cromatografia, Apuntes de Bioquímica. Universitat Autònoma de Barcelona (UAB)
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Asignatura: Tecniques instrumentals, Profesor: Pere Suau, Carrera: Bioquímica, Universidad: UAB
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Cromatografia: sistemas que permiten separar solutos de una mezcla y están formadas por dos fases, una estacionaria y otra móvil. Es un mètode que permite identificar y cuantificar muestras gaseosas o líquides (para las sólidas se necessita un proceso de disolución o extracción previo). Para clasificar estas técnicas se recurre a tres criterios diferentes:

Todas se basan en el mismo fenómeno: permitir que las sustancias que forman una mezcla entren en contacto con dos fases (un líquido y un gas, un sólido y un líquido, etc.). Una de las fases es estática (no se mueve) y tenderá a retener las sustancias en mayor o menor grado; la otra, fase móvil, tenderá a arrastrarlas. Cada sustancia química tiene distinta tendencia a ser retenida y a ser arrastrada.

Dependiendo de la naturaleza de la fase estática y de la fase móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía

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• Según el sistema operativo.

o El sistema mayoritario es la columna, que es empleada tanto en los métodos convencionales como en los de alta resolución (HPLC). (líquidos, gases, fluidos supercríticos)

o Una superficie plana, que puede ser un papel o una capa fina.

• Según el criterio de separación entre las fases.

o Reparto, distinguiéndose dos causas del mismo:

▪ Si se produce por solubilidad: cromatografía en papel, en capa fina, de gases o HPLC.

▪ Si se produce por tamaño: cromatografía por filtración en gel.

o Interacción, diferenciando cuatro tipos:

▪ Electrostática: cromatografía de intercambio iónico.

▪ Hidrofóbica: cromatografía hidrofóbica.

▪ Afinidad biológica: cromatografía de afinidad.

▪ Adsorción.

Cromatografia d’adsorció: La absorción es cuando una sustancia se introduce en la estructura de otra. La adsorción es un fenómeno superficial, la sustancia adsorbida no se introduce en el volumen del cuerpo, sino solo se adhiere a su superficie.

Eluyente es la fase móvil que atraviesa la columna.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado. Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase móvil líquida en cromatografía de líquidos.

Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas.

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografía.

Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La muestra que se está separando/ analizando (formada de analito/s y el disolvente) se inyecta en la fase móvil que se mueve a través de la columna. En el caso de la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no polar como el hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa).

Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición durante la cromatografía. Un ejemplo es la capa de gel de sílice en la cromatografía en capa fina.

CROMATOGRAFIA DE REPARTO EN PAPEL Y CAPA FINA

El sistema operativo de estas dos cromatografías de reparto es un papel de celulosa o una lámina de polvo sólido fino (alúmina, sílice, carbón, almidón, aluminio, etc.) colocado sobre vidrio, formando una capa fina.

Cualquiera de estos dos elementos se introduce dentro de un recipiente de cristal en el que se ha depositado un disolvente orgánico o una mezcla de estos, pudiendo estar o no acompañados de agua.

Cerca de uno de los extremos del papel o de la capa fina se coloca la muestra, intentando que ocupe la menor superficie posible, por lo que es frecuente el empleo simultáneo de la pipeta y un secador. La línea sobre la que se coloca la muestra recibe el nombre de origen.

Una vez se coloca el sistema en el interior del recipiente, el líquido situado en el fondo comenzará a ascender por capilaridad por el papel o la capa fina, distinguiéndose dos casos en función del material:

- Papel. El ascenso de los disolventes provoca el movimiento de la muestra, haciendo que unos componentes se muevan más rápido que otros. . Aleshores, aquelles espècies amb solubilitat alta en el dissolvent orgànic, pujarà per capil·laritat per les fibres de cel·lulosa amb el dissolvent; mentre que les espècies amb solubilitat preferencial per l’aigua, es quedaran retardades ja que l’aigua les estarà immobilitzant.

- Capa fina. El proceso es similar al de la cromatografía en papel. Aquellos componentes que tengan más afinidad con el material con el que está hecha la capa fina quedarán más retrasados con respecto de los menos afines. La interacción entre los componentes de una muestra y la capa fina queda determinada por las isotermas de adsorción, unas gráficas en las que se relaciona la cantidad de muestra que se ha adherido a la capa fina con respecto a su concentración a lo largo del tiempo. Representa el solut adsorbit respecte la concentració total de solut. Aleshores, quan ens trobem davant d’isotermes semblants, podem posar concentracions diferents per a marcar més la diferència entre les dues. Esta adsorción depende de las características de la muestra y de su concentración. El gel de sílice es un ejemplo que se utiliza para hacer el adsorbente. Las substancias más polares, con mayor capacidad de unión al adsorbente, se quedan en la parte baja de la capa fina.

El frente es el límite de la difusión por capilaridad del disolvente y a partir de su valor se pueden estandarizar los valores del ascenso de los componentes de la muestra. De esta forma, el coeficiente de repartimiento (Rf) (mobilitat relativa) que és el quocient entre la mobilitat del component (cm) i la mobilitat del front (cm- el màxim punt).

Diferencias papel y capa fina:

En la capa fina el soporte de la fase estacionaria no es una estructura fibrosa como el papel, sino un sólido pulverizado el cual se haya extendido en forma de una capa sobre una plancha de vidrio, plástica o metálica. Estos sólidos que pueden actuar como soporte una vez pulverizados son: celulosa, poliamidas, aluminio y sobretodo sílica (de carácter fuertemente polar porque presenta grupos SiOH).

Ventajas capa fina versus papel:

1. Mayor superficie de contacto: entre la fase móvil y la fase estacionaria. Esto es debido a que hay muchas moléculas de agua repartidas por la capa que no alrededor de las fibras de celulosa en el papel. Cuanto mayor sea la superficie de contacto más fácil será la separación, y por tanto, mayor será la eficiencia cromatográfica.

2. Elevada acción capilar: El disolvente se mueve más fácilmente a través de una capa fina porque el polvo está hecho añicos y por tanto la fase móvil puede penetrar mejor por ella mientras que en papel hay fibras y le cuesta más moverse. Por lo que en la capa fina existe una mayor velocidad de desarrollo.

3. Posibilidad de hacer una 2ª dimensión: Una misma placa pude utilizarse para hacer desarrollos bidimensionales y esto no es posible en papel porque una vez ha pasado el disolvente orgánico el papel se deforma mientras que en la capa fina se puede volver a aplicar un nuevo disolvente.

CROMATOGRAFIA CONVENCIONAL EN COLUMNA En aquesta cromatografia trobem un tub de vidre, amb la mostra del material a dalt de tot i connectat al tampó. La mostra és arrossegada pel tampó i, segons el tipus de cromatografia, el material se separa d’una o altra forma, però ho acaba fent. Finalment, les molècules que volíem separar surten i les agafem en fraccions d’1mmL. Així que podem posar una cel·la de lectura que permeti elaborar el perfil cromatogràfic i trobarem que cada component té el seu propi volum d’elució.

CROMATOGRAFIA DE GASOS

Es otro tipo de cromatografía de repartimiento con un gas noble.

DEFINICIÓN: Se trata de una técnica de separación en la que la fase móvil es un gas portador. Se efectúa siempre en columna. Es útil para separar pequeñas moléculas, análisis rápido de lípidos y para los controles de dopaje. Es basa en la diferència de solubilitat.

Els capil·lars de quars (les columnes) estan revestides per partícules lipídiques (polienglicó) i tenen un gruix d’entre 0,5 i 0,75 micres, molt llargues i flexibles. Aquesta és la fase estacionària (líquid), mentre que la fase mòbil és un gas noble (com l’argó).

La separació es produeix per diferència de solubilitat entre la fase líquida o gas. Per tant, les substàncies han de ser volàtils, i és per aquesta raó que es practica a temperatures de 300ºC, i els lípids passen a ser analitzables.

Les espècies menys solubles seran arrossegades pel gas, mentre que les més solubles F 0 E 0queden retardades al líquid. La fase estacionària sol ser el polietilenglicol OH(CH2-

CH2O)n-H a on “n” és igual a entre 60 i 80. Seguidament d’aquesta cromatografia, s’utilitza un espectròmetre de masses (detector) per a determinar la massa molecular de les substàncies analitzades.

L’avantatge que té aquesta cromatografia és que es poden separar moltes molècules a la vegada, i l’elevada temperatura permet que les partícules siguin més polars i puguin romandre més temps al lípid.

FILTRACIÓN EN GEL

Se desarrolló por la necesidad de separar proteínas. Se considera una técnica preparativa, ya que además de separar los componentes, estos se pueden purificar.

El sistema operativo es una columna de vidrio larga y delgada rellena de un gel. En su parte superior se coloca la muestra, que supone entre un 1-5% del volumen total del recipiente, y es además el lugar por el que se vierte el tampón acuoso, que permitirá el movimiento de la muestra, mientras que en el extremo inferior se coloca el depósito donde se almacenarán los componentes ya separados.

Fundamentalmente, se emplean tres tipos de gel para esta cromatografía, presentados en forma de esferas que presentan una estructura semejante a la de una esponja, pero a nivel microscópico. Son los siguientes:

a) Sephadex. són cadenes de glucosa entrecreuades per glicerol sintetitzada per microorganismes. De manera controlada, s’uneix la glucosa amb la glicerina i obtenim

la malla. Aquesta malla molecular té forma d’esfera entre 40 i 120 micres, i està foradada com una esponja. A més, és molt útil per a separar molècules petites..

b) Sephacryl. Está formado por cadenas de glucosa polimerizadas unidas entre sí mediante bisacrilamida. Su principal ventaja respecto del Sephadex es que la malla por la que está formada es más rígida, pudiendo ejercer una mayor presión hidrostática sobre el material. Esto tiene como resultado que la cromatografía sea más rápida y más precisa.

c) Sepharosa: és una malla estabilitzada per enllaços dèbils, mentre que les anteriors són enllaços covalents. Constitueix la fracció no carregada de l’agar-agar. Si les cadenes s’escalfen, s’estabilitzen formant cadenes de doble hèlix. Amb el temps, quan es refreda, acaba formant pilars grossos i rígids, el que permet que els orificis siguin molt més grans i el medi no es col·lapsi. Per tant, s’utilitzarà per a separar molècules molt grans.

