ELABORACIÓN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TÉCNICA DE DIAFANIZACIÓN PARA LA ENSEÑANZA DE LA MORFOGÉNESIS ÓSEA, Tesis de Maestría de Anatomía. Universidad Nacional de Colombia
hemel.pacheco
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ELABORACIÓN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TÉCNICA DE DIAFANIZACIÓN PARA LA ENSEÑANZA DE LA MORFOGÉNESIS ÓSEA, Tesis de Maestría de Anatomía. Universidad Nacional de Colombia

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Tesis para optar al titulo de Magister en Morfologia Humana de La Universidad Nacional de Colombia, relativa a la tecnica anatómica de diafanización y tinción osea con alizarina
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ELABORACIÓN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TÉCNICA DE

DIAFANIZACIÓN PARA LA ENSEÑANZA DE LA MORFOGÉNESIS ÓSEA.

JONATHAN CORONADO CASALLAS

Trabajo de grado para optar al

Título de magister en Morfología Humana

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA

MAESTRÍA DE MORFOLOGIA HUMANA

BOGOTÁ – CUNDINAMARCA

2014

ELABORACIÓN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TÉCNICA DE

DIAFANIZACIÓN PARA LA ENSEÑANZA DE LA MORFOGÉNESIS ÓSEA

JONATHAN CORONADO CASALLAS

Trabajo de grado

Director

DR. JAIME BELTRÁN GUERRA

Codirectora

DR. ZOILA EMILIA CASTAÑEDA MURCIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA

MAESTRIA DE MORFOLOGIA HUMANA

BOGOTA – CUNDINAMARCA

2014

3

DEDICATORIA

A Dios, por su sabiduría y discernimiento durante cada instante; a mí hijo Esteban por sus

grandes bendiciones desde el momento que llego a nuestras vidas; a mi esposa Jessica y a

mi familia por su apoyo incondicional.

4

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Zoila Emilia Castañeda Murcia, Profesora pensionada e invitada de la Maestría

de Morfología Humana de la Unidad de Biología Celular por su continuo respaldo,

paciencia, motivación, interés constante, acompañamiento y sus consejos científicos para

la elaboración de este trabajo.

Al Dr Jaime Alfonso Beltrán Guerra, Profesor asociado de la Unidad de Anatomía y

Embriología del Departamento de Morfología Humana y director de la Maestría en

Morfología Humana de la Universidad Nacional de Colombia, por sus valiosos aportes y

su acompañamiento en el desarrollo de la investigación.

5

RESUMEN.

El proyecto de investigación busca exponer la obtención de piezas anatómicas diafanizadas

con tinción de centros de osificación en ratones, la elaboración de los modelos y lograr

estandarizar la técnica de preservación anatómica de diafanización. Según la propuesta, el

proyecto de investigación requirió de siete fases, las cuales se desarrollaron en la

Universidad Nacional de Colombia. En la primera fase se realizó una prueba preliminar en

un cerdo. En la segunda y tercera fase, se implementó el protocolo de una universidad local

y latinoamericana. La cuarta fase se basó en las experiencia de las primeras tres fases, y se

realizó una fusión de técnicas que resultó en una adecuada diafanización. La quinta fase se

hizo en fetos ratones de 17 días después de la copulación. La sexta y séptima fase, basadas

en las anteriores realizó un protocolo de diafanización estandarizado que se implementó

en 4 ratones con resultados satisfactorios en diafanización.

Palabras clave: Diafanización, centros de osificación, fases, ratón y estandarización.

6

ABSTRACT

This paper present in a clear the way how getting pieces anatomical diaphanizations with

staining centers of ossification in mice. The development of pieces and help standardize

the technique of anatomical preservation of diafanization according to the proposal made

by the author of the research project required seven phases which were developed at

Universidad Nacional de Colombia. The first step was done in a pig, the second and the

third phase was use not only the protocol from a local university but also from a Latin

American college. The fourth step of the project was perform a fusion of the thecniques

than provide a successful result in the diafanization. The fifth step was done the process in

mice fetuses of 17 days since the coupling. The sixth and seventh stage of the project was

perform a standardized protocol of diaphanization that was implemented in four mice with

satisfactory results.

Keywords: Diaphanization, ossification centers, stages, mouse and standardization.

7

Índice.

INTRODUCCIÓN. ............................................................................................................. 12

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................ 13

2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 14

2.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 14

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ....................................................................................... 14

3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 15

4. MARCO DE REFERENCIA .......................................................................................... 16

4.1. ANTECEDENTES MUNDIALES .............................................................................. 16

4.2 ANTECEDENTES LATINOAMERICANOS ............................................................. 17

4.3. ANTECEDENTES NACIONALES ............................................................................ 18

4.4. ANTECEDENTES DE INVESTIGACION ASOCIADOS AL ESTUDIO EN LA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA ............................................................... 20

5. MARCO CONCEPTUAL. .............................................................................................. 21

5.1. DIAFANIZAICIÓN. .................................................................................................... 21

5.1.1. PROCEDIMIENTOS DE DIAFANIZACIÓN ......................................................... 21

5.1.1.1. TECNICA DE MACERACION DE DAWSON // SCHULTZ. ............................ 22

5.1.1.2. METODO DE DIAFANIZACION EN PECES. .................................................... 23

5.2. REACTIVOS A IMPLEMENTAR EN LA INVESTIGACION ................................. 23

5.2.1 HIDROXIDO DE POTASIO. ................................................................................... 24

5.2.2 GLICERINA ............................................................................................................. 24

5.2.3 ACETONA ................................................................................................................. 24

6. BIOQUIMICA DE COLORANTES EN TEJIDO OSEO Y CARTILAGO A

IMPLEMENTAR EN TECNICA DE DIAFANIZACIÓN. ............................................... 27

6.1 ROJO DE ALIZARINA ................................................................................................ 27

6.2 AZUL DE ALCIAN. ..................................................................................................... 27

6.3 Embriologia del tejido oseo. .......................................................................................... 28

6.3.1. Desarrollo del mesodermo lateral. ............................................................................ 28

6.3.2. Órganos derivados del mesodermo paraxial (sistema esquelético) ........................... 29

6.3.3. Histogenia del cartílago ............................................................................................. 30

6.3.4 Histogenia de hueso. .................................................................................................. 30

6.3.5 Osificacion Intramembranosa. ................................................................................... 31

6.3.6 Osificación intracartilaginosa o endocondral. ............................................................ 31

6.3.7 Desarrollo del esqueleto axial. ................................................................................... 34

6.3.8 Desarrollo del cráneo ................................................................................................. 35

6.3.8.1 Neurocráneo cartilaginoso ....................................................................................... 35

6.3.8.2 Neurocráneo membranoso. ...................................................................................... 35

6.3.8.3 Desarrollo de la cabeza ósea a partir de arcos faringeos. ........................................ 36

8

6.3.8.4 Desarrollo de la cara. ............................................................................................... 36

6.3.8.5 Cráneo del recién nacido. ........................................................................................ 37

6.3.8.6 Crecimiento postnatal del cráneo. ........................................................................... 37

6.3.9 Desarrollo de la columna vertebral. ........................................................................... 38

6.3.9.1 Etapa cartilaginosa del desarrollo vertebral. ........................................................... 38

6.3.9.2 Etapa ósea del desarrollo vertebral. ......................................................................... 39

6.3.10 Desarrollo de las costillas. ........................................................................................ 39

6.3.11 Desarrollo del esternón ............................................................................................. 40

6.3.12 Desarrollo del esqueleto apendicular. ...................................................................... 40

7. CONSIDERACIONES ÉTICAS..................................................................................... 42

8. DISEÑO METODOLOGICO PARA LA ELABORACION DE PIEZAS

ANATOMICAS DIAFANIZADAS. .................................................................................. 43

8.1. TIPO DE ESTUDIO. .................................................................................................... 43

8.2. Especímenes utilizados. .............................................................................................. 43

8.3. Variables. ..................................................................................................................... 43

8.3.1. Variable cualitativa nominal. .................................................................................... 43

9. INSTRUMENTOS. ......................................................................................................... 44

9.1 Equipos .......................................................................................................................... 44

9.2 Materiales. ..................................................................................................................... 45

10. FASES PARA LA ELABORACION DEL MATERIAL ANATÓMICO. .................. 46

11. RESULTADOS OPTENIDOS DE LAS TECNICAS DE DIAFANIZACIÓN

DURANTE CADA FASE. .................................................................................................. 48

11.1. FASE UNO: “PRUEBA PRELIMINAR”.................................................................. 48

11.1.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: PRIMERA FASE. ...................... 57

11.1.2 CONCLUSIONES FASE UNO: PRUEBA PRELIMINAR. ................................... 62

11.2. FASE DOS: “PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE LOS ANDES” . ....................... 63

11.2.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: SEGUNDA FASE ...................... 72

11.2.2 CONCLUSIONES DE LA FASE DOS: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE

LOS ANDES ....................................................................................................................... 74

11.3. FASE TRES: “PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE CHILE” ................................. 74

11.3.1 CONCLUSION FASE TRES: PROTOCOLO UNIVERSIDAD SANTO TOMAS

DE CHILE. .......................................................................................................................... 76

11. 4. FASE CUATRO: “EXPERIENCIAS POSITIVAS FASE UNO Y DOS”. ............. 77

11.4.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: CUARTA FASE......................... 83

11.4.2 CONCLUSION FASE CUATRO: “EXPERIENCIAS POSITIVAS FASE UNO

Y DOS. ................................................................................................................................ 85

11.5. FASE CINCO: “FETOS RATONES”. ...................................................................... 86

11.5.1 CONCLUSION FASE CINCO: FETOS RATONES. ............................................. 92

9

11.6 FASE SEIS: “PROTOCOLO DE DIAFANIZACIÓN SEGÚN EXPERIENCIAS

POSITIVAS DE FASES 1, 3, 4, 5 EN CUATRO RATONES DE 17 DIAS”. ................. 92

11.6.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: SEXTA FASE. ........................... 96

11.6.2 CONCLUSION FASE SEIS: PROTOCOLO DE DIAFANIZACIÓN SEGÚN

EXPERIENCIAS POSITIVAS DE FASES 1,2, 4, 5 EN CUATRO RATONES DE 17

DIAS. ................................................................................................................................... 98

11.7. PROTOCOLO DE DIAFANIZACIÓN SEGÚN EXPERIENCIA PRELIMINAR

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA . ............................................................. 99

11.8 ANÁLISIS GENERAL DE RESULTADOS DE CADA FASE, DURANTE LA

ELABORACIÓN DE LAS PIEZAS ANATÓMICAS DIAFANIZADAS……...……....100

12. CONFIABILIDAD Y VALIDEZ. .............................................................................. 101

13. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ......................................................... 102

14. CRONOGRAMA. ....................................................................................................... 104

15.PRESUPUESTO……………………...………………………………………………106

ANEXOS. .......................................................................................................................... 110

16. Bibliografía. ................................................................................................................. 114

Índice de tablas.

