Cromatografía en simulador HPLC - Análisis Químico e instrumental - Análisis y control, Apuntes de Análisis Químico e Instrumental

¡Descarga Cromatografía en simulador HPLC - Análisis Químico e instrumental - Análisis y control y más Apuntes en PDF de Análisis Químico e Instrumental solo en Docsity! docsity.com 1 OBJECTIU Fer un estudi sobre el funcionament d’un sistema d’HPLC (High Performance Liquid Crhromatography) per mitjà d’un simulador per ordinador. Trobar les variables més adients per a la determinació dels patrons definits a la mostra. FONAMENT TEÒRIC La diferent velocitat de migració dels pigments que volem separar per la fase estacionària és la propietat que farem servir per fer aquesta separació cromatogràfica en columna. El mecanisme de separació que tractem en aquesta pràctica és partició, de forma que la repartició per dissolució (polaritat) de la mostra a la fase estacionària i a la fase mòvil depén de les seves polaritat. Les columnes de què disposa el simulador son les següents: NOM TAMANY DE PARTICULA (µ) DIMENSIONS DuPont C-18 6,0 23,0 x 0,46 DuPont C-8 6,0 23,0 x 0,46 Waters C-18 10,0 30,0 x 0,39 Merck C-8 10,0 25,0 x 0,46 Hypercyl C-18 6,0 16,0 x 0,50 Els rebliments que tenen més carbonis són més polars. La fase mòbil que podem preparar es pot composar d’aigua i un dels següents compostos: metanol, tetrahidrofurà i acetonitril. La composició en percentatge del compost que no és aigua es pot definir a l’ordinador. El detector és molt complet, fa servir l’UV proper i té una gama de sensibilitat de 2,00 a 0,005. Té opció diode array, que és un escombrat de les longitud d’ona que és capaç de llegir. Altres paràmetres que es poden definir son: quantitat de mostra a injectar, mode isocratic o gradient, fluxe de la fase mòbil, detector en mode de variable o diode array i la sensibilitat del detector. MATERIAL • Equip cromatogràfic (simulat a l’ordinador). REACTIUS • Fenol. Acid fènic. C6H6O. Tòxic. T ANÀLISI INSTRUMENTAL 19-feb-2000 Pràctica 5: Simulador HPLC. Tema: Cromatografía en columna tancada: HPLC docsity.com 2 R34: Provoca cremades. R24/25: Tòxic en contacte amb la pell i per ingestió. S28.6: En cas de contacte amb la pell, renteu-vos inmediata i abundantment amb... (producte especificat pel fabricant). S45: En cas d’accident o malestar, aneu inmediatament al metge (si és possible ensenyeu-li l’etiqueta). • P-Nitrofenol.( C6H5NO3) Nociu, irritant, Xn R20/21/22: Nociu per inhalació, ingestió i en contacte amb la pell. R33: Perill d’efectes acumulatius. S28.1: En cas de contacte amb la pell, renteu-vos inmediatament amb... (producte especificat pel fabricant) • P-Cresol. (C7H8O). Tòxic. Corrosiu. T R24/25: Tòxic en contacte amb la pell i per ingestió. R34: Provoca cremades. S36/37/39: Useu vestimenta i guants adequats i protecció per als ulls/la cara. S45: En cas d’accident o malestar aneu inmediatament al metge (si és possible, ensenyeu-li l’etiqueta. • 2,5-xilenol. (informació no disponible). • Benzoat de metil. C8H8O2. Nociu. Xn R22: Nociu per ingestió. • Anisol. Metoxibencè. C7H8O. Inflamable, irritant. Xn R10: Inflamable. docsity.com 5 W 254 nm Isocràtic/gradient Isocràtic I el cromatograma resultant ha estat: Ara, injectem la mateixa quantitat de mostra, sent aquesta una mostra problema que té 3 components desconeguts. No hi ha cap més variació al cromatògraf. Obtenim el cromatograma següent: I els resultats són, tenint en compte les dades del cas anterior (els temps de retenció permeten identificar els components de les mostres i l’àrea dels pics permet fer la determinació quantitativa): Temps de retenció Area del pic Concentració (mg/litre) Compost 34,93 80 7,32 p-Cresol 39,07 126 12,02 Bencè 55,47 63 5,58 Fenetol Ara fem servir la mostra de patrons i les condicions cromatogràfiques inicials, amb l’excepció del %B, que ara és un 10% i obtenim el cromatograma següent. docsity.com 