Estos tres compuestos se caracterizan por no poseer carga, algo necesario dado que prácticamente todas las proteínas tienen carga. Si las esferas poseyesen carga, reaccionarían con las moléculas proteicas, produciendo unos intercambios iónicos no deseados en este tipo de técnica.

Totes aquestes partícules tenen en comú que són molt hidrofíliques, el que ve donat pel grup hidroxil. Les càrregues parcials formaran dipols amb l’aigua. A més, també són molt estables en qualsevol pH i amb qualsevol dissolvent, tot i que no es poden utilitzar en medis molt reductors.

El principio de la separación en este tipo de cromatografía es la diferencia de tamaño de los componentes. En el caso de que un componente que por su tamaño no pueda acceder a la red interna de las esferas, viajará por el volumen vacío de la columna, correspondiéndose su volumen de elución (volumen de tampón necesario para que salga un determinado componente de la columna) con este último volumen.

Si, por el contrario, la molécula es muy pequeña, es decir, una que pueda llegar a cualquier punto de la columna incluso obviando las esferas de gel, su volumen de elución equivaldrá al volumen total de tampón en la columna, esto es, la suma del volumen vacío y el volumen que rellena las esferas.

Otras moléculas poseerán un tamaño intermedio, por lo que solo podrán penetrar parcialmente en las esferas de gel siendo su volumen de elución la suma del volumen vacío y el volumen accesible (es decir, el volumen que pueden penetrar en los canales de las esferas).

De esto se puede deducir que las moléculas más grandes son las que requieren un nvolumen de elución menor, siendo de esta forma las primeras en salir de la columna. Dicho de otro modo, se sale antes cuanto menos tiempo se esté en el interior de las bolitas.

Si se realiza una filtración en gel con el propósito de determinar la masa molecular de las proteínas se puede dar la situación de que algunas solo puedan acceder a las esferas orientadas de un determinado modo.

En caso de que una proteína ‘intente’ entrar en una bola en una ‘postura errónea’, se producirá una pérdida de tiempo, siendo corregida posteriormente dicha postura mediante la agitación térmica, pero dando como resultado una masa molecular mayor, es decir, ‘inflada’ (sucede en algunas proteínas como la alúmina).

Para corregir esto, se emplean desnaturalizantes antes de la filtración, siendo el más frecuente el cloruro de guanidinio que hacen desaparecer la estructura secundaria y terciaria de la proteína.

Como consecuencia se forma una estructura casi esférica que, a causa de la movilidad del enlace peptídico, forma enlaces débiles que se rompen instantáneamente.

Para determinar la masa molecular de una proteína, es preciso realizar la cromatografía de proteínas de masa molecular ya conocida (calculando su logaritmo decimal), con el fin de conocer su coeficiente de reparto.

Con ambos datos se elabora la gráfica que relaciona estas dos variables, con la que se podrá aproximar de forma empírica la masa molecular de la proteína de interés.

En el caso de moléculas muy grandes, su volumen de elución se corresponde con el volumen vacío de la columna, por lo que este último volumen, necesario para calcular el coeficiente de reparto de otra molécula, se puede obtener cromatografiando una molécula de estas características, siendo las más recurrente el azul de dextrano, cuyo peso molecular es de 2·106 u, y el ADN.

Asimismo, para determinar el volumen total de tampón, que se corresponde con el volumen de elución de moléculas pequeñas, se cromatografía un compuesto de estas características, como la acetona o el permanganato de potasio. Es aconsejable aumentar la densidad de la muestra añadiendo alrededor de un 3% de glicerol o sacarosa concentrada con el fin de que esta entre a las esferas de la columna con su concentración estable, sin que varíe a causa de la adición del tampón.

Existen varias aplicaciones para este tipo de cromatografía:

- Separación de proteínas por tamaños.

- Determinación de masas moleculares.

- Desalado. Es un proceso que consiste en separar un determinado compuesto de la sal que pueda contener la muestra y que solo se puede realizar mediante diálisis o, si la sal es muy pequeña, mediante filtración en gel, en la cual se suele usar el Sephadex G-25 (de una gran resistencia y muy trabeculado). Durante la cromatografía, la proteína sale primero y la sal después, ya que, debido a su reducido tamaño, pasa bastante tiempo en

el interior de las esferas. Solo en este caso se puede emplear un porcentaje de muestra respecto del volumen total que oscile alrededor del 25%.

- Aplicaciones industriales. Debido a la flexibilidad del tamaño de las columnas, este tipo de cromatografía puede llegar a emplearse con fines industriales. Si el tamaño de la misma y la masa de los componentes es muy alto, se corre el riesgo de que colapse el montaje, por lo que se recurre a construir una columna formada por módulos conectados entre sí mediante secciones cónicas.

IGUALTATS:

Volum fase mòbil (Vo) + Volum entre partícules (Vg)= Volum d’exclusió

Volum fase estacionària (GEL) (Vi) + Volum dins les partícules (Vg)= Volum intern

Volum total = Vo + Vi

Volum d’accessabilitat (Vacc) = Volum d’elució (Ve) – Vo

Coeficient de repartiment (Kav)= Vacc / V

La f. En gel és útil perquè els materials són inerts, per tant, accepta quasi totes les condicions. Només on les condicions on el poder reductor és molt alt perquè es tenca l’enllaç O-glicosídic i consegüentment es trenca la columna.

INTERCAMBIO IÓNICO

La cromatografía iónica es una forma de cromatografía líquida. Es una técnica de separación basada en el principio de adsorción selectiva cuyo objetivo es separar los distintos iones en una solución. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos.

Función: es usada a menudo en purificación de proteínas,

Separación basada fundamentalmente en diferencia en las afinidades para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Es la carga y no el tamaño lo que determina la separación.

El intercambio iónico se define como el intercambio de especies cargadas con otras especies inmovilizadas por un soporte insoluble. Como soporte insoluble en agua se pueden emplear compuestos como la agarosa o el ADN, que se modifican para poder hospedar a las cargas, positivas o negativas.

Ejemplo: Fase móvil: tampón. /// eluyente salino. (amb la sal es pot fer sortir)

Fase estacionaria: cargas inmovilizadas.

Existen dos tipos de medios:

- Intercambiadores de cationes. Retiene cationes debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente.

- Intercambiadores de aniones. Retiene aniones usando grupos cargados positivamente.

En el caso de un intercambiador de cationes, es decir, uno que tuviese cargas negativas inmovilizadas en la superficie interna de la columna, requeriría la presencia de un tampón (fase móvil) cargado positivamente que interactuase débilmente con el sistema, permitiendo así que, con el vertido de la muestra, los componentes con carga positiva puedan unirse al intercambiador.

En la columna hay soportes insolubles inmovilizados y cargados – o +. Hacemos pasar una muestra con dos especies: a y b, cargadas con el símbolo contrario a la carga de la columna. Al estar cargadas a y b se unen al soporte inmovilizado. A y b tienen afinidades suficientemente distintas entre ellas al soporte. Se hace un gradiente de concentración salina. La sal tiene que contener iones más afines al soporte cargado que a o b. Ej: si queremos quedarnos con a (suponiendo que a es más afín a la columna que b) introduciremos una solución salina que contenga iones más afines que b pero menos que a.

CRECIENTE: Pasa un contraión, una sal cualquiera, creciente. Las que son menos cationes salen en una determinada concentración. Las de más afinidad necesitan más concentración. Si tienen afinidades muy parecidas los picos . El contraió és qualsevol ió lligat a un intercanviador de cations/anions. Poden ser anions carregats positivament o cations carregats positivament. El nom de l’intercanviador es refereix a les càrregues que té, aleshores, un intercanviador de cations retindrà càrregues positives, i l’anió, negatives.

GRADIENTE CONTINUO: Bajan los dos a la vez. A tiempo 0 sale lo que está más cerca que es la diluida, tenga la concentración que tenga. La concentración de diluida va subiendo mientras la concentrada baja.

GRADIENT DE CONTRAIONS

Aquest gradient és el volum de dissolució que es passa de manera seqüencial per una columna, de manera que la concentració augmenta. La finalitat és que una espècie surti abans, ja que té menys afinitat que l’altra. Un exemple seria el clorur de sodi.

Per a crear aquest gradient s’omplen dos dipòsits. En el dipòsit de tampó més proper a la sortida, es posa la concentració diluïda, i en el més allunyat la més elevada.

El volum del gradient serà la suma dels volums dels dos dipòsits. A més, en el dipòsit amb concentració mínima, hi haurà una manilla magnètica per tal que es mescli les dues concentracions.

Tot i això, aquest procediment es pot invertir. Amb un gradient més pla, podem arribar a separar proteïnes similars en afinitat. També és important, a més de la concentració i

del volum, el pendent ja que amb espècies amb afinitat similar, s’haurà d’utilitzar gradients més plans. Per a poder canviar el pendent, el que fem és canviar les concentracions o el volum, és a dir, disminuir la concentració màxima o augmentar el volum total.

La càrrega de la columna no hi té una limitació del volum de la mostra (del 3 al 5%). Es pot afegir la mostra sempre i quan no se saturi. A més, les columnes seran curtes i gruixudes, amb una relació axial 1:5, que té molt a veure amb la dissociació i elució de la mostra. La relació axial és el quocient de la longitud de la columna respecte e diàmetre de la columna.

També hi ha una possibilitat d’eluir les columnes utilitzant un gradient de pH. Si es treballa amb un intercanviador de cations, el pH serà inferior al punt isoelèctric. Així que per apropar-nos al punt isoelèctric, al voltant de 6, augmentem el pH de manera que es perd afinitat i les proteïnes se separen de la columna

En una mescla de proteïnes, a un determinat pH, algunes seran anions i les altres seran cations. Per realitzar la cromatografia, en aquest cas, primer utilitzarem un intercanviador d’anions, deixarem circular la mostra i una de les proteïnes (les carregades positivament) passarà de llarg. Aleshores, analitzem les proteïnes retingudes i repetim el procés amb un intercanviador de cations.

Mientras que, en la filtración en gel, el volumen de la muestra está limitado (15%), en la cromatografía de intercambio iónico no, ya que se puede llegar prácticamente al extremo de saturación de la columna, aunque lo más preferible es que la muestra no exceda 2/3 del volumen total.

REGENERaCIÓ

• Amb gradient de sal

• Amb el canvi de pH

-

CROMATOGRAFIA D’INTERACCIÓ HIDROFÒBICA O DE FASE REVERSA

La interacción hidrofóbica puede explicarse a través de dos perspectivas, una termodinámica y otra en la que intervienen fuerzas a escala atómica:

▲ Si en una disolución acuosa se encuentra inmersa una macromolécula hidrofóbica (M), esta induce un cambio en la estructura de agua, que pasa de actuar como un líquido a actuar como un sólido. En esa misma disolución habría un ligando (L) afín a la macromolécula de mismas características que también estructuraría el agua en su superficie. Para que se produzca la interacción M-L se deben desplazar las moléculas de agua estructuradas situadas en contacto con la región de unión en M, que pasarían de nuevo a formar parte de la disolución. En este proceso se produce un incremento positivo de la entropía (paso de agua sólida a agua líquida), que se supone que es la fuerza motriz de dicha interacción, ya que cualquier reacción tiende a aumentar el valor total de entropía. De esto se deduce que la interacción hidrofóbica no es una verdadera interacción, sino que la variación de energía es debida a cambios en la entropía del sistema.

▲ Las fuerzas de van der Waals determinan la distancia entre átomos vecinos. Si dos átomos se aproximan suficientemente, hasta que sus electrones entran prácticamente en contacto, aparece una fuerza de atracción, la llamada fuerza de van der Waals. En el caso de que se acercasen más aparecería una fuerza repulsiva mucho más intensa. La distancia interatómica a la que ambas fuerzas se encuentran en equilibrio se denomina radio de van der Waals. Esto sería otra forma de explicar la interacción hidrofòbica.

La versatilidad y eficiencia de este tipo de cromatografía se ha visto incrementada con el uso de sistemes d’alta resolució , (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) que utilizan alta presión para mejorar la resolución y reducir los tiempos de separación.

Se trabaja a esta presión porqué el soporte que se utiliza para el ligando hidrofóbico son unas bolitas de sílice entre uno y 3 micrómetros, están empaquetadas de forma

compacta, es ínfimo para poder pasar a través de la columna. Para poder pasar el tampón y la muestra entre estas bolitas tiene que tener esta elevada presión.

Aquest tipus de cromatografia serveix per a qualsevol proteïna. Finalment, per a recuperar la mostra, s’utilitzen gradients de dissolvents orgànics, com l’acetometil, ja que també interaccionaran hidrofòbicament. Aleshores, les substàncies menys hidrofòbiques sortiran abans, i les més hidrofòbiques sortiran després.

El medio empleado en esta técnica es un gel formado por esferas de sílice (cuarzo) de entre 3 y 10 μm de diámetro. Estas esferes contienen grupos silanol que en un inicio son polares y por lo tanto, dificultarían la cromatografia, però se convierten apolares gracias a la adición de trimetilclorosilano. A causa del reducido tamaño de las esferas de sílice, el número de intercambio con las especies analizadas es muy elevado, por lo que da como resultado unos cromatogramas muy definidos.

El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. Las primeras moléculas que saldrán serán las menos hidrofóbicas. Por eso se puede hablar de fase reversa, lo más polar sale antes, es inverso en la cromatografía de intercambio iónico.

La fase móvil es un disolvente de polaridad moderada, cuya adición reduce las interacciones hidrofóbicas entre la fase estacionaria y los componentes provocando su elución. Esta técnica no permite analizar grandes cantidades de muestra. Esta cromatografía tiene, por tanto, aplicaciones de carácter analítico, y no preparativo para muestras grandes.

CROMATOGRAFIA D’AFINITAT Aquesta cromatografia és un tipus de cromatografia en columna que aprofita les interaccions específiques entre diversos components moleculars afins. Per realitzar-la, s’ha d’immobilitzar per enllaços covalents un dels components, anomenat L (lligand). L’altra component serà M (macromolècula) o S (sample, mostra). La unió es produirà tot i que hi hagi altres components que no siguin afins, aquests passaran de llarg i s’eluiran.

La fase estacionaria es el ligando unido a una matriz insoluble (normalmente Agarosa), por lo tanto sólida. La fase móvil es líquida.