Tabla 1. Datos de seguridad de reactivos. ........................................................................... 25

Tabla 2. Principales centros de osificación y edad en la que se fusionan…………………33

Tabla 3. Registro de reactivos fase uno ............................................................................... 48

Tabla 4. Registro de reactivos fase dos ............................................................................... 63

Tabla 5. Registro de reactivos fase tres. .............................................................................. 75

Tabla 6. Registro de reactivos fase cuatro ........................................................................... 77

Tabla 7. Registro de reactivos fase cinco ............................................................................ 86

Tabla 8. Registro de reactivos fase seis…………………………………………………...92

Tabla 9. Resumen de reactivos y resultados fases 1,2 y 3 durante las técnicas de

diafanización.…..…………………………………………………………………….......100

Tabla 10. Resumen de reactivos y resultado fases 4,5,6 y 7 durante las técnicas de

diafanización.…….……………………………………………………………………...100

Tabla 11: CRONOGRAMA SEGUNDO SEMESTRE 2013 ........................................... 104

Tabla 12: CRONOGRAMA PRIMER SEMESTRE 2014 ............................................... 104

Tabla 13: CRONOGRAMA SEGUNDO SEMESTRE 2014 ........................................... 105

Tabla 14: Presupuesto. ...................................................................................................... 106

Tabla 15: presupuesto detallado. ....................................................................................... 107

Tabla 16: Presupuesto reactivos químicos……………………………………………….109

10

Índice de fotografías.

Fotografía 1 y Fotografía 2. ................................................................................................. 42

Fotografía 3. Inmersión en KOH y fijación con alcohol 70% ............................................ 50

Fotografía 4. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 0,2% .................................... 51

Fotografía 5. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 0,25% .................................. 51

Fotografía 6. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 0,35% y 0,45% ................... 52

Fotografía 7. Inmersión en Glicerina pura .......................................................................... 53

Fotografía 8. Inmersión por 15 días y recambio cada 7 días de Glicerina pura. ................. 54

Fotografía 9. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 0,2% .................................... 55

Fotografía 10. Inmersión en Glicerina pura ........................................................................ 56

Fotografía 11. Marcación de centros de osificación con rojo de alizarina primer, tercer,

quinto y séptimo día. .......................................................................................................... 59

Fotografía 12. Aspecto final de marcación de centros de osificación. ................................ 59

Fotografía 13. Desmanchado con alcohol al 70% e inmersión en solución de hidróxido de

potasio. ................................................................................................................................ 59

Fotografía 14. Inmersiones en glicerina pura, alcohol y hidróxido de potasio. .................. 60

Fotografía 15. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 0,2% .................................. 61

Fotografía 16. Inmersión y recambio de glicerina pura. ..................................................... 62

Fotografía 17. Fijación en formol al 10% e inmersión en solución de hidróxido de potasio

10%. ..................................................................................................................................... 65

Fotografía 18. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 10%. .................................. 66

Fotografía 19. Pérdida y retiro de pelo. ............................................................................... 66

Fotografía 20. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 2%. .................................... 67

Fotografía 21. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 2%. .................................... 67

Fotografía 22. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 2%. .................................... 68

Fotografía 23. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 2%. .................................... 68

Fotografía 24. Primera inmersión en glicerina pura. ........................................................... 69

Fotografía 25. Inmersión de solución de hidróxido de potasio 0,2% . ................................ 70

Fotografía 26. Segunda inmersión en glicerina pura. .......................................................... 70

Fotografía 27. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 0,4% .................................. 71

Fotografía 28. Tercera inmersión en glicerina pura. ........................................................... 71

Fotografía 29. Pos-marcación de centros de osificación. .................................................... 72

Fotografía 30. Inmersion y desmanchado en solucion de hidroxido de potasio 0,45% y

0,5%. .................................................................................................................................... 73

Fotografía 31. Inmersion en glicerina pura 10%. ................................................................ 73

Fotografía 32. Fijacion en formol al 10%............…………………………………………75

Fotografía 33. Cinco dias de inmersion en solucion de hidroxido de potasio 2% sin

glicerina. .............................................................................................................................. 76

11

Fotografía 34. Fijación en formol al 10% e inmersión en solución de hidróxido de potasio

10%.....……………………………………………………………………………………..79

Fotografía 35. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 10%. .................................. 80

Fotografía 36. Pérdida y retiro de pelo. ............................................................................... 81

Fotografía 37. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 2% con glicerina. .............. 81

Fotografía 38. Inmersión de solución de hidróxido de potasio 0,3% .................................. 82

Fotografía 39. Inmersión de solución de hidróxido de potasio 0,35%. ............................... 82

Fotografía 40. Inmersión de solución de hidróxido de potasio 0,4% .................................. 83

Fotografía 41. Pos-marcación de centros de osificación. .................................................... 84

Fotografía 42. Inmersión y desmanchado en solución de hidróxido de potasio 0,45%. ..... 84