6 Si es fa una comparació visual, podem veure com, en no entrar tanta quantitat d’eluent, la mostra és arrossegada més a poc a poc, de forma que hi ha més distància entre els pics. Això també provoca que hi hagui només 8 pics encara que la mostra té 9 patrons. Així, podem dir que hem guanyat en selectivitat, la resolució ha millorat, encara que hi ha 2 pics junts, i en fi, la resolució és millor. Posem ara, amb la mostra de patrons, la columna número 2 (DuPont C8) per veure quines diferències tenim. El cromatograma resultant és, en les condicions que s’indiquen: Columna DuPont C-8 %B 10% Mostra 50µlitres Floxe FM 1 ml/min Eluent THF W 254 nm Isocràtic/gradient Isocràtic Podem veure que només surten 5 pics i a més hi ha dos que es troben junts, de forma que hem perdut en tots els paràmetres de qualitat, fem ara una prova amb la columna 3 (Waters C-18) (conservant els altres paràmetres i sempre amb la mostra de patrons indicada al principi): Es veu un pic més, encara que no gaire bé, i continúa tenint dos pics junts (poca selectivitat), hem tornat a perdre qualitat. Provem ara amb la columna 4 (Merck C-8): docsity.com 7 A més de veure els pics més petits, només es veuen 5 dels 9 que han de sortir, presentant l’últim una fusió de dos pics amb tailing. Tornem a perdre en quant a selectivitat, eficàcia i resolució. Ho intentem amb la columna 5 (Hypercil C-18): Es veuen 6 pics, els primers, com sempe, bastant ben separats i amb bona eficàcia, però els altres no són tan perfectes, i a més només surten 6. Veure els resultats en números: Pic Temps de retenció (s) Area 1 26,00 176 2 36,44 198 3 53,11 150 4 67,11 117 5 69,56 57 6 85,78 87 Ara modifiquem la quantitat d’eluent que es barreja a la fase mòbil amb l’aigua, i posem una quantitat superior: Columna Hypercil C-18 %B 30% Mostra 50µlitres Floxe FM 1 ml/min Eluent THF W 254 nm Isocràtic/gradient Isocràtic docsity.com 10 Tenim un cromatograma totalment diferent, però que no presenta gaire més qualitat, només als tres primers pics podem parlar de selectivitat i eficàcia. Cal tenir present que la mostra consta de 9 components. Per continuar fent convinacions, fem servir ara un altre eluent a la FM, acetonitril: Columna DuPont C-18 %B 20% Mostra 50µlitres Floxe FM 1 ml/min Eluent ACN W 254 nm Isocràtic/gradient Isocràtic I tenim el cromatograma següent: Que es veu molt millor que el primer de tot (fent servir THF), encara que l’últim pic té una eficàcia bastant dolenta. Podem parlar d’una bona selectivitat, eficàcia mitjana i resolució bona. I per veure si l’altra solvent és millor, fem la cromatografia: Columna DuPont C-18 %B 20% Mostra 50µlitres Floxe FM 1 ml/min Eluent Metanol W 254 nm Isocràtic/gradient Isocràtic docsity.com 11 Tenim només 3 pics, és un cromatograma amb bastant eficàcia, però sense selectivitat (no es veuen els pics restants). I ara tornem a posar la configuració del cromatograma original i modifiquem el fluxe de FM, el cromatograma de sota és el que té 1 ml/min (el primer de tot) de FM i comparteix els altres paràmetres: Columna DuPont C-18 %B 20% Mostra 50µlitres Floxe FM 2 ml/min Eluent THF W 254 nm Isocràtic/gradient Isocràtic docsity.com 12 Es veuen uns pics més grans i igual de separats (els mateixos temps de retenció), de forma que es perd selectivitat i eficàcia, resolució, en definitiva. Aquest simulador té una opció al detector que permet fer un escombrat de longituds d’ona, de forma que es pot fer una gràfica temp/longitud d’ona i surt un cromatograma tridimensional, que en el nostre cas, surt de la pantalla: Columna DuPont C-18 %B 20% Mostra 50µlitres Floxe FM 2 ml/min Eluent THF W DIODE ARRAY Isocràtic/gradient Isocràtic Amb aquesta gràfica es pot veure quina és la longitud d’ona més adient a un compost determinat, i gràcies a les eines informàtiques, es pot veure una determinada longitud i comparar- la amb una altra: