mismas medidas y en iguales condiciones, por lo que se decidió

sacar un promedio de los valores de absorbancia para disminuir el error de las mediciones.

De los datos se obtuvo un gráfico con la siguiente ecuación dela recta y = 0.0181x + 0.2781​.

Tabla de curva de calibración con [BSA]

Concentraci ón de BSA

Absorbancia promedio de las muestras de BSA

0 μg/μL 0,27

1 μg/μL 0,30

2 μg/μL 0,30

4 μg/μL 0,36

6 μg/μL 0,37

10 μg/μL 0,46

Tabla 1. ​Promedio de absorbancias a 595 nm de diferentes [BSA] en el espectrofotómetro.

Gráfico curva de calibración con [BSA]

Gráfico 1. Relación entre absorbancia a 595 nm y [BSA], además de su ecuación de la recta y R​2 ​del

89, 59%, donde el eje “x” corresponde a la concentración y el eje “y” a la absorbancia.

Concentraciones de las muestras problema

Muestra Absorbancia promedio de las muestras

Concentración proteica de las muestras problema

Tejido hepático de pollo

0,33 3.11 μg/mL

E.​coli 0,30 2.25 μg/mL

Tejido foliar planta de tomate

0,36 3.97 μg/mL

Tabla 2. ​Absorbancia promedio y concentración en μg/mL​ ​de las muestras problema obtenidas a

partir de la ecuación de la recta.

2. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) Gel 1

Figura 1. ​Pesos moleculares correspondientes al estándar PageRulerTM Prestained Protein Ladder

y bandeo del extracto proteico de tejido hepático, bacteria y tejido foliar en los carriles 1, 2 y 3,

respectivamente.

Gel 2

Figura 2. ​Pesos moleculares correspondientes al estándar PageRulerTM Prestained Protein Ladder

y gel de electroforesis con extracto proteico de tejido hepático, bacteria y tejido foliar.

Tabla de migración proteica y el correspondiente kDa

kDa Migración de proteínas en cm

130 2.1

100 2.9

70 3.6

55 4.7

35 6

25 7.4

15 8.5

Tabla 2.​ Tabla de relación entre el kDa de la banda de referencia con la migración medida en

centímetro de las proteínas de las muestras en estudio.

Gráfico de peso molecular estándar

Gráfico 2. ​Relación del logaritmo del peso molecular en kDa medido por la banda de referencia

PageRulerTM Prestained Protein Ladder con la migración de las proteínas medida en centímetros.

Cálculo de peso molecular

Hígado de pollo E.coli Tejido foliar de hoja de tomate

Rf 1.3cm/10cm=0.13 8.5cm/10cm=0.86 3.3cm/10cm=0.33

Ecuación log(PM) = -0.7069 *

0.13 + 1.6962

log(PM) = -0.7069 *

0.86 + 1.6962

log(PM) = -0.7069 *

0.33 + 1.6962

PM 40.2 kDa 12.2 kDa 29.03 kDa

Tabla 3.​ Peso molecular obtenido a través de la ecuación obtenida en el gráfico 2 y el valor de Rf

Proteínas para cálculo de peso

Figura 3.​ Proteínas seleccionadas para el cálculo de su peso (Tab.3)

Discusión ​Los resultados obtenidos en la curva de calibración con estándar de BSA expuestos en la

Tabla 1 demuestran el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer. Ésta indica que la

concentración de una sustancia es directamente proporcional a la absorbancia, o en otras

palabras, a medida que aumenta la concentración de BSA, mayor es la absorbancia

captada por el espectrofotómetro.​(5) ​Además de esto, el R​2 de 89,59% expuesto en el

Gráfico 1 nos indica que nuestro modelo es eficiente para poder calcular la concentración

de proteínas de nuestras muestras problema.

Por otro lado, en relación a los datos expuestos en la Tabla 2, se pudieron encontrar

diferencias con respecto a la hipótesis inicial, es decir, que el tejido hepático de pollo

presentaría una mayor concentración de proteínas. Esto pudo deberse a los procesos a los

que fue sometido el hígado de pollo para poder obtener el extracto proteico, evitando así

que se obtuviera una concentración acorde a lo esperado.

Al centrarse en los resultados obtenidos en la electroforesis denaturante de las muestras

problema presentes en el gel 1 (Fig 1) y en el gel 2 (Fig 2) se puede apreciar una clara

diferencia a simple vista como lo es la poca claridad de las bandas en el gel 2 (Fig 2). Esto

pudo deberse a variadas razones que van desde una poca concentración proteica cargada

al gel hasta falta de coloración del mismo.

Es importante destacar que realizar una buena curva de calibración es crucial para saber la

cantidad de proteínas que contendrá una alícuota del extracto proteico y de esta manera no

someter al gel a una concentración que no es capaz de soportar o que no es detectable

para la sensibilidad de la técnica.

Específicamente en los carriles A (tejido hepático), B (bacteria) y C (tejido foliar) del gel 1

(Fig 1) se pudieron encontrar bandas muy distintas con respecto a la intensidad y número

de ellas. Hay dos extremos evidentes, el del tejido hepático de ave y la bacteria. Estos se

debieron a que el tejido hepático tiene una alta función metabólica en el organismo​(6)​. Por

ejemplo, existe una elevada síntesis de proteínas de exportación como la albúmina, lo que

implica un desarrollo elevado del aparato de Golgi, y por consiguiente, de todas las

proteínas involucradas en la ruta Golgi-membrana. Por otro lado, aunque se ha visto que

bacterias con alto grado de patogenicidad tienen la capacidad de generar modificaciones

post-traduccionales, como glicosilaciones que le otorgan estabilidad y peso a las

proteínas​(7)​, la E. ​coli es un procarionte que convive de manera normal en la microbiota del

intestino, por lo que se excluye normalmente de este grupo ​(8) ​y se traduce en el tenue

bandeo.

El peso molecular de las proteínas se pudo obtener a través de la ecuación de la recta

obtenida (Gráfico 2) log(PM) = 0.7069 Rf + 1.6962, que según los pesos obtenidos puede

corresponder en el tejido hepático a reninas, en la bacteria a Hha y en el tejido foliar a

acuaporinas.

Conclusiones Se cumplio el objetivo de visualizar las diferentes concentraciones proteicas en muestras de

células eucariotas y procariotas. El uso y combinación de los datos obtenidos al realizar las

dos técnicas permitieron realizar un análisis exacto del perfil proteico de las diferentes

muestras.

Bibliografía

(1) Alberts B. (2010). Biología Molecular de la Célula. 6​aEd. Omega. (Barcelona, ES). pp​ :

125.

(2) García H. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e

importancia. ​Universo Diagnóstico​ (1.​2)​:31-4. (3) Johnson M. (2012). MATER METHODS. ​Research. (2):115 (4) Laporte D. Rodríguez F. Muñoz P. (2017). ANÁLISIS DEL PERFIL DE PROTEÍNAS

EXTRAÍDAS DESDE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS MEDIANTE ELECTROFORESIS

DENATURANTE EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE). ​Guia de actividades

prácticas.​ pp:14-15.

(5) Abril N. Barcenas A. Fernández E. Galván A. Jorrín J. Peinado J. Meléndez-Valdés T.

Túnez I. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de

biomoléculas. ​(1)​:4-5

(6) Voet D. Voet J.G. (2006). Bioquímica. 3​a​ Ed. Médica Panamericana. (México). Pp:

948-951.

(7) Córdova L. (2009).Glicosilación de proteínas en bacterias patógenas. ​El Residente.

(4-​3)​ :105-110 (8) Demain A. Vaishnav P. (2009). Production of recombinant proteins by microbes and

higher organisms. ​Elsevier. (3):297-306

No hay comentarios
Esta solo es una vista previa
3 páginas mostradas de 13 páginas totales
Descarga el documento