Fotografía 43. Inmersión en glicerina pura. ........................................................................ 84

Fotografía 44. Fijación en formol al 10% e inmersión en solución de hidróxido de potasio

0,05%. .................................................................................................................................. 87

Fotografía 45. Aumento de concentración de 0,05% a 0,1% de solución de hidróxido de

potasio. ................................................................................................................................ 88

Fotografía 46. Inmersión de solución de hidróxido de potasio a 0,15% y fijación con

alcohol al 70%. .................................................................................................................... 88

Fotografía 47. Solución de hidróxido de potasio 0,2%. ...................................................... 89

Fotografía 48. Solución de hidróxido de potasio superior a la permitida para obtener una

diafanización adecuada. ...................................................................................................... 89

Fotografía 49. Solución de hidróxido de potasio a 0,1%. ................................................... 90

Fotografía 50. Solución de hidróxido de potasio a 0,1%. ................................................... 90

Fotografía 51. Inmersión en glicerina pura. ........................................................................ 91

Fotografía 52. Septimo dia de inmersion y recambio de la glicerina. ................................. 91

Fotografía 53. Fijación en formol al 10% e inmersión en solución de hidróxido de potasio

10%. ..................................................................................................................................... 94

Fotografía 54. Inmersión en solución de hidróxido de potasio 10%. .................................. 95

Fotografía 55. Inmersión de solución de hidróxido de potasio 0,2% y 0,3%. .................. 95

Fotografía 56. Inmersión de solución de hidróxido de potasio 0,3% y 0,35%. ................ 96

Fotografía 57. Pos-marcación de centros de osificación. .................................................... 97

Fotografía 58. Inmersión en glicerina pura. ........................................................................ 98

12

INTRODUCCIÓN.

Las técnicas de preservación anatómicas son actualmente elementos pedagógicos y

científicos de evidencia real, científica y verificable que permiten a la educación de las

ciencias de la salud incorporar de manera temprana al estudiante al laboratorio y hacia

enfoques de investigación que contribuyan a trasformar al estudiante pasivo-receptor en

activo-constructor que permita mejorar la calidad del proceso de enseñanza del docente

trasmisor, en un mediador del proceso con el fin de lograr un aprendizaje significativo en

ciencias morfológicas de seres humanos y otras especies.

La técnica de diafanizacion la que permite corroborar la secuencia anatómica del proceso

de osificación de mamíferos (humanos, ratones) mediante el uso de sustancias corrosivas

(hidróxido de potasio) las cuales transparentan los tejidos a excepción del tejido óseo

brindan información importante para determinar la edad ósea de un feto normal,

malformado o la relación y comparación ósea evolutiva entre especies, desde una mirada

docente no existe en la Universidad Nacional una relación directa de estudio verificable en

piezas anatómicas de la teoría de la morfogénesis ósea por parte del estudiante. El proceso

de conservación anatómica mediante diafanización otorga posibilidades investigativas en

el desarrollo de protocolos aplicables, sostenibles y reproductibles en el tiempo no solo en

sistema óseo también en cardiovascular, digestivo y nervioso por las diferentes alternativas

para el procesamiento de especímenes mediante la técnica de diafanización, el reto es

explorar el procedimiento de diafanización desde sus principios técnicos, cientificos y

conocer las sustancias químicas empleadas y lograr un óptimo resultado de manera costo-

efectiva. De una u otra manera, lograr especímenes diafanizados de excelente calidad con

poco deterioro en tiempo, ofrece la alternativa de la técnica de diafanizacion como línea de

profundización e investigación de correlación teórico-práctica de morfogénesis ósea,

anatomía comparada y embriología que permita el fortalecimiento y posicionamiento de la

Maestría de Morfología Humana a nivel nacional e internacional.

13

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

Actualmente, hay disponibles técnicas de preservación anatómica protocolizadas

(plastinación, inyección corrosión), con importancia y enfoque anatómico estructural. Entre

ellas, la técnica de la diafanización, que consiste en transparentar tejido, con la intención de

visualizar el sistema óseo sin alterar su estructura macroscópica. Debido a la falta de

modelos de preservación anatómica diferentes a inyección corrosión y plastinación, no se

encuentran actualmente material de profundización y correlación teórico-práctica del

aprendizaje embriológico de la morfogénesis ósea, que ayude a la formación de los

estudiantes del departamento de morfología de la facultad de Medicina de la Universidad

Nacional de Colombia. La ausencia de investigaciones publicadas en diafanización en la

universidad (ver repositorio institucional de la biblioteca), y en la única maestría de

morfología humana de nuestro país, constituye uno de los principales aportes de esta

investigación. No obstante, en las múltiples técnicas de diafanización (ver marco teórico)

no se relacionan detalles de concentraciones, tiempos, purezas y calidad de los reactivos,

por lo tanto, el presente proyecto parte de la siguiente pregunta:

¿Cuál es la técnica de diafanización que puede ser implementada por docentes para la

enseñanza de la morfología y en la elaboración de piezas anatómicas de morfogénesis ósea

de mamíferos por parte del estudiante como estudio de correlación teórico-práctico en el

departamento de morfología de la Universidad Nacional de Colombia?

14

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

 Establecer protocolo y piezas anatómicas de conservación con la técnica de

diafanización como material de enseñanza a los estudiantes de pregrado y posgrado

del departamento de morfología de la Universidad Nacional de Colombia.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Desarrollar un protocolo de diafanización que pueda ser implementado por docentes

y estudiantes en el departamento de morfología de la Universidad Nacional de

Colombia.

 Realizar la revisión teórica de la técnica de diafanización que permita su

implementación.

 Validar la técnica, según revisión teórica, con el fin de obtener resultados de

diafanización en la elaboración de piezas anatómicas.

15

3. JUSTIFICACIÓN.

La preservación de cadáveres y especímenes anatómicos es un proceso descrito desde la

antigüedad; los egipcios aportaron al conocimiento médico y de la industria funeraria

usando sustancias químicas y técnicas de embalsamar. Actualmente, hay muchas técnicas

de preservación anatómica, protocolizadas y con enfoque anatómico estructural.

Particularmente, entre ellas encontramos la técnica de la diafanización, descrita en la

literatura de manera sencilla y puntual que busca explicar cómo transparentar tejidos con

base en la igualación de los índices de refracción de la luz dentro y fuera del tejido, con la

intención de permitir la visualización del tejido óseo. Por tal razón, el presente proyecto

tiene como objetivo la generación de piezasanatómicas preservadas con la técnica de

diafanización, que sirvan comomodelo pedagógico claro y costo-efectivo en la

morfogénesis ósea de mamíferos. En el momento, no existen piezas diafanizadas para sus

estudios en el departamento de morfología de la Facultad de Medicina y la maestría de

morfología, que permitan la comprensión de la formación ósea en mamíferos, que ayuden a

la determinación de centros de osificación membranosa y cartilaginosa, permitiendo el

análisis de la anatomía comparada entre vertebrados y sus implicaciones evolutivas.

(Concha, 2006)

Al finalizar el desarrollo del proyecto de investigación, se construirán piezas anatómicas

diafanizadas, con base en una técnica implementada, que dará respuesta a la pregunta del

proyecto de investigación.

16

4. MARCO DE REFERENCIA

4.1. Antecedentes mundiales

Tilotta Françoise, Lazaroo Bernard, Laujac M y Gaudy J, del Instituto de anatomía de la

Universidad de Saints-Pères, y la Universidad Descartes de París-Francia, realizaron la

investigación titulada: “Estudio de la vascularización de la aurícula mediante disección y

diafanización”, en la que parten de afirmar que el proceso de vascularización de la oreja

está mal documentado, a pesar de los avances en la auriculoterapia y cirugía reconstructiva;

el objetivo fue describir la distribución arterial, usando dos técnicas: diafanización y la

disección anatómica. El estudio fue llevado a cabo después de la inyección intravascular de

ocho pabellones auriculares diafanizados y diez que fueron disecados y diseccionados. La

conclusión mostró que la oreja es irrigada por una rama auricular anterior, que surge en la

arteria temporal superficial y una rama posterior que nace de la arteria auricular posterior

en ocho de cada diez casos, y los restantes dos casos, en la arteria occipital. En relación a la

diafanización, se reveló que la distribución arterial tridimensional en los especímenes

conservados, a través de la técnica mencionada, tiene un uso didáctico para complementar

la disección anatómica (Tilotta F, 2009).

Rodriguez Baeza en colaboración con M. Rodriguez Palos de la Universidad Autonoma de

Barcelona realizaron un estudio de revisión titulado “Determinación mediante técnicas de

corrosión, diafanización y microscopía electrónica de barrido de los territorios vasculares

arteriales, con especial referencia a la irrigación de la medula espinal” el objetivo fue

mediante técnicas anatómicas estudiar la variación de vascularización en órganos del

cuerpo humano para concluir con la medula espinal, una de estas técnica anatómicas fue la

diafanizacion, denominada de Spalteholz donde se transparento utilizando xilol o derivados

y mantenimiento en solución de benzoato de benzilo y salicilato de metilo (Rodríguez

Baeza, 2004).

Pedro Henrique Duarte FranÇa De Castro, J. V realizaron el estudio titulado “Evaluación

de la filtración marginal de diferentes materiales restauradores temporales en Endodoncia”

17

El objetivo es evaluar la filtración marginal coronal de tres materiales restauradores

temporales utilizados para el sellado del conducto radicular después del tratamiento

endodóntico. La metodología del estudio cosiste en un total de 88 dientes unirradiculares

fueron sometidos a preparación biomecánica y se llenó por la técnica de condensación

lateral. Después de proceso de obturación, los dientes fueron separados al azar en cuatro

grupos, siendo dos dientes de cada grupo utilizado como control positivo y negativo. A

continuación, las muestras se sumergieron en tinta china durante 30 y 60- días, siendo 10

muestras para cada intervalo de tiempo y luego sometidos al proceso de diafanización en el

cual las raíces se sumergieron en un receptáculo que contiene 5% de ácido clorhídrico.