De vegades, el lligand i la molècula no es poden posar en contacte per la zona d’interacció. Aquest fet es pot resoldre mitjançant una cadena hidrocarbonatada, però és un procés llarg i complicat.

Vida mitjana: Temps que triga el ligand a dissociar-se.

La vida media es una manera alternativa de representar la KD.

Keq : constante de equilibrio

Ka : constante de asociación o de velocidad

KD : constante de disociación. Como más elevada sea más estable es. Dependiendo de la reacción de afinidad que queramos usar, variará la constante de equilibrio de la reacción entre el ligando y soluto.

Según el valor de la constante de equilibrio Keq, variará el tiempo medio (t1/2) que tardarán en separarse la mitad de moléculas con el ligando (el tiempo medio es una estimación, el tiempo de unión entre el ligando con la molécula es más o menos aleatorio). Esto supone la aparición de algunos problemas cuando trabajamos con tiempos medios altos y bajos.

Cuando trabajamos con tiempos medios bajos, el problema surge a la hora de cargar la columna y llegar a separar la disolución, ya que los enlaces entre el ligando y la sustancia que queremos retener es muy corto.

Al trabajar con tiempos medios altos, el problema surge al querer obtener la materia separada. La solución está en forzar la separación con el ligando. Hay dos maneras para hacerlo:

- Elución inespecífica (1 y 2): Alteración de las variables que afectan la interacción (1). Se puede realizar, por ejemplo, mediante agentes desnaturalizantes (2) que rompen la estructura de la molécula, consiguiendo que se rompa la interacción

- Elución específica (3 y 4): El equilibrio del sistema se puede modificar añadiendo una molécula análoga a la que se desea separar, ocasionando fenómenos de competencia por la unión al ligando, o una molécula análoga al ligando, ocasionando fenómenos de competencia por la unión al soluto. En el caso 4, lo que se purifica no es la molécula, sino la molécula+ligando, de manera que posteriormente tendrá que separarse.

El principio de eficacia creciente explica por qué es posible realizar cromatografías de afinidad en moléculas que poseen constantes de afinidad muy bajas con el ligando. Si se aumenta la concentración de ligando, por muy bajo que sea el valor de la constante, la molécula irá ‘saltando’ de uno en otro, aumentando así su concentración local. Este proceso debe ser apoyado mediante el uso de muestras muy concentradas del componente de interés; es frecuente en el caso de moléculas con constantes de afinidad con un valor del entorno de 104.

De esta forma, es preferible trabajar con moléculas cuya constante de afinidad valga 108, valor para el que el complejo formado por el ligando y la molécula dura alrededor de 10 segundos. En el caso de moléculas con constantes del entorno de 1014, el complejo puede llegar a durar muchas horas, por lo que se debe introducir en la columna una disolución disociadora fuerte que provoque la rotura del complejo. Si se desea emplear un método menos agresivo, se emplean disociadores más suaves que se cargan en la columna, donde deberán permanecer alrededor de 2-3 vidas medias del complejo, provocando así la disociación espontánea del mismo y que no se vuelvan a unir a causa de la presencia de los agentes de la disolución.

Mención especial requiere la disociación de columnas con anticuerpos, que suelen ser susceptibles a perder su afinidad con el antígeno si son inmersos en disoluciones desnaturalizantes, ya que se emplean dos métodos alternativos para separar los complejos: añadir una disolución de MgCl2 3M o una de ácido acético con pH= {2,3}.

CROMATOGRAFIA D’AFINITAT PER ENLLAÇ COVALENT

És un tipus de cromatografia en el qual es poden immobilitzar molècules per enllaços covalents als enzims dels suports insolubles. Són enllaços de ponts disulfurs (són reversibles). Hi ha dos tipus de lligands:

- Tiolsefarosa: els grups –SH2 s’oxiden formant un pont disulfur. Les molècules amb grups tiol són antioxidants, ja que redueixen els grups oxidants.

- Tiolpropil-sefarosa: és la mateixa molècula, però unida per una sola cadena, en comptes de dues.

Se basa en el uso de grupos tiol que son los grupos SH. Hay un aminoácido que es la cisteína que tiene el grupo tiol como grupo funcional. Tienen importancia en muchos aspectos desde el punto de vista estructural: se oxidan con mucha facilidad.

Si hay dos SH con mucha facilidad estos se oxidan y forman un puente disulfuro que estabiliza enormemente las proteínas. Podemos encontrar una proteína que tiene una estructura que se aproxima en dos puntos. Si tenemos un SH i otro SH se forma el puente disulfúrico que es covalente y la estabiliza. Los anticuerpos tienen muchos de estos puentes. Si tenemos una proteína con una histedina en la superficie y la pasamos a través de una columna con grupos tiol como grupo activo se quedan enganchados. Los brazos espaciadores acaban con el SH. Los grupos tiol están en el extremo de la cadena para que nada interfiera.

Cuando se une aún no hemos hecho la cromatografía. A partir de aquí tenemos que recuperar lo que se ha enganchado. Las que no se enganchan ya se recuperan, ya se ha separado.

Para recuperar: Tiol de bajo peso molecular: cisteína como grupo funcional que compite para recuperar o separar el enlace. La cisteína HS--CH2--CHNH3+--COO-.

Aquest tipus de reacció implica que no hi ha d’haver relacions reductores, ja que es trencaria el pont disulfur i no es podria immobilitzar la molècula. Tanmateix, les condicions reductores es poden utilitzar per alliberar les molècules immobilitzades, utilitzant cisteïna, per exemple, que és un tiol amb baix pes molecular. Això consumirà el medi cromatogràfic.

Las aplicaciones de esta técnica son:

• Separar proteínas. La presencia de tioles de bajo peso molecular provoca competencia por el establecimiento de puentes disulfuro. El medio cromatográfico se consume en estos procesos.

• Inmovilizar células. Cualquier célula tiene multitud de receptores de membrana con grupos SH y, por lo tanto, podría quedar retenida por estos medios.

• Inmovilizar enzimas. Activando una bomba de tampón conectada a la columna se produce la elución del sustrato y el producto derivado de la acción enzimática, por lo que el enzima permanece inmovilizado en la columna, siendo útil para futuros processos.

La principal diferència amb la resta cromatografia és el tipus d’enllaç ja que mentre que aquesta es realitza per enllaços covalents, les altres soler ser per ponts d’hidrogen.

CROMATOGRAFIA METALL-QUELAT

Es pot tallar un plasmidi i realitzar un insert d’alguna molècula, per exemple una proteïna. Aleshores, els bacteris poden incorporar el plasmidi, i les proteïnes es fabricaran de manera ràpida. Finalment, s’haurà de separar la proteïna de la resta del plasmidi. En alguns casos, es pot realitzar amb un pas cromatogràfic, de tal manera que podem aconseguir una puresa del 90%.

El fundamento de IMAC es la capacidad quelante de las proteínas, es decir, su capacidad de unirse a iones de metales pesados, que se debe a su vez a tres aminoácidos: el triptófano (Trp), la cisteína (Cys) y, sobre todo, la histidina (His). Como ligando actúa un ion de níquel, de zinc o de cobalto.

La puesta a punto de estos sistemas cromatograficos consiste en inmovilizar cationes en fases estacionarias provistas de agrupaciones quelantes muy ponentes.

Un ion Ni2+ se une a una matriz de agarosa mediante un brazo espaciador formado por una cadena hidrocarbonada. El níquel interacciona con las cargas negativas de los grupos acetato del brazo y crea una interacción prácticamente irreversible que solo se deshará si la columna es degradada. La adición del níquel hace que el sistema del interior de la columna pase a ser azul.

Per a fer la cromatografia, es passen per la proteïna 6 histidines. Les histidines poden modificar la funció del DNA, així que les posarem en un extrem de la molècula. A més la histidina té la capacitat d’establir enllaços coordinants amb metalls, com ara el níquel.

Después de ser purificada se pasa a través de la columna. La proteína que tiene las 6 histidinas quedan enganchadas y las demás pasan de largo. Se eluye la proteína con un gradiente de imidasol.

CROMATOGRAFIA D’ÀCIDS NUCLEICS

Apunts

Utilització de les proteïnes A i G per a la purificació d’anticossos

Apunts

Utilització de lectines

Les lectinas son proteínas que se unen con gran afinidad a azucares y permite utilizar para purificar polisacáridos y células puesto que las proteínas de membrana que miran hacia fuera la mayoría están unidas covalentemente.

Hay diversas lectinas.

• Concavalina A: se encuentra en los frijoles con grandes concentraciones. Esta concavalina A se une a residuos de manosa y glucosa. Por lo tanto, cualquier polisacarito que tengan estos se unirán con gran fuerza.

• Entil lectina: de las lentejas. También se une fuertemente a manosa y glucosa pero con una ventaja: purificar proteínas membranas. La interacción con los azucares resiste un 1% de desoxicolaco que es un detergente. Las membranas se disuelven y liberan las proteínas de membrana. Este extracto se pasa a través de una columna de lentil lectina y se quedan enganchadas a pesar del detergente. Toleran el disolvente de la membrana.

• Lectina del germen de trigo: trigo recién germinado. Este contiene grandes cantidades de lectinas del germen de trigo que tienen una característica que interacciona muy rápidamente con N-acetilglucosamina (glucosa modificada) este residuo es muy común en las membranas de las neuronas y también tolera el dexocolato.

Los ácidos nucleicos también se pueden inmovilizar sobre un soporte para que sean la base de una cromatografia de afinidad.

Purificació d’una proteïna que reconeix ADN de cadena senzilla

Es un proceso que permite purificar proteínas estabilizadoras (SSB) del DNA, descubiertas por primera vez en el bacteriófago T-4 (siendo la primera la denominada p32).

Las proteínas SSB están presentes en todas las células y virus, estando su expresión ajustada a la necesidad de cada célula. Su función es proteger las cadenas sencillas (ssDNA) que aparecen transitoriamente durante los procesos de replicación del DNA de la acción de las nucleasas.