Después de descalcificación, las raíces se lavaron con agua corriente y se colocan en escala

ascendente de alcohol (70%, 80%, 92% y 100%) durante 1 h en cada escala, seguido por

inmersión en salicilato de metilo para el proceso de clarificación. Después de diafanización,

las muestras se colocaron en un portaobjetos de vidrio y se llevaron al microscopio

óptico para evaluar la profundidad de fuga coronal. La conclusión principal del estudio fue

que ninguno de los materiales fue capaz de prevenir la filtración marginal en el plazo de 30

y 60 días. (Pedro Henrique Duarte FranÇa De Castro, 2013)

4.2 Antecedentes latinoamericanos

Vanesa del Carmen Reyes Rios, Agustín Alfredo Valiente Schipani, entre otros,

desarrollaron la investigación “Diafanización de embriones de Codorniz como experiencia

didáctica”, conel objetivo de mostrar los resultados obtenidos mediante la diafanización

aplicada en embriones de codorniz, realizada por estudiantes del segundo año de la carrera

de medicina de la Facultad de Ciencias Médicas de Universidad Nacional de Córdoba,

Argentina. Como experiencia didáctica, la metodología consistió en que grupos de tres

alumnos trabajaron con ejemplares de embriones de codorniz, que fueron fijados en formol

por 30 días. La transparencia de las piezas anatómicas se realizó con una solución de

hidróxido de potasio. Luego se utilizó el colorante Rojo de alizarina para el tejido óseo;

dicha actividad permitió la observación del tejido en cuestión. Los alumnos realizaron

diversas experiencias, introduciendo modificaciones de la técnica de diafanización, según el

tamaño de la pieza, permeabilidad tisular y tiempo de exposición de las soluciones

18

utilizadas. En conclusión, la técnica de diafanización posibilita corroborar la secuencia

anatómica del proceso de osificación en diferentes localizaciones y permite también

determinar la edad ósea de un gestante normal. (Reyes Rios & Vanesa del Carmen, 2012)

Bulfon, M; Carabajal, M; Porcari,C. en la Universidad Nacional de Córdoba, Argentina,

realizaron el trabajo titulado “Diafanización y tinción diferencial de hueso y cartílago en

embriones y pequeños vertebrados” que tiene como objetivo la capacitación para la

ejecución de las técnicas de tinción diferencial en vertebrados , fueron utilizados un total de

cinco ejemplares representantes de distintos vertebrados (un pez, una rana, un reptil, una

ave y una comadreja ) El material empleado fue fijado previamente en formol 4% y

conservado en alcohol 70%. La preparación de las piezas se realizó de acuerdo al siguiente

protocolo: 1) Identificación del espécimen, 2) Morfometría, 3) Extracción del tegumento,

evisceración y remoción de ojos. 4) Lavado con agua corriente, 5) Blanqueamiento en

Peróxido de Hidrógeno al 10 %, 6) tinción de cartílago, los especímenes se sumergieron en

una solución de Azul de alcian y luego se post-fijaron en alcohol 100%, 7) Para teñir hueso

se embebieron en una solución de KOH al 3% por 24 hs. Luego se agregaron 8 gotas de

solución acuosa de alizarina roja por cada 100 ml, la solución fue controlada hasta lograr la

transparencia y el color deseado. 8) Posteriormente se transfirieron a soluciones de

glicerina al 50 y 75% por 24 hs y se conservaron en glicerina anhidra pura. (Bulfon,

Carabajal, & Porcari, 2012)

4.3. Antecedentes nacionales.

Lynda Tamayo Arango, Paula Suarez Avendaño, entre otros, realizaron el estudio titulado:

Modelo didáctico del desarrollo del embrión de pollocon diafanización modificada de

Dawson y técnica de tinción, publicado en la revista Colombiana de Ciencias Pecuarias en

el 2012. El objetivo del trabajo fue la creación de un modelo didáctico, que mostrara el

desarrollo del embrión de pollo, usando la técnica modificada de diafanización de Dawson

y la técnica de tinción, que permite a los centros de osificación ser vistos. La metodología,

consistió en utilizar embriones de pollo desde el día 5 al día 21, que fueron diafanizados

con KOH; después se tiñeron con rojo de alizarina, y luego fueron almacenados en glicerol.

19

Los resultados de crecimiento de los centros de osificación primarios durante el desarrollo

embrionario, fueron fáciles de visualizar, y se pudo concluir que este es el primer informe

que muestra un modelo anatómico de todas las etapas embrionarias del desarrollo del pollo.

(Tamayo LJ, 2012)

Ana Claudia Villegas, María De Los Ángeles Quiroga y Daniela Cleves de la Universidad

de los Andes, realizaron el proyecto titulado; Diafanización: visualización del desarrollo

óseo en fetos. En él, se muestra cómo la visualización del sistema óseo, se llevó a cabo por

medio de exploración de dos técnicas o procedimientos de diafanización; la primera fue

técnica Modificada de Dawson, la cual no tuvo resultados satisfactorios en la obtención de

transparentación y resultó más costosa y menos efectiva en la transparentación del

espécimen y visualización del sistema óseo. La segunda técnica de diafanización fue por

maceración de Dawson/Schultz, y evidenció resultados en los que se observó cierto grado

del progreso de transparentación, pero quedó inconclusa en lo referente a los centros de

osificación del sistema óseo del embrión. En conclusión, el proyecto muestra que la

diafanización es una técnica morfológica que se usa en conjunto con la tinción para poder

exponer, visualizar y analizar los centros de osificación en un feto, antes de llevar a cabo el

proceso y se debe hacer un estudio previo exhaustivo de la técnica, el procedimiento,

materiales y las condiciones ambientales, para asegurar que el experimento sea exitoso.

(Villegas, Quiroga, & Cleves, 2012)

Carlo Mejía realizo diafanizacion e informe titulado “ Secuencia de aparición de centros de

osificación en embriones y fetos bovinos mediante la técnica de diafanización y tinción

ósea con alizarina” el objetivo general es determinar la secuencia de aparición de centros de

osificación en embriones y fetos bovinos mediante la técnica modificada de Dawson que se

realizo en etapas: fijación con formol al 5%, deshidratación con hidróxido de potasio y

etano al 70%, tinción con rojo de alizarina y diafanización con hidróxido de potasio diluido

en glicerina, los resultados fueron registrados en tablas que determinan estructuras ósea,

edad, longitud y tipo se osificación (ejemplo: clavícula, 37 días, longitud 2,2 cm y

osificación membranosa) (Mejía, 2013)

20

4.4. Antecedentes de investigación asociados al estudio en la Universidad

Nacional de Colombia.

Actualmente, no hay investigaciones en diafanización publicadas en el repositorio de la

biblioteca de la Universidad Nacional de Colombia que se encuentren aprobadas y

establecidas para optar por un título de posgrado.

21

5. MARCO CONCEPTUAL.

5.1. Diafanización.

La visualización del desarrollo óseo en animales o fetos humanos por diafanización es una

técnica conservación anatómica de los tejidos de un espécimen que se someten a una

despigmentación, con el fin de estudiar su anatomía del sistema óseo. Independientemente

del tipo de método, todos tienen el mismo fundamento, y siguen los siguientes pasos:

primero, se realiza una fijación del espécimen, con el fin de mantener las células con las

propiedades intactas. Esto se logra al estimular la formación de enlaces cruzados entre las

proteínas e inactivar enzimas celulares, para impedir que se presente una autolisis y por

tanto, una degradación post mortem de los fetos o del espécimen. En segunda instancia,

para poder visualizar y analizar el sistema óseo, se transparenta todo el tejido a excepción

del sistema óseo en desarrollo; a este proceso, por el cual una muestra se hace diáfana o

transparente, mediante técnicas que igualan los índices de refracción de la luz del interior

del órgano con el medio que lo contiene (Concha, 2006), se le conoce como diafanización,

sumergiéndolo en una solución de hidróxido de potasio (KOH), el cual es miscible, tanto en

alcohol como con el medio de inclusión, y a la vez es bastante corrosivo, ya que realiza una

reacción de óxido-reducción, deshidratando todos los tejidos. Por último, con el objetivo de

exponer los huesos en desarrollo, la edad del embrión y posibles anomalías óseas, los

centros de osificación se tiñen con un colorante específico, comúnmente rojo de alizarina.

5.1.1. Procedimientos de diafanización.

Actualmente, existen dos procedimientos diferentes de diafanizacion, la primera es la

“Técnica modificada de Dawson” que consiste en someter al espécimen a deshidratación

con alcohol al 70%, inmersión en hidróxido de potasio puro con aclaramiento en hidróxido

de amonio (NH4OH) junto con glicerina pero, según literatura y antecedentes de

investigación, no es muy satisfactoria la obtención de resultados por medio de la técnica

modificada de Dawson. Por tal razón, en este proyecto se utilizará la técnica de

diafanización por maceración, llamada Técnica de Dawson // Schultz

22

5.1.1.1. Técnica de maceración de Dawson // Schultz.

La técnica de Dawson/Schultz (Villegas, Quiroga, & Cleves, 2012) es mucho más sencilla

que la técnica de Dawson modificada; sin embargo, tarda más tiempo en generar resultados.

Es fácil obviar lo anterior debido a que no incluye los pasos de fijación, ni de dilución de

las grasas; pero la concentración del hidróxido de potasio es menor, por lo que la

diafanización toma más tiempo.

El espécimen se encuentra sumergido glicerina, y en una solución de KOH, en

concentraciones menores al 15%. En el transcurso de cuatro semanas aproximadamente, se

evidencian cambios notorios en la composición física y la transparentación del tejido. El

proceso, según el protocolo de la Universidad de los Andes es el siguiente:

1. Fijación de la muestra en formol 10%

2. Técnica de tinción de centros de osificación.

3. Diafanización siguiendo el esquema:

a) Solución de Hidróxido de potasio + H2O al 75 % (KOH 10%,) + 25% de

glicerina técnica. (5 días).

b) Solución de 65% de (KOH 10%)+ 35% de glicerina técnica

c) Solución de 50% de (KOH 2%)+ 50% de glicerina técnica

d) Solución de 100% de glicerina técnica. Si en esta etapa la muestra no se torna

transparente, se puede volver a los dos pasos anteriores. (Por lo general se

requiere cambiar varias veces la solución en glicerina pura hasta obtener una

transparencia adecuada).

En la universidad Santo Tomas de Chile (Concha, 2006) se desarrolla así:

1. Fijación de la muestra en formol 10%

2. Técnica de tinción de centros de osificación.

3. Diafanización siguiendo del esquema:

a. Solución de hidróxido de potasio de (KOH 2% o 3%). Esta solución se puede

renovar varias veces según el espesor de la muestra.

23

b. Solución de 75% de (KOH 2%)+25%glicerina de técnica.

c. Solución de 50% de (KOH 2%)+50%glicerina de técnica.

d. Solución de 25% de (KOH 2%)+75%glicerina de técnica.

e. Solución de glicerina técnica. Si en esta etapa la muestra no se torna

transparente, se pueden volver a los pasos C o D. Por lo general, se requiere

cambiar varias veces la solución en glicerina pura hasta obtener una

transparencia adecuada

5.1.1.2. Método de diafanización en peces (Mikolji, 2010)

1. Fijación con formol.

2. Deshidratación con alcohol etílico al 90% por 24h aproximadamente.

3. Coloración de cartílago con azul de alcian; se recomienda de horas hasta uno (1) o

dos (2) días.

4. Transparentación preparando una mezcla de KOH, (no especifica la concentración)

y peróxido de hidrogeno. El tiempo varia de una (1h) a varias horas según

resultados.

5. Digestión de la musculatura con tripsina en una base de tretraborato.

6. Coloración de tejido óseo con rojo de alizarina recomienda aproximadamente por

24h.

5.2. Reactivos a implementar en la investigación.

La información suministrada en esta investigación, en relación a reactivos químicos que se

utilizaron, fue tomada del Chemical Abstracts Service (CAS), una división de American

Chemical Society (ACS), que proporciona la mayor base de datos de evidencia revelada,

ordenada (numero CAS) públicamente sobre reactivos químicos, con el objeto de que

garantice la seguridad de la salud humana y el medio ambiente. Así, se genera por

elaboración propia un cuadro de seguridad de cada uno de los reactivos utilizados y se hace

una definición breve, concisa de los reactivos utilizados:

24

5.2.1 Hidróxido de potasio.

El hidróxido de potasio (KOH) es un sólido a temperatura ambiente y se fabrica a partir de

cloruro de potasio por procesos electroquímicos. El hidróxido de potasio puro es una

sustancia fuertemente alcalina (pH alto) que se disocia completamente en el agua en el ion

potasio (K +) e iones de hidróxido (OH-). La disolución en agua genera calor, por lo que

puede ocurrir una vigorosa reacción cuando al hidróxido de potasio se añade al agua y por

lo tanto, es sumamente corrosivo, por lo dicho anteriormente este reactivo se empleara para

tal fin en los tejidos durante la elaboración de las piezas anatómicas del presente proyecto

de investigación. (Euro Chlor, 2014).

5.2.2 Glicerina.

El glicerol o glicerina, también conocido como glicerina o 1, 2,3 propanotriol, es un

compuesto alcohólico con tres grupos –OH (hidroxilos). La palabra glicerol, procede del

griego Glykos, que significa dulce. Posee un aspecto de líquido viscoso, no tiene color,

pero si un característico olor, además de un sabor dulce. Además el glicerol es un

compuesto higroscópico, lo que quiere decir que tiene la capacidad de ceder o absorber la

humedad presente en el medio ambiente que lo rodea. Además es fácilmente soluble en

agua, y se descompone en ebullición, en la cual entra a una temperatura de 290ºC. Es un

compuesto líquido si se encuentra a temperatura ambiente (La Guía, 2010). Dentro de la

industria farmacéutica, la glicerina USP tiene un papel importante en la producción de los

siguientes medicamentos: anestésicos, pastillas, grageas, cápsulas, supositorios, productos

para combatir la infección de oído, jarabes (como excipiente), disolvente (para iodo, timol,

bromo, cloruro de mercurio, alcaloides, entre otros), antisépticos, inhibidores de cambios

enzimáticos en procesos de fermentación de cremas, ungüentos y pastas (QuimiNet, 2011).

5.2.3 Acetona

La acetona o propanona es un compuesto químico de fórmula química CH3(CO)CH3 del

grupo de las cetonas que se encuentra naturalmente en el medio ambiente a temperatura

ambiente, se presenta como un líquido incoloro de olor característico. Se evapora

25

fácilmente, es altamente inflamable y es soluble en agua. Es utilizada como disolvente

general más empleada en técnicas industriales debido a sus excelentes propiedades

disolventes de grasas, aceites, ceras, hules, plásticos, lacas y barnices. Se usa en la

manufactura de algunos explosivos, rayón, películas fotográficas, elaboración de

removedores de pinturas y barnices, purificación de parafinas, en la deshidratación y

endurecimiento de tejidos, en la extracción de algunos productos vegetales y animales y

como materia prima en una gran variedad de síntesis en química orgánica (IPCS INCHEM,

1999).

Tabla 1. Datos de seguridad de reactivos.

Reactivo(C

AS N° )

Peligro Recomendaciones de

manipulación

Clasificación

de riesgo

Almacenamien

to

Hidróxido

de potasio

(CASN°:

1310-58-3)

Corrosivo

e irritante

Guantes de protección,

mascarilla, protección

ocular y

concentraciones

superiores a 2% es

corrosivo.

Sustancia

peligrosa

Recipiente

cerrado no

expuesto al

ambiente y

temperatura

ambiente.

Rojo de

alizarina

(CAS

N°:58005)

Irritante

cutáneo,

ocular y

respiratori

o.

No ingerir o inhalar el

polvo, uso guantes de

protección, mascarilla y

protector ocular.

Sustancia no

peligrosa

Recipiente

cerrado no

expuesto al

ambiente y

temperatura

ambiente.

Azul de

alcian (CAS

N°: 33864-

99-2)

Sustancia

no

peligrosa

No se precisan medidas

especiales, en caso de

inhalación suministrar

aire fresco y en caso de

contacto con la piel

aclarar con abundante

Sustancia no

peligrosa

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