La resistencia que las SSB aportan al DNA evita que este se desnaturalice e impida de esta forma la acción de la polimerasa. La afinidad que estas proteínas estabilizadoras presentan por el DNA aumenta considerablemente en las hebras sencillas, ya que se pueden agrupar en bloques, cosa que no pueden hacer en las dobles hélices (la afinidad aumenta 1000 veces a causa de la multiplicación de la constante de afinidad habitual, 105, por la constante de cooperatividad, 103). Esta gran afinidad se explica por el hecho de que son proteínas con carga eléctrica positiva y el ADN, una biomolécula de carga negativa. La purificación de SSB sigue varias etapas:

1. Se realiza un cultivo bacteriano y se detiene en la etapa de crecimiento exponencial.

2. Se centrifuga el cultivo provocando la ruptura de las membranas plasmáticas. Se obtiene un extracto formado por el citoplasma y el DNA. Este último debe ser eliminado para que las SSB se puedan unir al DNA inmovilizado en el medio cromatográfico y se hace mediante nucleasas o haciéndolo precipitar con un 10% de polietilenglicol.

3. Se hace una cromatografía con DNA de doble cadena (dsDNA) inmovilizado en una columna que contiene una disolución 0,35M de NaCl. Se emplea la sal para evitar que se unan absolutamente todas las proteínas cargadas positivamente al dsDNA, ya que la concentración salina hace que las SSB no puedan interactuar con el DNA. Asimismo, si se hiciese en primer lugar una cromatografía con ssDNA, la reacción se saturaría y la proteína que se desea obtener, presente en cantidades muy pequeñas, no podría ser conseguida por unirse completamente a la cadena simple. La fracción eluida de la primera columna se hace pasar por una segunda cromatografía, pero de ssDNA.

4. Se eluye la segunda columna con un gradiente creciente de NaCl (0,3-2M). La proteína que nos interesa es la que sale de la columna a una concentración salina mayor.

TEMA 2: ESPECTROSCOPIA D’ABSORCIÓ Las técnicas espectroscópicas permiten medir las propiedades moleculares en función de la interacción de la radiación electromagnética con las moléculas. Es decir, se basan en la interacción entre la materia y la energía. Desde el punto de vista experimental, interesan los niveles energéticos que se crean cuando un átomo es sometido a un fuerte campo magnético, permitiendo así determinar su estructura.

La energía total de una molécula está determinada por:

- Energía electrónica. Se corresponde con la energía de los electrones en el campo electrostático del núcleo y es la suma de la energía cinética y potencial de cada uno de ellos.

- Energía vibracional. Es la suma de la energía cinética y potencial que experimentan las moléculas debido al movimiento vibracional provocado por los

cambios en la posición de los núcleos como consecuencia de la flexibilidad de los enlaces.

- Energía de rotación. Está asociada al movimiento re rotación de la molécula entera.

- Energía nuclear de orientación de spin. Se debe a los cambios en el spin del núcleo como consecuencia de un campo magnético o eléctrico exterior. En esto se basa la RMN.

Totes les espectroscòpies es basen en canvis entre nivells energètics de les molècules. En les espectroscòpies d’absorció, es tracta de canvis entre nivells electrònics dels electrons en el camp electrostàtic del nucli. Per induir-se aquests canvis, s’utilitza radiació electromagnètica. Per induir les transicions, l’energia de la radiació electromagnètica ha de coincidir exactament amb la diferència d’energia entre els nivells que s’està estudiant (E=hf). Al final, un electró saltarà de l’orbital fonamental a un altre estat vibracional.

Tot i això, qualsevol freqüència no pot induir els canvis entre els nivells en els que es treballa. Al fer una mesura d’absorció, s’ha d’irradiar amb una longitud d’ona que correspon amb els nivells energètics dels electrons de la mostra. Els electrons no es queden sempre en estat excitat, sinó que tornaran a l’estat original i emetran fluorescència.

Las principales técnicas espectroscópicas son:

• Espectroscopia ultravioleta. La absorción de radiación ultravioleta provoca la promoción de un electrón de un estado basal a uno excitado, liberándose el exceso de energía en forma de calor, que lleva asociada una longitud de onda determinada por la expresión �� = ��ℎ ��1−��2 .

• Espectroscopia infrarroja. Dos de las tres regiones de la porción infrarroja del espectro (infrarrojo medio e infrarrojo cercano) permiten estudiar las vibraciones fundamentales y no fundamentales. Es una técnica importante dado que permite una determinación estructural de baja resolución, permitiendo, por ejemplo, saber si una proteína posee una conformación de hélice α o lámina β.

• Resonancia magnética nuclear. La exposición de algunos núcleos atómicos (como hidrógeno o nitrógeno) a radiación electromagnética provoca cambios en su spin. La RMN permite determinaciones estructurales de alta resolución.

ESPECTROFOTÒMERS: HAZ SENZILL I DOBLE

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